Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Författarna tackar Sherry Dunbar PhD, MBA från Luminex Corporation (Austin, TX) för forskningsstöd och Matthew Silverman PhD från Biomedical Publishing Solutions (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) för vetenskaplig och skrivande hjälp. Detta arbete stöddes av utmärkelser till Pravin T. P. Kaumaya från National Institutes of Health (R21 CA13508 och R01 CA84356) och Imugene Ltd, Sydney, Australien (OSU 900600, GR110567 och GR124326).

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin T.P. Kaumaya är konsult för Imugene, Ltd.

Syftet med checkpoint-relaterad cancerimmunterapi är att störa interaktionen mellan checkpointproteiner och deras viktiga ligander i tumöröverlevnad och progression2. Denna forskargrupp utvecklar aktivt nya PD-1- och PD-L1-vacciner som framkallar ett antikroppssvar som riktar sig mot och avbryter PD-1/PD-L1 checkpoint 3,8,13,14. Tidigare har två varianter av enzymkopplade immunadsorberande analyser (ELISA) utförts för att utvärdera effekterna av anti-PDL1-peptidantikroppar på hämningen av den rekombinanta PD1/PD-L1-interaktionen14. (1) I den första varianten belades rhPD-L1 på en mikrotiterplatta, och sedan inkuberades plattan med utspädda anti-PDL1-vaccinkandidatinducerade antikroppar. Antikropparnas hämning av den rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionen utvärderades sedan genom att tillsätta biotinylerad rhPD-1 och kvantifiera bindningen till den immobiliserade rhPD-L1 med hjälp av ett streptavidin-pepparrotsperoxidaskonjugat och ett kolorimetriskt substrat. Vi definierade detta som den direkta blockadanalysen. (2) I den andra varianten belades PD-1 på mikrotiterplattan. Biotinylerad rhPD-L1 förinkuberades med var och en av de anti-PLD1-inducerade polyklonala antikropparna i separata reaktionsrör. rhPDL1/anti-PDL1-blandningarna tillsattes sedan till plattbrunnarna som innehöll immobiliserad rhPD-1 och fick reagera. Alla rhPDL1 som reagerade med den immobiliserade rhPD-1 i närvaro av de potentiellt blockerande PDL1-Vaxx-inducerade antikropparna detekterades med efterföljande inkubation av streptavidin-HRP och kolorimetriskt substrat. Vi definierade detta som den omvända blockadanalysen.
Den omvända blockaden av den rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionen av anti-PDL1-peptidantikroppar visade hämning av signalen (dvs. PD-1/PD-L1-blockad) på ett antikroppskoncentrationsberoende sätt14, medan den direkta blockadmetoden inte gav konsekventa resultat (visas inte). Den pärlbaserade blockadanalysen med dubbla rapportörer utvecklades för att verifiera ELISA-resultaten och för att undersöka blockaden av PD-1/PD-L1-interaktionen i en vätskefas, vilket eliminerar de potentiella steriska hindren/bindningsproblemen med epitoptillgänglighet i samband med immobilisering av rekombinanta proteiner på brunnsbottnar. Mikrosfäranalysen var direkt korrelerad till ELISA-blockeringsresultaten med hjälp av den omvända blockadanalysen (figur 2). Dessutom kan fluorescensbaserade immunanalyser ge förbättrad analyskänslighet och ett breddat dynamiskt omfång jämfört med kolorimetriska ELISAs18, och vidare möjliggör den multiplexerade pärlbaserade analysen samtidig prestanda för två oberoende immunanalyser inom en enda reaktion. Sulfo-NHS och EDC som användes för den kovalenta kopplingen av mikrosfärerna till rhPD-1 kan ha lett till de prestandaskillnader som sågs mellan direktblockaden och omvänd blockad och de observerade skillnaderna i känslighet mellan ELISA- och Luminex-pärlbaserade rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktionsanalyser. Ytterligare undersökningar på kemisk och molekylär nivå är motiverade för att studera de möjliga mekanismerna som är ansvariga för dessa skillnader.
