Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Gli autori ringraziano Sherry Dunbar PhD, MBA di Luminex Corporation (Austin, TX) per il supporto alla ricerca e Matthew Silverman PhD di Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) per l'assistenza scientifica e di scrittura. Questo lavoro è stato sostenuto da premi a Pravin T. P. Kaumaya del National Institutes of Health (R21 CA13508 e R01 CA84356) e Imugene Ltd, Sydney, Australia (OSU 900600, GR110567 e GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya è un consulente di Imugene, Ltd.

Lo scopo dell'immunoterapia del cancro correlata al checkpoint è quello di interrompere l'interazione tra le proteine del checkpoint e i loro importanti ligandi nella sopravvivenza e nella progressione del tumore2. Questo gruppo di ricerca sta attivamente sviluppando nuovi vaccini PD-1 e PD-L1 che suscitano una risposta anticorpale che prende di mira e interrompe il checkpointPD-1/PD-L1 3,8,13,14. In precedenza, sono state eseguite due varianti di saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per valutare gli effetti degli anticorpi anti-peptide PDL1 sull'inibizione dell'interazione ricombinante PD1/PD-L114. (1) Nella prima variante, rhPD-L1 è stato rivestito su una piastra per microtitolazione, quindi la piastra è stata incubata con anticorpi diluiti indotti dal candidato vaccino anti-PDL1. L'inibizione dell'interazione ricombinante PD-1/PD-L1 da parte degli anticorpi è stata quindi valutata aggiungendo rhPD-1 biotinilato e quantificando il legame con rhPD-L1 immobilizzato utilizzando un coniugato streptavidina-perossidasi di rafano e un substrato colorimetrico. Lo abbiamo definito come il test del blocco diretto. (2) Nella seconda variante, PD-1 è stato rivestito sulla piastra per microtitolazione. rhPD-L1 biotinilato è stato pre-incubato con ciascuno degli anticorpi policlonali indotti dal candidato anti-PLD1 in provette di reazione separate. Le miscele rhPDL1/anti-PDL1 sono state quindi aggiunte ai pozzetti a piastre contenenti rhPD-1 immobilizzato e lasciate reagire. Qualsiasi rhPDL1 che ha reagito con rhPD-1 immobilizzato in presenza degli anticorpi indotti da PDL1-Vaxx potenzialmente bloccanti è stato rilevato con successiva streptavidina-HRP e incubazione colorimetrica del substrato. Lo abbiamo definito come il test di blocco inverso.
Il blocco inverso dell'interazione ricombinante PD-1/PD-L1 da parte degli anticorpi anti-PDL1-peptide ha mostrato l'inibizione del segnale (cioè il blocco PD-1/PD-L1) in modo dipendente dalla concentrazione dell'anticorpo14, mentre l'approccio del blocco diretto non ha fornito risultati coerenti (non mostrato). Il test di blocco dual-reporter basato su microsfere è stato sviluppato per verificare i risultati ELISA e per studiare il blocco dell'interazione PD-1/PD-L1 in una fase fluida, che elimina i potenziali problemi di ostacolo sterico/disponibilità dell'epitopo di legame associati all'immobilizzazione delle proteine ricombinanti sul fondo del pozzo. L'analisi delle microsfere è stata direttamente correlata ai risultati del blocco ELISA utilizzando il saggio di blocco inverso (Figura 2). Inoltre, i test immunologici basati sulla fluorescenza possono fornire una migliore sensibilità del test e un intervallo dinamico più ampio rispetto agli ELISA colorimetrici18 e, inoltre, il test basato su microsfere multiplexate consente l'esecuzione simultanea di due test immunologici indipendenti all'interno di una singola reazione. Il sulfo-NHS e l'EDC utilizzati per l'accoppiamento covalente delle microsfere a rhPD-1 potrebbero aver portato alle differenze di prestazioni osservate tra i saggi di blocco diretto e di blocco inverso e le differenze di sensibilità osservate tra i saggi di interazione PD-1/PD-L1 ricombinante basati su microsfere ELISA e Luminex. Ulteriori indagini a livello chimico e molecolare sono necessarie per studiare i possibili meccanismi responsabili di queste differenze.
