Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Forfatterne takker Sherry Dunbar PhD, MBA of Luminex Corporation (Austin, TX) for forskningsstøtte og Matthew Silverman PhD of Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) for vitenskapelig og skriftlig assistanse. Dette arbeidet ble støttet av priser til Pravin T. P. Kaumaya fra National Institutes of Health (R21 CA13508 og R01 CA84356) og Imugene Ltd, Sydney, Australia (OSU 900600, GR110567 og GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya er konsulent for Imugene, Ltd.

Hensikten med sjekkpunktrelatert kreftimmunterapi er å forstyrre samspillet mellom sjekkpunktproteiner og deres viktige ligander i tumoroverlevelse og progresjon2. Denne forskningsgruppen utvikler aktivt nye PD-1- og PD-L1-vaksiner som fremkaller en antistoffrespons som retter seg mot og avbryter PD-1/PD-L1-kontrollpunktet 3,8,13,14. Tidligere ble to variasjoner av enzymbundne immunosorbentanalyser (ELISA) utført for å evaluere effekten av anti-PDL1-peptidantistoffer på hemming av den rekombinante PD1 / PD-L1-interaksjonen14. (1) I den første varianten ble rhPD-L1 belagt på en mikrotiterplate, og deretter ble platen inkubert med fortynnede anti-PDL1-vaksinekandidatinduserte antistoffer. Inhiberingen av den rekombinante PD-1 / PD-L1-interaksjonen av antistoffene ble deretter evaluert ved å tilsette biotinylert rhPD-1 og kvantifisere bindingen til det immobiliserte rhPD-L1 ved bruk av et streptapavidin-pepperrotperoksidasekonjugat og et kolorimetrisk substrat. Vi definerte dette som den direkte blokadeanalysen. (2) I den andre varianten ble PD-1 belagt på mikrotiterplaten. Biotinylert rhPD-L1 ble pre-inkubert med hvert av de anti-PLD1 kandidatinduserte polyklonale antistoffene i separate reaksjonsrør. RhPDL1 / anti-PDL1-blandingene ble deretter tilsatt til platebrønnene som inneholdt immobilisert rhPD-1 og fikk lov til å reagere. Enhver rhPDL1 som reagerte med den immobiliserte rhPD-1 i nærvær av de potensielt blokkerende PDL1-Vaxx-induserte antistoffene ble detektert med påfølgende streptapavidin-HRP og kolorimetrisk substratinkubasjon. Vi definerte dette som omvendt blokadeanalyse.
Den omvendte blokaden av den rekombinante PD-1/PD-L1-interaksjonen med anti-PDL1-peptidantistoffer viste hemming av signalet (dvs. PD-1/PD-L1-blokade) på en antistoffkonsentrasjonsavhengig måte14, mens den direkte blokadetilnærmingen ikke ga konsistente resultater (ikke vist). Den perlebaserte dual-reporter-blokadeanalysen ble utviklet for å verifisere ELISA-resultatene og for å undersøke blokaden av PD-1 / PD-L1-interaksjonen i en væskefase, noe som eliminerer potensielle steriske hindringer / bindende epitoptilgjengelighetsproblemer forbundet med immobilisering av rekombinante proteiner på brønnbunner. Mikrosfæreanalysen var direkte korrelert med ELISA-blokkeringsresultatene ved bruk av omvendt blokadeanalyse (figur 2). I tillegg kan fluorescensbaserte immunoassays gi forbedret analysefølsomhet og et utvidet dynamisk område sammenlignet med kolorimetriske ELISAs18, og videre tillater den multipleksede perlebaserte analysen samtidig ytelse av to uavhengige immunoassays i en enkelt reaksjon. Sulfo-NHS og EDC brukt for kovalent kobling av mikrosfærene til rhPD-1 kan ha ført til ytelsesforskjellene sett mellom direkte blokade og reverserte blokadeanalyser og de observerte forskjellene i følsomhet mellom ELISA og Luminex perlebaserte rekombinante PD-1 / PD-L1 interaksjonsanalyser. Videre kjemisk og molekylær undersøkelse er berettiget til å studere mulige mekanismer som er ansvarlige for disse forskjellene.
