Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

저자는 연구 지원을 해준 Luminex Corporation(텍사스 주 오스틴)의 MBA인 Sherry Dunbar 박사와 과학 및 집필 지원을 제공한 Biomedical Publishing Solutions(플로리다주 파나마 시티, mattsilver@yahoo.com)의 Matthew Silverman 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R21 CA13508 및 R01 CA84356)과 호주 시드니의 Imugene Ltd(OSU 900600, GR110567 및 GR124326)의 Pravin T. P. Kaumaya에게 수여되었습니다.

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya는 Imugene, Ltd.의 컨설턴트입니다.

관문관련 암 면역요법의 목적은 종양 생존 및 진행에서 관문단백질과 중요한 리간드 사이의 상호작용을 방해하는 것이다2. 이 연구 그룹은 PD-1/PD-L1 체크포인트 3,8,13,14를 표적으로 하여 차단하는 항체 반응을 유도하는 새로운 PD-1 및 PD-L1 백신을 적극적으로 개발하고 있습니다. 이전에, 재조합 PD1/PD-L1 상호작용의 억제에 대한 항-PDL1-펩티드 항체의 효과를 평가하기 위해 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)의 두 가지 변형을 수행하였다14. (1) 첫 번째 변이체에서 rhPD-L1을 마이크로타이터 플레이트에 코팅한 다음 플레이트에 희석된 항-PDL1 백신 후보 유도 항체로 배양했습니다. 그런 다음 비오틴화된 rhPD-1을 첨가하고 스트렙타비딘-고추냉이 과산화효소 접합체와 비색 기질을 사용하여 고정화된 rhPD-L1에 대한 결합을 정량화하여 항체에 의한 재조합 PD-1/PD-L1 상호작용의 억제를 평가했습니다. 우리는 이것을 직접 봉쇄 분석으로 정의했습니다. (2) 두 번째 변형체에서, PD-1은 마이크로타이터 플레이트에 코팅되었다. 비오틴화된 rhPD-L1은 각각의 항-PLD1 후보 유도 다클론 항체와 함께 별도의 반응 튜브에서 사전 배양되었습니다. 그런 다음 rhPDL1/anti-PDL1 혼합물을 고정화된 rhPD-1을 함유하는 플레이트 웰에 첨가하고 반응시켰습니다. 잠재적으로 차단되는 PDL1-Vaxx 유도 항체의 존재 하에서 고정화된 rhPD-1과 반응한 모든 rhPDL1은 후속 스트렙타비딘-HRP 및 비색 기질 배양을 통해 검출되었습니다. 우리는 이것을 역 봉쇄 분석으로 정의했습니다.
항-PDL1-펩티드 항체에 의한 재조합 PD-1/PD-L1 상호작용의 역 봉쇄는 항체 농도-의존적 방식으로 신호의 억제(즉, PD-1/PD-L1 차단)를 나타냈지만,14 직접 봉쇄 접근법은 일관된 결과를 제공하지 않았다(도시되지 않음). 비드 기반 듀얼 리포터 차단 분석은 ELISA 결과를 검증하고 유동상에서 PD-1/PD-L1 상호 작용의 차단을 조사하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 웰 바닥에서 재조합 단백질을 고정화하는 것과 관련된 잠재적인 입체 장애/결합 에피토프 가용성 문제를 제거합니다. 마이크로스피어 분석은 역 봉쇄 분석을 사용한 ELISA 차단 결과와 직접적인 상관관계가 있었습니다(그림 2). 또한 형광 기반 면역분석법은 비색 ELISA18에 비해 향상된 분석 감도와 확장된 동적 범위를 제공할 수 있으며, 또한 다중 비드 기반 분석은 단일 반응 내에서 두 개의 독립적인 면역분석을 동시에 수행할 수 있습니다. rhPD-1에 대한 마이크로스피어의 공유 결합에 사용된 sulfo-NHS 및 EDC는 직접 봉쇄 분석과 역 차단 분석 간에 성능 차이가 나타나고 ELISA와 Luminex 비드 기반 재조합 PD-1/PD-L1 상호 작용 분석 간에 관찰된 감도 차이를 유발할 수 있습니다. 이러한 차이의 원인이 될 수 있는 메커니즘을 연구하기 위해 추가적인 화학 및 분자 수준 조사가 필요합니다.
ELISA14와 비드 기반 분석은 모두 PDL1-Vaxx 유도 항-PDL1 항체가 PD1/PD-L1 체크포인트 복합체 형성을 억제할 수 있음을 보여줍니다. 펩타이드 기반 PDL1-Vaxx는 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단할 수 있는 항-PDL1 항체를 성공적으로 유도합니다. 이 접근법은 전임상 동물 연구 3,13,14에 의해 뒷받침되는 암 치료를 위한 새로운 치료 전략이 될 수 있습니다. 계획된 임상시험은 암 환자의 관문 면역 요법 및 질병 통제에 대한 PDL1-Vaxx의 효능을 결정할 것입니다.

