Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Les auteurs remercient Sherry Dunbar, Ph.D., MBA de Luminex Corporation (Austin, TX) pour son soutien à la recherche, et Matthew Silverman, Ph.D., Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL ; mattsilver@yahoo.com) pour son aide scientifique et rédactionnelle. Ce travail a été soutenu par des prix décernés à Pravin T. P. Kaumaya par les National Institutes of Health (R21 CA13508 et R01 CA84356) et à Imugene Ltd, Sydney, Australie (OSU 900600, GR110567 et GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya est consultant auprès d’Imugene, Ltd.

L’objectif de l’immunothérapie anticancéreuse liée aux points de contrôle est de perturber l’interaction entre les protéines des points de contrôle et leurs ligands importants dans la survie et la progression des tumeurs2. Ce groupe de recherche développe activement de nouveaux vaccins-1 et-L1 qui suscitent une réponse anticorps qui cible et interrompt le point de contrôle-1/-L1 3,8,13,14. Auparavant, deux variantes de tests immuno-enzymatiques (ELISA) ont été réalisées pour évaluer les effets des anticorps anti-PDL1-peptide sur l’inhibition de l’interaction recombinante PD1/-L114. (1) Dans le premier variant, rhPD-L1 a été enrobé sur une plaque de microtitration, puis la plaque a été incubée avec des anticorps dilués induits par le candidat vaccin anti-PDL1. L’inhibition de l’interaction-1/-L1 recombinante par les anticorps a ensuite été évaluée en ajoutant du rhPD-1 biotinylé et en quantifiant la liaison au rhPD-L1 immobilisé à l’aide d’un conjugué streptavidine-peroxydase de raifort et d’un substrat colorimétrique. C’est ce que nous avons défini comme le test de blocus direct. (2) Dans la deuxième variante, le-1 a été recouvert sur la plaque de microtitration. La rhPD-L1 biotinylée a été pré-incubée avec chacun des anticorps polyclonaux induits par le candidat anti-PLD1 dans des tubes de réaction séparés. Les mélanges rhPDL1/anti-PDL1 ont ensuite été ajoutés aux puits de plaques contenant du rhPD-1 immobilisé et laissés réagir. Tout rhPDL1 qui a réagi avec le rhPD-1 immobilisé en présence d’anticorps potentiellement bloquants induits par PDL1-Vaxx a été détecté lors de l’incubation ultérieure de la streptavidine-HRP et du substrat colorimétrique. C’est ce que nous avons défini comme le test de blocage inverse.
Le blocage inverse de l’interaction-1/-L1 recombinante par des anticorps anti-PDL1-peptide a montré une inhibition du signal (c’est-à-dire un blocage-1/-L1) d’une manière dépendante de la concentration d’anticorps14, tandis que l’approche de blocage direct n’a pas fourni de résultats cohérents (non illustré). Le test de blocage à double rapporteur à base de billes a été développé pour vérifier les résultats ELISA et pour étudier le blocage de l’interaction-1/-L1 dans une phase fluide, ce qui élimine les problèmes potentiels d’entrave stérique / disponibilité des épitopes de liaison associés à l’immobilisation des protéines recombinantes au fond des puits. L’analyse de la microsphère a été directement corrélée aux résultats du blocage ELISA à l’aide du test de blocage inverse (Figure 2). De plus, les immunoessais basés sur la fluorescence peuvent fournir une meilleure sensibilité du test et une plage dynamique élargie par rapport aux tests ELISA colorimétriques18, et de plus, le test à base de billes multiplexées permet la performance simultanée de deux immunoessais indépendants au sein d’une seule réaction. Le sulfo-NHS et l’EDC utilisés pour le couplage covalent des microsphères à rhPD-1 pourraient avoir conduit aux différences de performance observées entre les tests de blocage direct et de blocage inversé et aux différences de sensibilité observées entre les tests ELISA et les tests d’interaction-1/-L1 recombinants à base de billes Luminex. D’autres recherches aux niveaux chimique et moléculaire sont nécessaires pour étudier les mécanismes possibles responsables de ces différences.