Både ELISA14 og de perlebaserte analysene viser at PDL1-Vaxx-induserte anti-PDL1-antistoffer kan hemme PD1/PD-L1 sjekkpunktkompleksdannelse. Den peptidbaserte PDL1-Vaxx induserer vellykket anti-PDL1-antistoffer som kan blokkere PD-1 / PD-L1-interaksjonen. Denne tilnærmingen kan tjene som en ny terapeutisk strategi for behandling av kreft, som støttet av prekliniske dyreforsøk 3,13,14. Planlagte kliniske studier vil bestemme effekten av PDL1-Vaxx for sjekkpunktimmunterapi og sykdomskontroll hos kreftpasienter.

I immunsystemets T-celler, B-celler og intracellulære sjekkpunkter regulerer signalveier immunaktiviteter. Noen kreftceller beskytter seg mot immunangrep ved å stimulere sjekkpunktmål, som hemmer immunfunksjonen og fremmer neoplastisk overlevelse og spredning. Onkologisk immunterapi ved kontrollpunkthemming bruker antistoffer til å målrette og blokkere signalkontrollpunktene og dermed gjenopprette immunsystemets anti-neoplastiske funksjoner 1,2,3. Svært effektive kreftbehandlinger inkluderer for tiden de monoklonale antistoffene nivolumab, som retter seg mot programmert dødsprotein 1 (PD-1)4, og atezolizumab, som retter seg mot programmert dødsligand 1 (PD-L1)5. Denne tilnærmingen har vist stor klinisk suksess i behandling av kreftpasienter. Den kliniske nytten av gjeldende kontrollpunkthemmingsstrategier reduseres imidlertid av bivirkninger og behandlingsresistens, spesielt ved behandling med enkeltmiddel6. En kombinasjon av immunterapi og mer effektive terapeutiske strategier med lavere toksisitet er presserende nødvendig i kreftbehandling 1,3,6.
I løpet av de siste 30 årene har Dr. Kaumayas laboratorium utviklet peptidkreftvaksiner og peptidetterligningsrelaterte midler for kreftbehandling, hvorav noen er i pågående kliniske studier 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . For eksempel har B-Vaxx med HER-2 kombinasjonsimmunterapi vist pasientfordeler mot metastatiske og/eller tilbakevendende solide tumorer i kliniske studier12. Laboratoriets nyeste kreftvaksiner er PD1-Vaxx 2,13 og PDL1-Vaxx14, som har vist store fordeler i prekliniske studier, spesielt i kombinasjonsbehandling. PD1-Vaxx har fullført kliniske dose-eskaleringsstudier i USA og Australia. PD1-Vaxx vil bli kombinert med atezolizumab i fase 1b-studien som starter i mai 2023. Denne rapporten fokuserer på å evaluere evnen til PDL1-Vaxx-induserte antistoffer til å blokkere PD-1 / PD-L1-interaksjonen.
PDL1-Vaxx kreftvaksine er en ny B-celle peptidepitopvaksine med PD-L1 aminosyrer 130-147 knyttet til det promiskuøse T-celle meslinger virus fusjon (MVF) peptid via en GPSL peptid linker. Prekliniske studier har vist at PDL1-Vaxx er svært immunogen i å stimulere antistoffproduksjon mot kreft i ulike dyremodeller, forlenger overlevelsen og reduserer tumorbelastningen14. Disse antistoffene generert mot PD-L1-peptidet kan med hell blokkere PD1 / PD-L1-interaksjonen, og dermed resultere i anti-neoplastisk aktivitet. Denne rapporten introduserer en analyse som analyserer blokaden av PD1 / PD-L1-kompleksdannelse av PDL1-Vaxx-induserte antistoffer ved bruk av et magnetisk perlebasert format med en dual-reporter-avlesning på et flowcytometriinstrument.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

