Name: Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T13:00:00
Duration: 2 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Yazarlar, araştırma desteği için Luminex Corporation'dan (Austin, TX) MBA Sherry Dunbar'a ve bilimsel ve yazma yardımı için Biyomedikal Yayıncılık Çözümleri Doktora'dan (Panama City, FL; mattsilver@yahoo.com) Matthew Silverman'a teşekkür eder. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R21 CA13508 ve R01 CA84356) ve Sidney, Avustralya'daki Imugene Ltd'den (OSU 900600, GR110567 ve GR124326) Pravin TP Kaumaya'ya verilen ödüllerle desteklenmiştir.

Flow Analysis of PDL1-Vaxx Antibody Blockade Using Magnetic Fluorescent Beads

<ol>
	<li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+epitope+peptide+cancer+vaccines:+a+new+paradigm+for+combination+immunotherapies+with+novel+checkpoint+peptide+vaccine.">B-cell epitope peptide cancer vaccines: a new paradigm for combination immunotherapies with novel checkpoint peptide vaccine.</a> Future Oncology. 16 (23), 1767-1791 (2020).</li><li>Pandey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revolutionization+in+cancer+therapeutics+via+targeting+major+immune+checkpoints+PD-1,+PD-L1+and+CTLA-4.">Revolutionization in cancer therapeutics via targeting major immune checkpoints PD-1, PD-L1 and CTLA-4.</a> Pharmaceuticals. 15 (3), 335 (2022).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Good, A. J., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+studies+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+peptide+cancer+vaccine+PD1-Vaxx+from+BALB/c+mice+to+beagle+dogs+and+to+non-human+primates+(cynomolgus+monkeys).">Preclinical studies of a novel human PD-1 B-cell peptide cancer vaccine PD1-Vaxx from BALB/c mice to beagle dogs and to non-human primates (cynomolgus monkeys).</a> Frontiers in Oncology. 12, 826566 (2022).</li><li>Brahmer, J. R., Hammers, H., Lipson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nivolumab:+Targeting+PD-1+to+bolster+antitumor+immunity.">Nivolumab: Targeting PD-1 to bolster antitumor immunity.</a> Future Oncology. 11 (9), 1307-1326 (2015).</li><li>Shah, N. J., Kelly, W. J., Liu, S. V., Choquette, K., Spira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review+on+the+Anti-PD-L1+antibody+atezolizumab.">Product review on the Anti-PD-L1 antibody atezolizumab.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 14 (2), 269-276 (2018).</li><li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune-related+adverse+events+associated+with+immune+checkpoint+blockade.">Immune-related adverse events associated with immune checkpoint blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li><li>Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paradigm+shift:+Cancer+therapy+with+peptide-based+B-cell+epitopes+and+peptide+immunotherapeutics+targeting+multiple+solid+tumor+types:+Emerging+concepts+and+validation+of+combination+immunotherapy.">A paradigm shift: Cancer therapy with peptide-based B-cell epitopes and peptide immunotherapeutics targeting multiple solid tumor types: Emerging concepts and validation of combination immunotherapy.</a> Human Vaccines &amp; Immunotherapeutics. 11 (6), 1368-1386 (2015).</li><li>Guo, L., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+prototype+checkpoint+inhibitor+B-cell+epitope+vaccine+(PD1-Vaxx)+en+route+to+human+Phase+1+clinical+trial+in+Australia+and+USA:+Exploiting+future+novel+synergistic+vaccine+combinations.">First prototype checkpoint inhibitor B-cell epitope vaccine (PD1-Vaxx) en route to human Phase 1 clinical trial in Australia and USA: Exploiting future novel synergistic vaccine combinations.</a> British Journal of Cancer. 125 (2), 152-154 (2021).</li><li>Dakappagari, N. K., Douglas, D. B., Triozzi, P. L., Stevens, V. C., Kaumaya, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+mammary+tumors+with+a+chimeric+HER-2+B-cell+epitope+peptide+vaccine.">Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2 B-cell epitope peptide vaccine.