Les tests ELISA14 et les tests à base de billes démontrent que les anticorps anti-PDL1 induits par PDL1-Vaxx peuvent inhiber la formation de complexes de points de contrôle PD1/-L1. Le PDL1-Vaxx à base de peptides induit avec succès des anticorps anti-PDL1 qui peuvent bloquer l’interaction-1/-L1. Cette approche pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement du cancer, comme le soutiennent les études précliniques chez l’animal 3,13,14. Les essais cliniques prévus détermineront l’efficacité du PDL1-Vaxx pour l’immunothérapie par point de contrôle et le contrôle de la maladie chez les patients atteints de cancer.

Dans les lymphocytes T, les lymphocytes B et les points de contrôle intracellulaires du système immunitaire, des voies de signalisation régulent les activités immunitaires. Certaines cellules cancéreuses se protègent des attaques immunitaires en stimulant des cibles de points de contrôle, ce qui inhibe la fonction immunitaire et favorise la survie et la prolifération néoplasiques. L’immunothérapie oncologique par inhibition des points de contrôle utilise des anticorps pour cibler et bloquer les points de contrôle de signalisation et, ainsi, restaurer les fonctions antinéoplasiques du système immunitaire 1,2,3. Les traitements anticancéreux les plus efficaces comprennent actuellement les anticorps monoclonaux nivolumab, qui cible la protéine de mort programmée 1 (-1)4, et l’atezolizumab, qui cible le ligand de mort programmée 1 (-L1)5. Cette approche s’est avérée très efficace dans le traitement des patients atteints de cancer. Cependant, l’utilité clinique des stratégies actuelles d’inhibition des points de contrôle est atténuée par les effets indésirables et la résistance au traitement, en particulier dans le traitement monogénique6. Une combinaison d’immunothérapie et de stratégies thérapeutiques plus efficaces avec une toxicité plus faible est nécessaire de toute urgence dans le traitement du cancer 1,3,6.
Au cours des 30 dernières années, le laboratoire du Dr Kaumaya a mis au point des vaccins contre le cancer peptidiques et des agents similaires aux peptides pour le traitement du cancer, dont certains font l’objet d’essais cliniques en cours 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Par exemple, B-Vaxx avec l’immunothérapie combinée HER-2 a montré des avantages pour les patients contre les tumeurs solides métastatiques et/ou récurrentes dans les essais cliniques12. Les derniers vaccins anticancéreux du laboratoire sont PD1-Vaxx 2,13 et PDL1-Vaxx14, qui ont montré de grands avantages dans les études précliniques, en particulier dans le traitement combiné. Le PD1-Vaxx a terminé des essais cliniques d’escalade de dose aux États-Unis et en Australie. Le PD1-Vaxx sera associé à l’atezolizumab dans le cadre de l’essai de phase 1b qui débutera en mai 2023. Ce rapport se concentre sur l’évaluation de la capacité des anticorps induits par PDL1-Vaxx à bloquer l’interaction-1/-L1.
Le vaccin contre le cancer PDL1-Vaxx est un nouveau vaccin à épitopes peptidiques à cellules B avec les acides aminés-L1 130-147 liés au peptide de fusion du virus de la rougeole (MVF) à cellules T de promiscuité via un liant peptidique GPSL. Des études précliniques ont montré que PDL1-Vaxx est hautement immunogène pour stimuler la production d’anticorps anticancéreux dans divers modèles animaux, prolonger la survie et réduire la charge tumorale14. Ces anticorps générés contre le peptide-L1 peuvent bloquer avec succès l’interaction PD1/-L1, entraînant ainsi une activité anti-néoplasique. Ce rapport présente un test qui analyse le blocage de la formation du complexe PD1/-L1 par les anticorps induits par PDL1-Vaxx à l’aide d’un format à base de billes magnétiques avec une lecture à double rapporteur sur un instrument de cytométrie en flux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

L’inhibition des récepteurs de point de contrôle (-1,-L1 et CTLA-4) avec des anticorps monoclonaux s’est avérée très bénéfique dans les essais cliniques pour le traitement des patients atteints de cancer et est devenue une approche de base dans l’immunothérapie moderne du cancer. Cependant, seul un sous-ensemble de patients répond à l’immunothérapie par anticorps monoclonaux de point de contrôle. Il est donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer. Un nouveau vaccin contre le cancer à épitope peptidique des cellules B PDL1 (ligand de mort programmée 1) a été développé, avec les acides aminés 130-147 liés au peptide MVF (protéine de fusion du virus de la rougeole à cellules T de promiscuité) via un linker GPSL. Des tests précliniques ont indiqué que ce vaccin PDL1 (PDL1-Vaxx) stimule efficacement les anticorps hautement immunogènes chez les animaux. Les