Sia lo studio ELISA14 che i saggi basati su microsfere dimostrano che gli anticorpi anti-PDL1-PDL1 indotti da PDL1-Vaxx possono inibire la formazione del complesso del checkpoint PD1/PD-L1. Il PDL1-Vaxx a base di peptidi induce con successo anticorpi anti-PDL1 che possono bloccare l'interazione PD-1/PD-L1. Questo approccio può servire come nuova strategia terapeutica per il trattamento del cancro, come supportato da studi preclinici sugli animali 3,13,14. Gli studi clinici pianificati determineranno l'efficacia del PDL1-Vaxx per l'immunoterapia del checkpoint e il controllo della malattia nei pazienti oncologici.

Nelle cellule T, nelle cellule B e nei checkpoint intracellulari del sistema immunitario, le vie di segnalazione regolano le attività immunitarie. Alcune cellule tumorali si proteggono dall'attacco immunitario stimolando i bersagli dei checkpoint, che inibiscono la funzione immunitaria e promuovono la sopravvivenza e la proliferazione neoplastica. L'immunoterapia oncologica mediante inibizione dei checkpoint utilizza anticorpi per colpire e bloccare i checkpoint di segnalazione e, quindi, ripristinare le funzioni antineoplastiche del sistema immunitario 1,2,3. Le terapie antitumorali altamente efficaci includono attualmente gli anticorpi monoclonali nivolumab, che ha come bersaglio la proteina di morte programmata 1 (PD-1)4, e atezolizumab, che ha come bersaglio il ligando di morte programmata 1 (PD-L1)5. Questo approccio ha dimostrato un grande successo clinico nel trattamento dei pazienti oncologici. Tuttavia, l'utilità clinica delle attuali strategie di inibizione del checkpoint è mitigata dagli eventi avversi e dalla resistenza al trattamento, specialmente nella terapia con un singolo agente6. Una combinazione di immunoterapia e strategie terapeutiche più efficaci con una minore tossicità è urgentemente necessaria nel trattamento del cancro 1,3,6.
Negli ultimi 30 anni, il laboratorio del Dr. Kaumaya ha sviluppato vaccini contro il cancro peptidico e agenti correlati al mimo peptidico per la terapia del cancro, alcuni dei quali sono in studi clinici in corso 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Ad esempio, B-Vaxx con immunoterapia di combinazione HER-2 ha mostrato benefici per i pazienti contro tumori solidi metastatici e/o ricorrenti in studi clinici12. Gli ultimi vaccini antitumorali del laboratorio sono PD1-Vaxx 2,13 e PDL1-Vaxx14, che hanno mostrato grandi vantaggi negli studi preclinici, soprattutto nel trattamento combinato. Il PD1-Vaxx ha completato gli studi clinici di dose-escalation negli Stati Uniti e in Australia. Il PD1-Vaxx sarà combinato con atezolizumab nello studio di fase 1b che inizierà a maggio 2023. Questo rapporto si concentra sulla valutazione della capacità degli anticorpi indotti da PDL1-Vaxx di bloccare l'interazione PD-1/PD-L1.
Il vaccino contro il cancro PDL1-Vaxx è un nuovo vaccino epitopo del peptide delle cellule B con gli amminoacidi PD-L1 130-147 collegati al peptide di fusione del virus del morbillo delle cellule T promiscue (MVF) tramite un linker peptidico GPSL. Studi preclinici hanno dimostrato che PDL1-Vaxx è altamente immunogenico nello stimolare la produzione di anticorpi antitumorali in vari modelli animali, prolunga la sopravvivenza e riduce il carico tumorale14. Questi anticorpi generati contro il peptide PD-L1 possono bloccare con successo l'interazione PD1/PD-L1, determinando così un'attività anti-neoplastica. Questo rapporto introduce un test che analizza il blocco della formazione del complesso PD1/PD-L1 da parte degli anticorpi indotti da PDL1-Vaxx utilizzando un formato basato su microsfere magnetiche con una lettura a doppio reporter su uno strumento di citometria a flusso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

L'inibizione dei recettori del checkpoint (PD-1, PD-L1 e CTLA-4) con anticorpi monoclonali ha mostrato grandi benefici negli studi clinici per il trattamento dei pazienti oncologici ed è diventata un approccio fondamentale nella moderna immunoterapia del cancro. Tuttavia, solo un sottogruppo di pazienti risponde all'immunoterapia con anticorpi monoclonali checkpoint. Pertanto, è urgente sviluppare nuove strategie terapeutiche contro il cancro. È stato sviluppato un nuovo vaccino contro il cancro dell'epitopo del peptide a cellule B PDL1 (ligando di morte programmata 1), con gli amminoacidi 130-147 legati al peptide MVF (proteina di fusione del virus del morbillo a cellule T "promiscue") tramite un linker GPSL. I test preclinici hanno indicato che questo vaccino PDL1 (PDL1-Vaxx) stimola efficacemente gli anticorpi altamente immunogenici negli animali. Gli animali immunizzati con PDL1-Vaxx mostrano una riduzione del carico tumorale