Både ELISA14 och de pärlbaserade analyserna visar att PDL1-Vaxx-inducerade anti-PDL1-antikroppar kan hämma bildandet av PD1/PD-L1-checkpointkomplex. Den peptidbaserade PDL1-Vaxx inducerar framgångsrikt anti-PDL1-antikroppar som kan blockera PD-1/PD-L1-interaktionen. Detta tillvägagångssätt kan fungera som en ny terapeutisk strategi för behandling av cancer, vilket stöds av prekliniska djurstudier 3,13,14. Planerade kliniska prövningar kommer att fastställa effekten av PDL1-Vaxx för checkpoint-immunterapi och sjukdomskontroll hos cancerpatienter.

I immunsystemets T-celler, B-celler och intracellulära kontrollpunkter reglerar signalvägar immunaktiviteter. Vissa cancerceller skyddar sig mot immunattacker genom att stimulera checkpoint-mål, vilket hämmar immunfunktionen och främjar neoplastisk överlevnad och spridning. Onkologisk immunterapi genom checkpoint-hämning använder antikroppar för att rikta in sig på och blockera signalkontrollpunkterna och på så sätt återställa immunsystemets antineoplastiska funktioner 1,2,3. Mycket effektiva anti-cancerterapier inkluderar för närvarande de monoklonala antikropparna nivolumab, som riktar sig mot programmerat dödsprotein 1 (PD-1)4, och atezolizumab, som riktar sig mot programmerad dödsligand 1 (PD-L1)5. Detta tillvägagångssätt har visat stor klinisk framgång vid behandling av cancerpatienter. Den kliniska nyttan av nuvarande strategier för checkpointhämning mildras dock av biverkningar och behandlingsresistens, särskilt vid behandling med ett enda läkemedel6. Det finns ett akut behov av en kombination av immunterapi och effektivare behandlingsstrategier med lägre toxicitet vid cancerbehandling 1,3,6.
Under de senaste 30 åren har Dr. Kaumayas laboratorium utvecklat peptidcancervacciner och peptidhärmningsrelaterade medel för cancerterapi, varav några är i pågående kliniska prövningar 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Till exempel har B-Vaxx med HER-2 kombinationsimmunterapi visat patientnytta mot metastaserande och/eller återkommande solida tumörer i kliniska prövningar12. Laboratoriets senaste cancervacciner är PD1-Vaxx 2,13 och PDL1-Vaxx14 som har visat stora fördelar i prekliniska studier, särskilt vid kombinationsbehandling. PD1-Vaxx har genomfört kliniska studier med doseskalering i USA och Australien. PD1-Vaxx kommer att kombineras med atezolizumab i fas 1b-studien som startar i maj 2023. Denna rapport fokuserar på att utvärdera förmågan hos PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar att blockera PD-1/PD-L1-interaktionen.
Cancervaccinet PDL1-Vaxx är ett nytt B-cellspeptidepitopvaccin med PD-L1-aminosyrorna 130-147 kopplade till den promiskuösa T-cellspeptiden för mässlingvirus (MVF) via en GPSL-peptidlänkare. Prekliniska studier har visat att PDL1-Vaxx är mycket immunogent när det gäller att stimulera produktionen av antikroppar mot cancer i olika djurmodeller, förlänger överlevnaden och minskar tumörbördan14. Dessa antikroppar som genereras mot PD-L1-peptiden kan framgångsrikt blockera PD1/PD-L1-interaktionen, vilket resulterar i antineoplastisk aktivitet. Denna rapport introducerar en analys som analyserar blockaden av PD1/PD-L1-komplexbildning av PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar med hjälp av ett magnetiskt pärlbaserat format med en dubbelrapportörsavläsning på ett flödescytometriinstrument.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