</a> Cancer Research. 60 (14), 3782-3789 (2000).</li><li>Dakappagari, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+HER-2/neu+B-cell+epitope+peptide+vaccine+designed+to+incorporate+two+native+disulfide+bonds+enhances+tumor+cell+binding+and+antitumor+activities.">Conformational HER-2/neu B-cell epitope peptide vaccine designed to incorporate two native disulfide bonds enhances tumor cell binding and antitumor activities.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 54-63 (2005).</li><li>Kaumaya, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+active+immunotherapy+with+combination+of+two+chimeric,+human+epidermal+growth+factor+receptor+2,+B-cell+epitopes+fused+to+a+promiscuous+Tcell+epitope+in+patients+with+metastatic+and/or+recurrent+solid+tumors.">Phase I active immunotherapy with combination of two chimeric, human epidermal growth factor receptor 2, B-cell epitopes fused to a promiscuous Tcell epitope in patients with metastatic and/or recurrent solid tumors.</a> Journal of Clinical Oncology. 27 (31), 5270-5277 (2009).</li><li>Bekaii-Saab, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+immunotherapy+trial+with+two+chimeric+HER-2+B-cell+peptide+vaccines+emulsified+in+montanide+ISA+720VG+and+Nor-MDP+adjuvant+in+patients+with+advanced+solid+tumors.">Phase I immunotherapy trial with two chimeric HER-2 B-cell peptide vaccines emulsified in montanide ISA 720VG and Nor-MDP adjuvant in patients with advanced solid tumors.</a> Clinical Cancer Research. 25 (12), 3495-3507 (2019).</li><li>Kaumaya, P. T. P., Guo, L., Overholser, J., Penichet, M. L., Bekaii-Saab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+and+antitumor+efficacy+of+a+novel+human+PD-1+B-cell+vaccine+(PD1-Vaxx)+and+combination+immunotherapy+with+dual+trastuzumab/pertuzumab-like+HER-2+B-cell+epitope+vaccines+(B-Vaxx)+in+a+syngeneic+mouse+model.">Immunogenicity and antitumor efficacy of a novel human PD-1 B-cell vaccine (PD1-Vaxx) and combination immunotherapy with dual trastuzumab/pertuzumab-like HER-2 B-cell epitope vaccines (B-Vaxx) in a syngeneic mouse model.</a> Oncoimmunology. 9 (1), 1818437 (2020).</li><li>Guo, L., Overholser, J., Darby, H., Ede, N. J., Kaumaya, P. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+discovered+PD-L1+B_cell+epitope+peptide+vaccine+(PDL1-Vaxx)+exhibits+potent+immune+responses+and+effective+anti-tumor+immunity+in+multiple+syngeneic+mice+models+and+(synergizes)+in+combination+with+a+dual+HER-2+B-cell+vaccine+(B-Vaxx).">A newly discovered PD-L1 B_cell epitope peptide vaccine (PDL1-Vaxx) exhibits potent immune responses and effective anti-tumor immunity in multiple syngeneic mice models and (synergizes) in combination with a dual HER-2 B-cell vaccine (B-Vaxx).</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2127691 (2022).</li><li>. Luminex Corporation. The xMAP&#174; Cookbook, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F">https://info.luminexcorp.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook?utm_referrr=https%3A%2F%2Fwww.luminexcorp.com%2F</a> (2022)</li><li>MagPlex&#174; Microspheres Documentation. Product information sheet. Luminex Corporation Available from: <a target="_blank" href="https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview">https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/#overview</a> (2014)</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Estimation of cell number by hemocytometry counting. 2019 (11), (2019).</li><li>Selecting the Detection System - Colorimetric, Fluorescent, Luminescent Methods for ELISA Assays. Corning Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf">https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf</a> (2019)</li></ol>