면역 체계의 T 세포, B 세포 및 세포 내 체크포인트에서 신호 전달 경로는 면역 활동을 조절합니다. 일부 암세포는 면역 기능을 억제하고 종양의 생존과 증식을 촉진하는 체크포인트 표적을 자극하여 면역 공격으로부터 스스로를 보호합니다. 관문 억제에 의한 종양학적 면역요법은 항체를 사용하여 신호 관문을 표적으로 삼고 차단하여 면역 체계의 항종양 기능을 회복시킵니다 1,2,3. 현재 매우 효과적인 항암 치료법으로는 프로그램된 죽음 단백질 1(PD-1)4을 표적으로 하는 단일클론 항체인 니볼루맙(nivolumab)과 프로그램된 죽음 리간드 1(PD-L1)을 표적으로 하는 아테졸리주맙(atezolizumab)이 있습니다5. 이 접근법은 암 환자 치료에 큰 임상적 성공을 거두었습니다. 그러나 현재 체크포인트 억제 전략의 임상적 유용성은 특히 단일 제제 요법에서 부작용 및 치료 내성에 의해 완화된다6. 면역 요법과 독성이 낮은 보다 효과적인 치료 전략의 조합이 암 치료에 시급히 필요하다 1,3,6.
지난 30년 동안 카우마야 박사의 연구실은 암 치료를 위한 펩타이드 암 백신과 펩타이드 모방 관련 제제를 개발해 왔으며, 그 중 일부는 임상 시험이 진행 중입니다 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . 예를 들어, HER-2 병용 면역요법을 병용한 B-Vaxx는 임상시험에서 전이성 및/또는 재발성 고형 종양에 대한 환자 이점을 보여주었다12. 이 연구소의 최신 암 백신은 PD1-Vaxx 2,13 및 PDL1-Vaxx14로, 전임상 연구, 특히 병용 치료에서 큰 이점을 보여주었습니다. PD1-Vaxx는 미국과 호주에서 용량 증량 임상시험을 완료했다. PD1-Vaxx는 2023년 5월에 시작되는 임상 1b상 시험에서 아테졸리주맙과 병용될 예정이다. 이 보고서는 PDL1/PD-L1 상호작용을 차단하는 PDL1-Vaxx 유도 항체의 능력을 평가하는 데 중점을 둡니다.
PDL1-Vaxx 암 백신은 GPSL 펩타이드 링커를 통해 무차별 T 세포 홍역 바이러스 융합(MVF) 펩타이드에 연결된 PD-L1 아미노산 130-147을 함유한 새로운 B세포 펩타이드 에피토프 백신입니다. 전임상 연구에 따르면 PDL1-Vaxx는 다양한 동물 모델에서 항암 항체 생성을 자극하는 면역원성이 높고, 생존 기간을 연장하며, 종양 부담을 감소시키는 것으로 나타났다14. PD-L1 펩타이드에 대해 생성된 이러한 항체는 PD1/PD-L1 상호작용을 성공적으로 차단하여 항종양 활성을 유발할 수 있습니다. 이 보고서는 유세포 분석 장비에서 이중 리포터 판독과 함께 마그네틱 비드 기반 형식을 사용하여 PDL1-Vaxx 유도 항체에 의한 PD1/PD-L1 복합체 형성의 차단을 분석하는 분석을 소개합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