Hämning av checkpoint-receptorer (PD-1, PD-L1 och CTLA-4) med monoklonala antikroppar har visat stor nytta i kliniska prövningar för behandling av cancerpatienter och har blivit en grundpelare i modern cancerimmunterapi. Det är dock endast en undergrupp av patienterna som svarar på immunterapi med monoklonala antikroppar vid checkpoint. Därför är det angeläget att utveckla nya behandlingsstrategier mot cancer. Ett nytt B-cellspeptidepitop PDL1 (programmerad dödsligand 1) cancervaccin har utvecklats, med aminosyrorna 130-147 kopplade till MVF-peptiden ("promiskuöst" T-cellsmässlingvirusfusionsprotein) via en GPSL-länkare. Prekliniska tester har indikerat att detta PDL1-vaccin (PDL1-Vaxx) effektivt stimulerar högimmunogena antikroppar hos djur. Djur som immuniserats med PDL1-Vaxx visar minskad tumörbörda och förlängd överlevnad i olika djurcancermodeller. Verkningsmekanismerna indikerar att vaccininducerade antikroppar hämmar tumörcellsproliferation, inducerar apoptos och blockerar PD-1/PD-L1-interaktionen. Detta manuskript introducerar en magnetisk pärlbaserad analys som använder ett flödesanalyssystem med dubbla rapportörer för att utvärdera PD-1/PD-L1-interaktionen och dess blockad av anti-PDL1-antikropparna som rests mot PDL1-Vaxx.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Analysen kunde exakt kvantifiera hämningen av PD-1/PD-L1-interaktionen av fyra unika polyklonala antikroppar, genererade mot rhPD-L1-vaccinpeptiderna, som undersöks som potentiella cancerterapeutiska medel. Schemat för denna analys finns i figur 1. Mängden biotinylerad rhPD-L1 som band till rhPD-1-konjugerade kulor och hämningen av denna bindning av de fyra PLD1-Vaxx-inducerade antikroppskandidaterna mättes i Reporter Channel 1 med hjälp av ett streptavidin-PE-detektionsreagens som direkt band rhPD-L1 (Figur 2).
Alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar blockerade rhPD-L1-interaktionen med PD-1 som hade immobiliserats på mikrosfärer i varierande utsträckning. Den procentuella hämningen av de olika anti-PDL1-peptidantikropparna varierade från 48 % till 74 % vid den maximala testade koncentrationen på 1 000 μg/ml. Den monoklonala antikroppen atezolizumab med positiv kontroll uppnådde 92 % blockad av PD-1/PD-L1-interaktionen vid den högsta testade koncentrationen14 på 4 μg/ml (figur 2). Alla de experimentella PDL1-Vaxx-antikropparna visade koncentrationsberoende hämning av rhPD-L1-bindning till rhPD-1-konjugerade kulor jämfört med trastuzumab, den negativa kontrollantikroppen som inte förväntades interagera med PD-1/PD-L1-systemet.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Figur 2: Blockering av rhPD-L1-interaktion med rhPD-1 kopplad till magnetiska pärlor av anti-PDL1-peptidantikroppar, vilket visas av en ny fluorescerande pärlbaserad immunanalys. Rekombinant human PD-1 kopplades till magnetiska mikrosfärer, och kulorna inkuberades sedan med biotinylerad rhPD-L1 som hade förinkuberats med olika anti-PDL1-peptidantikroppar. Ett stektafektionsreagens för streptavidin-fykoerytrin användes för att binda biotinet och därmed bedöma den relativa mängden rhPD-L1 som var tillgänglig för att binda till PD-1. Polyklonala antikroppar upphöjda hos kaniner mot PDL1-peptidvaccinerna (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] och anti-PDL1[130]) testades för hämmande aktivitet och visade 48%-74% blockad av rekombinanta PD-1/PD-L1-interaktioner vid den högsta testade koncentrationen. Atezolizumab (en annan monoklonal anti-PDL1-antikropp) användes som positiv kontroll. Den obesläktade kommersiella monoklonala antikroppen trastuzumab (anti-HER2) användes som negativ kontroll. Denna figur är hämtad från Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Figur 3: Jämförande bindning av olika PDL1-Vaxx-inducerade antikroppar till rhPD-L1-komplexerade till rhPD1-belagda magnetiska kulor. Briljantviolett 421-konjugerad sekundär detektionsantikropp användes för att jämföra bindningen av olika polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar från kanin till rhPD-L1 via rhPD-1-belagda kulor. Den blå fluorescenssignalen BV421 spelades in i Reporter Channel 2 på instrumentet med dubbla rapporter. Denna signal korrelerar med den relativa bindningseffektiviteten hos de experimentella anti-PDL1-peptidantikropparna. Trastezumab (anti-HER2), en monoklonal antikropp som riktar sig mot en annan kontrollpunkt än PD-1/PD-L1, användes som negativ kontroll. MFI representerar den genomsnittliga medianfluorescensintensiteten för pärlor, som uppmättes i dubbla reaktionsbrunnar per tillstånd. Denna figur är hämtad från Guo et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