Pravin TP Kaumaya, Imugene, Ltd.'nin danışmanıdır.

Kontrol noktası ile ilişkili kanser immünoterapisinin amacı, tümör sağkalımı ve ilerlemesinde kontrol noktası proteinleri ile bunların önemli ligandları arasındaki etkileşimi bozmaktır2. Bu araştırma grubu, PD-1/PD-L1 kontrol noktası 3,8,13,14'ü hedefleyen ve kesintiye uğratan bir antikor tepkisi ortaya çıkaran yeni PD-1 ve PD-L1 aşılarını aktif olarak geliştirmektedir. Daha önce, anti-PDL1-peptit antikorlarının rekombinant PD1 / PD-L1 etkileşiminin inhibisyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için enzime bağlı immünosorbent testlerinin (ELISA'lar) iki varyasyonu gerçekleştirilmiştir14. (1) İlk varyantta, rhPD-L1 bir mikrotitre plakası üzerine kaplandı ve daha sonra plaka, seyreltilmiş anti-PDL1 aşı adayı kaynaklı antikorlarla inkübe edildi. Antikorlar tarafından rekombinant PD-1 / PD-L1 etkileşiminin inhibisyonu daha sonra biyotinile rhPD-1 eklenerek ve bir streptavidin-yaban turpu peroksidaz konjugatı ve bir kolorimetrik substrat kullanılarak hareketsizleştirilmiş rhPD-L1'e bağlanmanın ölçülmesiyle değerlendirildi. Bunu doğrudan abluka testi olarak tanımladık. (2) İkinci varyantta, PD-1 mikrotitre plakası üzerine kaplanmıştır. Biyotinillenmiş rhPD-L1, ayrı reaksiyon tüplerinde anti-PLD1 adayı kaynaklı poliklonal antikorların her biri ile önceden inkübe edildi. rhPDL1/anti-PDL1 karışımları daha sonra hareketsizleştirilmiş rhPD-1 içeren plaka kuyucuklarına ilave edildi ve reaksiyona girmesine izin verildi. Potansiyel olarak bloke edici PDL1-Vaxx ile indüklenen antikorların varlığında hareketsizleştirilmiş rhPD-1 ile reaksiyona giren herhangi bir rhPDL1, sonraki streptavidin-HRP ve kolorimetrik substrat inkübasyonu ile tespit edildi. Bunu ters blokaj testi olarak tanımladık.
Anti-PDL1-peptit antikorları tarafından rekombinant PD-1 / PD-L1 etkileşiminin ters blokajı, antikor konsantrasyonuna bağlı bir şekilde sinyalin inhibisyonunu (yani, PD-1 / PD-L1 blokajı)gösterdi 14, doğrudan blokaj yaklaşımı tutarlı sonuçlar vermedi (gösterilmedi). Boncuk bazlı çift raportör blokaj testi, ELISA sonuçlarını doğrulamak ve PD-1/PD-L1 etkileşiminin bir sıvı fazında blokajını araştırmak için geliştirilmiştir, bu da kuyu diplerinde rekombinant proteinlerin immobilize edilmesiyle ilişkili potansiyel sterik engelleme/bağlanma epitop kullanılabilirliği sorunlarını ortadan kaldırır. Mikroküre analizi, ters blokaj testi kullanılarak ELISA blokaj sonuçlarıyla doğrudan ilişkilendirildi (Şekil 2). Ek olarak, floresan bazlı immünolojik testler, kolorimetrik ELISA'lara18 kıyasla gelişmiş test duyarlılığı ve genişletilmiş bir dinamik aralık sağlayabilir ve ayrıca, çoğullanmış boncuk bazlı test, tek bir reaksiyon içinde iki bağımsız immünolojik testin eşzamanlı performansına izin verir. Mikrokürelerin rhPD-1'e kovalent bağlanması için kullanılan sülfo-NHS ve EDC, doğrudan blokaj ve ters blokaj deneyleri arasında görülen performans farklılıklarına ve ELISA ile Luminex boncuk bazlı rekombinant PD-1 / PD-L1 etkileşim deneyleri arasında gözlenen duyarlılık farklılıklarına yol açmış olabilir. Bu farklılıklardan sorumlu olası mekanizmaları incelemek için daha fazla kimyasal ve moleküler düzeyde araştırma yapılması gerekmektedir.
Hem ELISA14 hem de boncuk bazlı testler, PDL1-Vaxx ile indüklenen anti-PDL1 antikorlarının PD1/PD-L1 kontrol noktası kompleks oluşumunu inhibe edebileceğini göstermektedir. Peptit bazlı PDL1-Vaxx, PD-1/PD-L1 etkileşimini bloke edebilen anti-PDL1 antikorlarını başarıyla indükler. Bu yaklaşım, klinik öncesi hayvan çalışmaları 3,13,14 tarafından desteklendiği gibi, kanseri tedavi etmek için yeni bir terapötik strateji olarak hizmet edebilir. Planlanan klinik çalışmalar, kanser hastalarında kontrol noktası immünoterapisi ve hastalık kontrolü için PDL1-Vaxx'ın etkinliğini belirleyecektir.