단클론 항체로 관문 수용체(PD-1, PD-L1 및 CTLA-4)를 억제하는 것은 암 환자 치료를 위한 임상시험에서 큰 이점을 보여주었으며 현대 암 면역 요법의 주요 접근법이 되었습니다. 그러나 일부 환자만이 체크포인트 단일클론 항체 면역요법에 반응합니다. 따라서 암에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 것이 시급합니다. 새로운 B세포 펩타이드 에피토프 PDL1(Programmed Death Ligand 1) 암 백신이 개발되었으며, 아미노산 130-147은 GPSL 링커를 통해 MVF 펩타이드("난잡한" T 세포 홍역 바이러스 융합 단백질)에 연결됩니다. 전임상 시험에서 이 PDL1 백신(PDL1-Vaxx)은 동물에서 높은 면역원성 항체를 효과적으로 자극하는 것으로 나타났습니다. PDL1-Vaxx로 면역된 동물은 다양한 동물 암 모델에서 종양 부담이 감소하고 생존율이 연장되었습니다. 작용 기전은 백신 유도 항체가 종양 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도하며 PD-1/PD-L1 상호 작용을 차단한다는 것을 나타냅니다. 이 원고는 PD-1/PD-L1 상호 작용 및 PDL1-Vaxx에 대해 제기된 항 PDL1 항체에 의한 차단을 평가하기 위해 이중 리포터 흐름 분석 시스템을 사용하는 마그네틱 비드 기반 분석을 소개합니다.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

이 분석은 잠재적인 암 치료제로 연구되고 있는 rhPD-L1 백신 펩타이드에 대해 생성된 4개의 고유한 다클론 항체에 의한 PD-1/PD-L1 상호 작용의 억제를 정밀하게 정량화할 수 있었습니다. 이 분석의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. rhPD-1 접합 비드에 결합하는 비오틴화된 rhPD-L1의 양과 4개의 PLD1-Vaxx 유도 항체 후보에 의한 이 결합의 억제는 rhPD-L1에 직접 결합하는 스트렙타비딘-PE 검출 시약을 사용하여 Reporter Channel 1에서 측정되었습니다(그림 2).
4개의 다클론 항-PDL1-펩타이드 항체 모두 미세구체에 고정된 PD-1과 rhPD-L1의 상호작용을 다양한 범위로 차단했습니다. 다양한 항-PDL1 펩타이드 항체의 억제율은 최대 테스트 농도인 1,000μg/mL에서 48%에서 74% 사이였습니다. 양성 대조군 단클론 항체 아테졸리주맙은 4μg/mL의 최대 테스트 농도14 에서 PD-1/PD-L1 상호작용의 92% 차단을 달성했습니다(그림 2). 모든 실험적 PDL1-Vaxx 항체는 PD-1/PD-L1 시스템과 상호작용할 것으로 예상되지 않은 음성 대조 항체인 트라스투주맙(trastuzumab)과 비교하여 rhPD-1 접합 비드에 대한 rhPD-L1 결합의 농도 의존적 억제를 보여주었습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> 그림 2: 새로운 형광 비드 기반 면역분석법으로 나타난 항-PDL1-펩타이드 항체에 의한 rhPD-1과 rhPD-1의 상호작용 차단. 재조합 인간 PD-1을 자기 마이크로스피어에 결합한 다음 비드를 다른 항-PDL1-펩타이드 항체와 함께 사전 배양한 비오틴화된 rhPD-L1로 배양했습니다. 스트렙타비딘-피코에리트린 검출 시약을 사용하여 비오틴에 결합하고, 따라서 PD-1에 결합할 수 있는 rhPD-L1의 상대적 양을 평가했습니다. PDL1 펩타이드 백신(항-PDL1[36], 항-PDL1[50], 항-PDL1[95], 항-PDL1[130])에 대해 토끼에서 키운 다클론 항체는 억제 활성을 테스트했으며 테스트된 최고 농도에서 재조합 PD-1/PD-L1 상호 작용의 48%-74% 차단을 보여주었습니다. 아테졸리주맙(Atezolizumab, 다른 항-PDL1 단일클론항체)을 양성 대조군으로 사용하였다. 관련 없는 상업용 단클론 항체 트라스투주맙(trastuzumab, anti-HER2)을 음성 대조군으로 사용하였다. 이 그림은 Guo et al.14에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> 그림 3: rhPD1 코팅된 마그네틱 비드에 복합화된 rhPD-L1에 대한 다양한 PDL1-Vaxx 유도 항체의 결합 비교. 브릴리언트 바이올렛 421 접합 2차 검출 항체를 사용하여 rhPD-1 코팅 비드를 통해 다양한 토끼 다클론 항-PDL1-펩타이드 항체와 rhPD-L1의 결합을 비교했습니다. BV421 청색 형광 신호는 이중 리포터 기기의 리포터 채널 2에 기록되었습니다. 이 신호는 실험용 항-PDL1-펩타이드 항체의 상대적 결합 효율과 상관관계가 있습니다. PD-1/PD-L1과 다른 체크포인트를 표적으로 하는 단일클론항체인 트라스테주맙(trastezumab, anti-HER2)을 음성 대조군으로 사용했다. MFI는 조건별 중복 반응 웰에서 측정된 평균 비드 중앙값 형광 강도를 나타냅니다. 이 그림은 Guo et al.14에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
rhPD-L1과 결합하는 4개의 실험적 PDL1-Vaxx 유도 후보 항체의 상대적 능력은 기기의 두 번째 리포터 채널에서 평가된 별도의 검출 시스템(BV421 접합 항 토끼 IgG)을 사용하여 비교되었습니다. 이러한 결과는 4개의 다클론 항-PDL1-펩타이드 항체 모두가 농도 의존적 방식으로 rhPD-L1에 결합함을 나타냈다14 (그림 3). 항 PDL1(130) 항체는 PDL1-Vaxx 유도 항체 후보 4개 중 가장 높은 rhPDL1 결합 신호를 보였다.