animaux immunisés avec PDL1-Vaxx présentent une charge tumorale réduite et des taux de survie prolongés dans divers modèles de cancer animal. Les mécanismes d’action indiquent que les anticorps induits par le vaccin inhibent la prolifération des cellules tumorales, induisent l’apoptose et bloquent l’interaction-1/-L1. Ce manuscrit présente un test à base de billes magnétiques qui utilise un système d’analyse de flux à double rapporteur pour évaluer l’interaction-1/-L1 et son blocage par les anticorps anti-PDL1 élevés contre le PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Le test a permis de quantifier avec précision l’inhibition de l’interaction-1/-L1 par quatre anticorps polyclonaux uniques, générés contre les peptides vaccinaux rhPD-L1, qui sont explorés en tant qu’agents thérapeutiques potentiels contre le cancer. Le schéma de ce test est fourni à la figure 1. La quantité de rhPD-L1 biotinylée qui s’est liée aux billes conjuguées de rhPD-1 et l’inhibition de cette liaison par les quatre candidats anticorps induits par PLD1-Vaxx ont été mesurées dans le canal Reporter 1 à l’aide d’un réactif de détection de streptavidine-PE qui se lie directement à rhPD-L1 (Figure 2).
Les quatre anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide ont bloqué l’interaction rhPD-L1 avec-1 qui avait été immobilisée sur des microsphères à des degrés variables. Le pourcentage d’inhibition des différents anticorps peptidiques anti-PDL1 variait de 48 % à 74 % à la concentration maximale testée de 1 000 μg/mL. L’anticorps monoclonal témoin positif, l’atezolizumab, a permis d’obtenir un blocage de 92 % de l’interaction-1/-L1 à la concentration maximale testéede 14 μg/mL (Figure 2). Tous les anticorps expérimentaux PDL1-Vaxx ont montré une inhibition dépendante de la concentration de la liaison de rhPD-L1 aux billes conjuguées rhPD-1 par rapport au trastuzumab, l’anticorps témoin négatif qui ne devrait pas interagir avec le système-1/-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figure 2 : Blocage de l’interaction de rhPD-L1 avec rhPD-1 couplé à des billes magnétiques par des anticorps anti-PDL1-peptide, comme le montre un nouveau test immunologique à base de billes fluorescentes. La-1 humaine recombinante a été couplée à des microsphères magnétiques, et les billes ont ensuite été incubées avec du rhPD-L1 biotinylé qui avait été pré-incubé avec différents anticorps anti-PDL1-peptide. Un réactif de détection de la streptavidine-phycoérythrine a été utilisé pour se lier à la biotine et, ainsi, évaluer la quantité relative de rhPD-L1 disponible pour se lier à-1. Les anticorps polyclonaux élevés chez le lapin contre les vaccins peptidiques PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] et anti-PDL1[130]) ont été testés pour leur activité inhibitrice et ont montré un blocage de 48%-74% des interactions-1/-L1 recombinantes à la concentration la plus élevée testée. L’atezolizumab (un anticorps monoclonal anti-PDL1 différent) a été utilisé comme témoin positif. L’anticorps monoclonal commercial non apparenté trastuzumab (anti-HER2) a été utilisé comme témoin négatif. Cette figure est adaptée de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figure 3 : Liaison comparative de différents anticorps induits par PDL1-Vaxx à rhPD-L1 complexés à des billes magnétiques enrobées de rhPD1. Un anticorps de détection secondaire conjugué violet brillant 421 a été utilisé pour comparer la liaison de différents anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide de lapin à rhPD-L1 via des billes enrobées de rhPD-1. Le signal de fluorescence bleue BV421 a été enregistré dans le canal 2 du Reporter de l’instrument à double rapporteur ; ce signal est corrélé à l’efficacité relative de liaison des anticorps expérimentaux anti-PDL1-peptide. Le trastezumab (anti-HER2), un anticorps monoclonal qui cible un point de contrôle différent de celui de-1/-L1, a été utilisé comme témoin négatif. L’IMF représente l’intensité de fluorescence médiane moyenne des billes, qui a été mesurée dans des puits de réaction dupliqués par condition. Cette figure est adaptée de Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Les capacités relatives des quatre anticorps candidats expérimentaux induits par PDL1-Vaxx à se lier à rhPD-L1 ont été comparées à l’aide d’un système de détection séparé (IgG anti-lapin conjuguées BV421) qui a été évalué sur le deuxième canal rapporteur de l’instrument. Ces résultats indiquent que les quatre anticorps polyclonaux anti-PDL1-peptide se lient à rhPD-L1 d’une manière dépendante de la concentration14 (Figure 3). L’anticorps anti-PDL1(130) a montré le signal de liaison rhPDL1 le plus élevé des quatre candidats anticorps induits par PDL1-Vaxx.