e tassi di sopravvivenza estesi in vari modelli di cancro animale. I meccanismi d'azione indicano che gli anticorpi inibiti dal vaccino inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali, inducono l'apoptosi e bloccano l'interazione PD-1/PD-L1. Questo manoscritto introduce un saggio basato su biglie magnetiche che utilizza un sistema di analisi del flusso a doppio reporter per valutare l'interazione PD-1/PD-L1 e il suo blocco da parte degli anticorpi anti-PDL1 sollevati contro il PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Il test è stato in grado di quantificare con precisione l'inibizione dell'interazione PD-1/PD-L1 da parte di quattro anticorpi policlonali unici, generati contro i peptidi del vaccino rhPD-L1, che sono in fase di studio come potenziali agenti terapeutici del cancro. Lo schema di questo test è riportato nella Figura 1. La quantità di rhPD-L1 biotinilato che si lega alle perle coniugate con rhPD-1 e l'inibizione di questo legame da parte dei quattro candidati anticorpi indotti da PLD1-Vaxx sono stati misurati nel Canale Reporter 1 utilizzando un reagente di rilevamento streptavidina-PE che lega direttamente rhPD-L1 (Figura 2).
Tutti e quattro gli anticorpi policlonali anti-PDL1-peptide hanno bloccato l'interazione rhPD-L1 con PD-1 che era stata immobilizzata su microsfere in misura variabile. La percentuale di inibizione dei diversi anticorpi anti-peptide PDL1 variava dal 48% al 74% alla concentrazione massima testata di 1.000 μg/mL. L'anticorpo monoclonale di controllo positivo atezolizumab ha raggiunto un blocco del 92% dell'interazione PD-1/PD-L1 alla concentrazione massima testata14 di 4 μg/mL (Figura 2). Tutti gli anticorpi sperimentali PDL1-Vaxx hanno mostrato un'inibizione concentrazione-dipendente del legame di rhPD-L1 alle perle coniugate rhPD-1 rispetto a trastuzumab, l'anticorpo di controllo negativo che non si prevedeva interagisse con il sistema PD-1/PD-L1.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figura 2: Blocco dell'interazione di rhPD-L1 con rhPD-1 accoppiato a biglie magnetiche da parte di anticorpi anti-peptide PDL1, come mostrato da un nuovo test immunologico basato su microsfere fluorescenti. PD-1 umano ricombinante è stato accoppiato a microsfere magnetiche e le perle sono state quindi incubate con rhPD-L1 biotinilato che era stato pre-incubato con diversi anticorpi anti-peptide PDL1. È stato utilizzato un reagente per la rilevazione di streptavidina-ficoeritrina per legare la biotina e, quindi, valutare la quantità relativa di rhPD-L1 disponibile per legarsi a PD-1. Gli anticorpi policlonali allevati nei conigli contro i vaccini peptidici PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] e anti-PDL1[130]) sono stati testati per l'attività inibitoria e hanno mostrato un blocco del 48%-74% delle interazioni ricombinanti PD-1/PD-L1 alla massima concentrazione testata. Atezolizumab (un diverso anticorpo monoclonale anti-PDL1) è stato utilizzato come controllo positivo. L'anticorpo monoclonale commerciale trastuzumab (anti-HER2) non correlato è stato utilizzato come controllo negativo. Questa figura è adattata da Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figura 3: Legame comparativo di diversi anticorpi indotti da PDL1-Vaxx a rhPD-L1 complessati con microsfere magnetiche rivestite con rhPD1. L'anticorpo di rilevamento secondario coniugato viola brillante 421 è stato utilizzato per confrontare il legame di diversi anticorpi policlonali anti-PDL1-peptide di coniglio a rhPD-L1 tramite perline rivestite di rhPD-1. Il segnale di fluorescenza blu BV421 è stato registrato nel Canale Reporter 2 dello strumento a doppio reporter; questo segnale è correlato con l'efficienza di legame relativa degli anticorpi sperimentali anti-PDL1-peptide. Trastezumab (anti-HER2), un anticorpo monoclonale che ha come bersaglio un checkpoint diverso da PD-1/PD-L1, è stato utilizzato come controllo negativo. L'MFI rappresenta l'intensità media di fluorescenza delle microsfere, misurata in pozzetti di reazione duplicati per condizione. Questa figura è adattata da Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le capacità relative dei quattro anticorpi candidati sperimentali indotti da PDL1-Vaxx di legare rhPD-L1 sono state confrontate utilizzando un sistema di rilevamento separato (IgG anti-coniglio coniugato con BV421) che è stato valutato sul secondo canale reporter dello strumento. Questi risultati hanno indicato che tutti e quattro gli anticorpi policlonali anti-PDL1-peptide si legano a rhPD-L1 in modo concentrazione-dipendente14 (Figura 3). L'anticorpo anti-PDL1(130) ha mostrato il più alto segnale di legame rhPDL1 tra i quattro candidati anticorpi indotti da PDL1-Vaxx.