Inhiberingen av sjekkpunktreseptorer (PD-1, PD-L1 og CTLA-4) med monoklonale antistoffer har vist stor nytte i kliniske studier for behandling av kreftpasienter og har blitt en bærebjelke tilnærming i moderne kreftimmunterapi. Imidlertid er det bare en undergruppe av pasienter som responderer på immunterapi med sjekkpunktmonoklonale antistoffer. Derfor er det presserende å utvikle nye terapeutiske strategier mot kreft. En ny B-celle peptidepitop PDL1 (programmert dødsligand 1) kreftvaksine er utviklet, med aminosyrer 130-147 knyttet til MVF-peptidet ("promiskuøs" T-celle meslinger virus fusjonsprotein) via en GPSL-linker. Preklinisk testing har indikert at denne PDL1-vaksinen (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerer svært immunogene antistoffer hos dyr. Dyr immunisert med PDL1-Vaxx viser redusert tumorbelastning og utvidet overlevelse i ulike dyrekreftmodeller. Virkningsmekanismene indikerer at vaksinefremkalte antistoffer hemmer tumorcelleproliferasjon, induserer apoptose og blokkerer PD-1 / PD-L1-interaksjonen. Dette manuskriptet introduserer en magnetisk perlebasert analyse som bruker et dual-reporter-strømningsanalysesystem for å evaluere PD-1 / PD-L1-interaksjonen og dens blokkering av anti-PDL1-antistoffene hevet mot PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Analysen var i stand til nøyaktig å kvantifisere inhiberingen av PD-1 / PD-L1-interaksjonen av fire unike polyklonale antistoffer, generert mot rhPD-L1-vaksinepeptidene, som blir undersøkt som potensielle kreftterapeutiske midler. Skjemaet for denne analysen er gitt i figur 1. Mengden biotinylert rhPD-L1 som bundet til rhPD-1-konjugerte perler og hemming av denne bindingen av de fire PLD1-Vaxx-induserte antistoffkandidatene ble målt i Reporter Channel 1 ved hjelp av et streptapavidin-PE-deteksjonsreagens som direkte bandt rhPD-L1 (figur 2).
Alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer blokkerte rhPD-L1-interaksjonen med PD-1 som hadde blitt immobilisert på mikrosfærer i varierende grad. Prosentandelen av hemming av de forskjellige anti-PDL1-peptidantistoffene varierte fra 48 % til 74 % ved den maksimalt testede konsentrasjonen på 1000 μg/ml. Det positive kontrollmonoklonale antistoffet atezolizumab oppnådde 92 % blokade av PD-1/PD-L1-interaksjonen ved maksimal testet konsentrasjon14 på 4 μg/ml (figur 2). Alle de eksperimentelle PDL1-Vaxx-antistoffene viste konsentrasjonsavhengig hemming av rhPD-L1-binding til rhPD-1-konjugerte perler sammenlignet med trastuzumab, det negative kontrollantistoffet som ikke var forventet å interagere med PD-1/PD-L1-systemet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figur 2: Blokade av rhPD-L1-interaksjon med rhPD-1 koblet til magnetiske perler med anti-PDL1-peptidantistoffer, som vist ved en ny fluorescerende perlebasert immunoassay. Rekombinant human PD-1 ble koblet til magnetiske mikrosfærer, og kulene ble deretter inkubert med biotinylert rhPD-L1 som hadde blitt pre-inkubert med forskjellige anti-PDL1-peptidantistoffer. Et streptavidin-phycoerythrin-deteksjonsreagens ble brukt til å binde biotinet og dermed vurdere den relative mengden rhPD-L1 som var tilgjengelig for binding til PD-1. Polyklonale antistoffer hevet hos kaniner mot PDL1 peptidvaksiner (anti-PDL1 [36], anti-PDL1 [50], anti-PDL1 [95] og anti-PDL1 [130]) ble testet for hemmende aktivitet og viste 48% -74% blokkering av rekombinante PD-1 / PD-L1 interaksjoner ved den høyeste konsentrasjonen testet. Atezolizumab (et annet anti-PDL1 monoklonalt antistoff) ble brukt som positiv kontroll. Det ikke-relaterte kommersielle monoklonale antistoffet trastuzumab (anti-HER2) ble brukt som negativ kontroll. Denne figuren er tilpasset fra Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figur 3: Sammenlignende binding av forskjellige PDL1-Vaxx-induserte antistoffer mot rhPD-L1 kompleksert til rhPD1-belagte magnetiske perler. Brilliant violet 421-konjugert sekundærdeteksjonsantistoff ble brukt til å sammenligne bindingen av forskjellige kaninpolyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer til rhPD-L1 via