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Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

체크포인트 억제제는 암과의 싸움을 위한 치료법을 개발하는 데 중요한 표적입니다. 이 보고서는 PD-1/PDL1 복합체 형성을 차단하는 중화 다클론 항체 생성을 유도하는 새로운 PDL1 펩타이드 기반 암 백신인 PDL1-Vaxx를 소개합니다. 이 작업은 또한 이 활성을 분석하기 위한 형광 비드 기반 분석법의 개발 및 테스트에 대해 자세히 설명합니다.

PD-1/PD-L1 상호 작용의 PDL1-Vaxx 펩타이드 백신 유도 항체 봉쇄의 자기 형광 비드 기반 이중 리포터 흐름 분석

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Pravin Kaumaya 교수가 이끄는 우리의 프로젝트는 암에 대항하여 더 잘 싸우기 위해 면역 체계를 강화하는 데 사용할 수 있는 B 세포 에피토프 펩타이드 백신을 개발하는 데 중점을 두고 있습니다. 면역관문 표적을 표적으로 하는 펩타이드 백신은 환자의 예후를 개선하기 위해 다른 치료법과 결합될 수도 있다고 생각합니다. 우리는 인간 재조합 PD-L1 단백질이 MagPlex 비드에 결합된 전통적인 마이크로비드 분석에서 항 PD-L1 항체의 차단 능력을 테스트하고자 했습니다.PD-L1이 비드에 결합되면 PD-1 리간드에 대한 결합 능력이 낮다는 것을 발견했습니다. 이로 인해 이러한 테스트 차단 방법을 사용할 수 없었습니다. 단백질을 비드에 결합하는 것이 리간드 또는 항체에 대한 결합을 억제하는 경우, 용액에서 테스트 항체로 전처리한 후 나중에 리간드 코팅 비드를 표적 차단제 혼합물에 추가하는 것이 옵션입니다.그들의 상호 작용을 조사할 수 있습니다. 이는 동일한 표적-리간드-결합 상호작용을 연구하는 다른 경로일 수 있습니다 당사는 B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx 및 CTLA4-Vaxx 암 백신을 개발했습니다. 이 백신은 HER2를 표적으로 하며 여러 면역 관문 마커가 다양한 형태의 암에 관여합니다.B-Vaxx와 PD1-Vaxx는 호주와 미국에서 임상시험이 진행 중이다. 우리의 면역관문 백신이 더 많은 환자에게 도움이 되기를 바랍니다. 이전 마이크로스피어 실험에서 PD-1이 리간드 PD-L1과 잘 상호 작용한다는 것을 발견했습니다. 따라서 PD-1 태그가 부착된 MagPlex 비드를 추가하기 전에 항-PD-L1 펩타이드 항체를 비오틴화된 PD-L1 단백질에 사전 결합하여 프로토콜을 재설계했습니다.이를 통해 항체가 PD-1/PD-L1 상호작용을 차단하는 능력을 테스트할 수 있었습니다. 앞으로도 치료 내성을 극복하는 병용 면역항암제에 주력할 것입니다. 또한 종양 성장을 더 잘 억제하고, 전이를 방지하며, 환자의 생존율을 연장할 수 있는 보다 효과적인 병용 요법을 모색하고자 합니다.