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Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Gli inibitori del checkpoint sono obiettivi importanti nello sviluppo di terapie per la lotta contro il cancro. Questo rapporto introduce un nuovo vaccino contro il cancro a base di peptide PDL1, PDL1-Vaxx, che induce la produzione di anticorpi policlonali neutralizzanti che bloccano la formazione del complesso PD-1/PDL1. Questo lavoro descrive anche in dettaglio lo sviluppo e il test di un saggio basato su microsfere fluorescenti per l'analisi di questa attività.

Analisi del flusso a doppio reporter basata su biglie fluorescenti magnetiche del blocco anticorpale indotto dal peptide PDL1-Vaxx dell'interazione PD-1/PD-L1

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Il nostro progetto, guidato dal professor Pravin Kaumaya, si concentra sullo sviluppo di vaccini a base di peptidi epitopi a cellule B che possono essere utilizzati per rafforzare il sistema immunitario e combattere meglio il cancro. Riteniamo che i vaccini peptidici mirati ai checkpoint immunitari possano anche essere combinati con altre terapie per migliorare i risultati dei pazienti. Volevamo testare la capacità di blocco dei nostri anticorpi anti PD-L1 in un test tradizionale con microsfere in cui la proteina PD-L1 ricombinante umana era legata a microsfere MagPlex.Abbiamo scoperto che, una volta che il PD-L1 è stato legato alle perle, queste hanno una bassa capacità di legame per il suo ligando PD-1. Questo ci ha impedito di utilizzare questa strada di blocco dei test. Quando il legame della proteina alle perle inibisce il legame al ligando o agli anticorpi, è possibile pretrattare con gli anticorpi del test in soluzione, aggiungendo successivamente le microsfere rivestite di ligando alla miscela di bloccanti target.La loro interazione può essere esaminata. Questo potrebbe essere un percorso diverso per studiare la stessa interazione bersaglio-ligando-legame Abbiamo sviluppato vaccini antitumorali B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx e CTLA4-Vaxx. Questi vaccini hanno come bersaglio HER2 e diversi marcatori del checkpoint immunitario sono coinvolti in varie forme di cancro.B-Vaxx e PD1-Vaxx sono in fase di sperimentazione clinica in Australia e negli Stati Uniti. Speriamo che i nostri vaccini contro il checkpoint immunitario vadano a beneficio di un maggior numero di pazienti. In precedenti esperimenti con microsfere, abbiamo scoperto che PD-1 interagiva bene con il suo ligando PD-L1. Pertanto, abbiamo riprogettato il protocollo, prelegando gli anticorpi del peptide anti-PD-L1 alla proteina PD-L1 biotinilata prima di aggiungere le perle MagPlex marcate con PD-1.Questo ci ha permesso di testare i nostri anticorpi per la loro capacità di bloccare l'interazione PD-1/PD-L1. Continueremo a concentrarci sulle immunoterapie combinate che superano la resistenza al trattamento. Vogliamo anche esplorare terapie combinate più efficaci che inibiscano meglio la crescita del tumore, prevengano le metastasi e prolunghino i tassi di sopravvivenza dei pazienti.