rhPD-1-belagte perler. BV421 blått fluorescenssignal ble tatt opp i Reporter Channel 2 av dual-reporter-instrumentet; Dette signalet korrelerer med den relative bindingseffektiviteten til de eksperimentelle anti-PDL1-peptidantistoffene. Trastezumab (anti-HER2), et monoklonalt antistoff som retter seg mot et annet sjekkpunkt enn PD-1/PD-L1, ble brukt som negativ kontroll. MFI representerer gjennomsnittlig dråpemedian fluorescensintensitet, som ble målt i dupliserte reaksjonsbrønner per tilstand. Denne figuren er tilpasset fra Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
De relative evnene til de fire eksperimentelle PDL1-Vaxx-induserte kandidatantistoffene til å binde rhPD-L1 ble sammenlignet ved hjelp av et separat deteksjonssystem (BV421-konjugert antikanin IgG) som ble evaluert på instrumentets andre reporterkanal. Disse resultatene indikerte at alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer bundet til rhPD-L1 på en konsentrasjonsavhengig måte14 (figur 3). Anti-PDL1 (130) antistoffet viste det høyeste rhPDL1-bindingssignalet til de fire PDL1-Vaxx-induserte antistoffkandidatene.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Sjekkpunkthemmere er viktige mål for å utvikle terapier for kampen mot kreft. Denne rapporten introduserer en ny PDL1-peptidbasert kreftvaksine, PDL1-Vaxx, som induserer nøytraliserende polyklonal antistoffproduksjon som blokkerer PD-1 / PDL1-kompleksdannelse. Dette arbeidet beskriver også utvikling og testing av en fluorescerende perlebasert analyse for å analysere denne aktiviteten.

Magnetisk fluorescerende perlebasert dual-reporter strømningsanalyse av PDL1-vaxx peptidvaksineindusert antistoffblokade av PD-1 / PD-L1-interaksjonen

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Vårt prosjekt ledet av professor Pravin Kaumaya er fokusert på å utvikle B-celle epitop peptid vaksiner som kan brukes til å øke immunforsvaret for bedre å bekjempe kreft. Vi tror at peptidvaksiner rettet mot immunkontrollpunktmål til og med kan kombineres med andre terapier for å forbedre pasientutfallet. Vi ønsket å teste blokkeringsevnen til våre anti PD-L1-antistoffer i en tradisjonell mikroperleanalyse der humant rekombinant PD-L1-protein var bundet til MagPlex-perler.Vi fant at når PD-L1 var bundet til perlene, hadde de en lav bindingskapasitet for PD-1-liganden. Dette forhindret oss i å bruke denne muligheten for testblokkering. Når binding av protein til perler hemmer binding til ligand eller antistoffer, er forbehandling med testantistoffene i oppløsning et alternativ, senere tilsetning av ligandbelagte perler til målblokkerblandingen.Deres interaksjon kan undersøkes. Dette kan være en annen vei for å studere samme mål-ligand-bindende interaksjon Vi har utviklet B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx og CTLA4-Vaxx kreftvaksiner. Disse vaksinene retter seg mot HER2 og flere immunkontrollpunktmarkører er involvert i ulike former for kreft.B-Vaxx og PD1-Vaxx er i pågående kliniske studier i Australia og USA. Vi håper våre immunsjekkpunktvaksiner vil komme flere pasienter til gode. I tidligere mikrosfæreeksperimenter fant vi at PD-1 interagerte godt med liganden PD-L1. Derfor rekonstruerte vi protokollen, prebinding av anti-PD-L1-peptidantistoffene til biotinylert PD-L1-protein før vi tilsatte PD-1-merkede MagPlex-perler.Dette tillot oss å teste antistoffene våre for deres evne til å blokkere PD-1 / PD-L1-interaksjon. Vi vil fortsette å fokusere på kombinasjonsimmunterapier som overvinner behandlingsresistens. Vi ønsker også å utforske mer effektive kombinasjonsbehandlinger som bedre hemmer tumorvekst, forhindrer metastase og forlenger pasientoverlevelse.