De relativa förmågorna hos de fyra experimentella PDL1-Vaxx-inducerade kandidatantikropparna att binda rhPD-L1 jämfördes med hjälp av ett separat detektionssystem (BV421-konjugerat anti-kanin-IgG) som utvärderades på instrumentets andra reporterkanal. Dessa resultat indikerade att alla fyra polyklonala anti-PDL1-peptidantikroppar band till rhPD-L1 på ett koncentrationsberoende sätt14 (Figur 3). Anti-PDL1(130)-antikroppen uppvisade den högsta rhPDL1-bindningssignalen av de fyra PDL1-Vaxx-inducerade antikroppskandidaterna.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Checkpointhämmare är viktiga måltavlor för att utveckla terapier för kampen mot cancer. Denna rapport introducerar ett nytt PDL1-peptidbaserat cancervaccin, PDL1-Vaxx, som inducerar neutraliserande polyklonal antikroppsproduktion som blockerar bildandet av PD-1/PDL1-komplex. Detta arbete beskriver också utvecklingen och testningen av en fluorescerande pärlbaserad analys för att analysera denna aktivitet.

Magnetisk fluorescerande pärlbaserad dubbelrapportörsflödesanalys av PDL1-vaxxpeptidvaccininducerad antikroppsblockad av PD-1/PD-L1-interaktionen

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Vårt projekt som leds av professor Pravin Kaumaya är inriktat på att utveckla B-cellsepitoppeptidvacciner som kan användas för att stärka immunförsvaret för att bättre bekämpa cancern. Vi tror att peptidvacciner som riktar sig mot immunkontrollpunkter till och med kan kombineras med andra terapier för att förbättra patientresultaten. Vi ville testa blockeringsförmågan hos våra anti-PD-L1-antikroppar i en traditionell mikropärlanalys där humant rekombinant PD-L1-protein var bundet till MagPlex-kulor.Vi fann att när PD-L1 väl var bunden till pärlorna hade de en låg bindningsförmåga för sin PD-1-ligand. Detta hindrade oss från att använda denna väg för att testa blockering. När bindning av protein till kulor hämmar bindning till ligand eller antikroppar är förbehandling med testantikropparna i lösning ett alternativ, som senare tillsätter ligandbelagda kulor till målblockerarblandningen.Samspelet mellan dem kan undersökas. Detta kan vara ett annat sätt att studera samma mål-ligand-bindande interaktion Vi har utvecklat cancervaccinerna B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx och CTLA4-Vaxx. Dessa vacciner riktar sig mot HER2 och flera immunkontrollpunktsmarkörer är involverade i olika cancerformer.B-Vaxx och PD1-Vaxx befinner sig i pågående kliniska prövningar i Australien och USA. Vi hoppas att våra immuncheckpoint-vacciner kommer att gynna fler patienter. I tidigare mikrosfärexperiment fann vi att PD-1 interagerade väl med sin ligand PD-L1. Därför omarbetade vi protokollet och förband anti-PD-L1-peptidantikropparna till biotinylerat PD-L1-protein innan vi tillsatte de PD-1-märkta MagPlex-pärlorna.Detta gjorde det möjligt för oss att testa våra antikroppar för deras förmåga att blockera PD-1/PD-L1-interaktion. Vi kommer att fortsätta att fokusera på kombinationsimmunterapier som övervinner behandlingsresistens. Vi vill också utforska mer effektiva kombinationsbehandlingar som bättre hämmar tumörtillväxt, förhindrar metastasering och förlänger patientöverlevnaden.