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Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Les inhibiteurs de point de contrôle sont des cibles importantes dans le développement de thérapies pour la lutte contre le cancer. Ce rapport présente un nouveau vaccin anticancéreux à base de peptides PDL1, PDL1-Vaxx, qui induit la production d’anticorps polyclonaux neutralisants qui bloquent la formation du complexe-1/PDL1. Ce travail détaille également le développement et la mise à l’essai d’un test à base de billes fluorescentes pour l’analyse de cette activité.

Analyse de flux à double rapporteur à base de billes fluorescentes magnétiques du blocage de l’interaction-1/-L1 par les anticorps induits par le vaccin PDL1-VAXX

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Notre projet, dirigé par le professeur Pravin Kaumaya, se concentre sur le développement de vaccins peptidiques à épitopes de cellules B qui peuvent être utilisés pour renforcer le système immunitaire afin de mieux lutter contre le cancer. Nous pensons que les vaccins peptidiques ciblant les cibles de points de contrôle immunitaires peuvent même être combinés à d’autres thérapies pour améliorer les résultats pour les patients. Nous voulions tester la capacité de blocage de nos anticorps anti--L1 dans un test traditionnel de microbilles où la protéine-L1 recombinante humaine était liée à des billes MagPlex.Nous avons constaté qu’une fois que le-L1 était lié aux billes, celles-ci avaient une faible capacité de liaison pour son ligand-1. Cela nous a empêché d’utiliser cette voie de blocage des tests. Lorsque la liaison de la protéine aux billes inhibe la liaison au ligand ou aux anticorps, un prétraitement avec les anticorps de test en solution est une option, puis l’ajout ultérieur de billes enrobées de ligands au mélange de bloqueurs cibles.Leur interaction peut être examinée. Il peut s’agir d’une voie différente pour étudier la même interaction cible-ligand-liaison Nous avons développé les vaccins anticancéreux B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx et CTLA4-Vaxx. Ces vaccins ciblent HER2 et plusieurs marqueurs de points de contrôle immunitaires sont impliqués dans diverses formes de cancer.B-Vaxx et PD1-Vaxx font l’objet d’essais cliniques en cours en Australie et aux États-Unis. Nous espérons que nos vaccins aux points de contrôle immunitaires bénéficieront à un plus grand nombre de patients. Dans des expériences précédentes sur les microsphères, nous avons constaté que-1 interagissait bien avec son ligand-L1. Par conséquent, nous avons repensé le protocole, en préliant les anticorps peptidiques anti--L1 à la protéine-L1 biotinylée avant d’ajouter les billes MagPlex marquées-1.Cela nous a permis de tester notre capacité à bloquer l’interaction-1/-L1 de nos anticorps. Nous continuerons de nous concentrer sur les immunothérapies combinées qui surmontent la résistance aux traitements. Nous voulons également explorer des thérapies combinées plus efficaces qui inhibent mieux la croissance tumorale, préviennent les métastases et prolongent les taux de survie des patients.