Bağışıklık sisteminin T hücrelerinde, B hücrelerinde ve hücre içi kontrol noktalarında, sinyal yolları bağışıklık aktivitelerini düzenler. Bazı kanser hücreleri, bağışıklık fonksiyonunu inhibe eden ve neoplastik sağkalımı ve çoğalmayı destekleyen kontrol noktası hedeflerini uyararak kendilerini bağışıklık saldırısından korur. Kontrol noktası inhibisyonu ile onkolojik immünoterapi, sinyal kontrol noktalarını hedeflemek ve bloke etmek için antikorlar kullanır ve böylece bağışıklık sisteminin anti-neoplastik fonksiyonlarını geri yükler 1,2,3. Son derece etkili anti-kanser tedavileri şu anda programlanmış ölüm proteini 1'i (PD-1)4 hedefleyen monoklonal antikorlar nivolumab ve programlanmış ölüm ligandı 1'i (PD-L1)5 hedefleyen atezolizumab'ı içermektedir. Bu yaklaşım, kanser hastalarının tedavisinde büyük klinik başarı göstermiştir. Bununla birlikte, mevcut kontrol noktası inhibisyon stratejilerinin klinik faydası, özellikle tek ajan tedavisinde, advers olaylar ve tedavi direnci ile hafifletilmektedir6. Kanser tedavisinde immünoterapi ve daha düşük toksisiteye sahip daha etkili terapötik stratejilerin bir kombinasyonuna acilen ihtiyaç vardır 1,3,6.
Son 30 yılda, Dr. Kaumaya'nın laboratuvarı, bazıları devam eden klinik deneylerdeolan kanser tedavisi için peptit kanser aşıları ve peptit taklitle ilgili ajanlar geliştirmiştir 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Örneğin, HER-2 kombinasyon immünoterapisi ile B-Vaxx, klinik çalışmalarda metastatik ve/veya tekrarlayan katı tümörlere karşı hasta yararları göstermiştir12. Laboratuvarın en yeni kanser aşıları, klinik öncesi çalışmalarda, özellikle kombinasyon tedavisinde büyük avantajlar gösteren PD1-Vaxx 2,13 ve PDL1-Vaxx14'tür. PD1-Vaxx, ABD ve Avustralya'da doz yükseltme klinik denemelerini tamamladı. PD1-Vaxx, Mayıs 2023'te başlayacak Faz 1b denemesinde atezolizumab ile birleştirilecek. Bu rapor, PDL1-Vaxx ile indüklenen antikorların PD-1/PD-L1 etkileşimini bloke etme yeteneğinin değerlendirilmesine odaklanmaktadır.
PDL1-Vaxx kanser aşısı, bir GPSL peptit bağlayıcısı aracılığıyla rastgele T hücresi kızamık virüsü füzyonu (MVF) peptidine bağlı PD-L1 amino asitleri 130-147 içeren yeni bir B hücresi peptit epitop aşısıdır. Klinik öncesi çalışmalar, PDL1-Vaxx'ın çeşitli hayvan modellerinde anti-kanser antikor üretimini uyarmada yüksek oranda immünojenik olduğunu, sağkalımı uzattığını ve tümör yükünü azalttığını göstermiştir14. PD-L1 peptidine karşı üretilen bu antikorlar, PD1 / PD-L1 etkileşimini başarılı bir şekilde bloke edebilir ve böylece anti-neoplastik aktiviteye neden olabilir. Bu rapor, PDL1-Vaxx ile indüklenen antikorlar tarafından PD1/PD-L1 kompleks oluşumunun blokajını, bir akış sitometri cihazı üzerinde çift raportör okumalı manyetik boncuk tabanlı bir format kullanarak analiz eden bir test sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3)</td>
			<td>Millipore/Sigma</td>
			<td>P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0</td>
			<td>MilliporeSigma&#160;</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coupling Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>77149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes:</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>40-50016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDC, 10 mg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sNHS solution, 250 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>24510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation and Ancillary Lab Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>INTELLIFLEX-DRSE-RUO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low protein-binding round bottom 96-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>07-200-761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable)&#160;</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0269-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>CN-0288-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-&#181;m-diameter beads)</td>
			<td>Luminex Corp.&#160; (Austin, TX)</td>
			<td>MC-1**** (varies by bead label)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind microcentrifuge tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Waltham, MA)</td>
			<td>022431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptides, Antibodies, &#38; Detection Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated recombinant human PDL1&#160;</td>
			<td>Sino Biological (Wayne, PA)</td>
			<td>10084-H49H-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>709-675-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA)</td>
			<td>711-675-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged)</td>
			<td>Acro Biosystems (Newark, DE)</td>
			<td>PD1-H5256&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE)</td>
			<td>Agilent (Santa Clara, CA)</td>
			<td>PJRS34-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control</td>
			<td>Genentech/Roche (San Francisco, CA)</td>
			<td>n/a (prescription medications)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

magnetic fluorescent bead-based dual-reporter flow analysis of pdl1-vaxx peptide vaccine-induced antibody blockade of the pd-1/pd-l1 interaction

Kontrol noktası reseptörlerinin (PD-1, PD-L1 ve CTLA-4) monoklonal antikorlarla inhibisyonu, kanser hastalarının tedavisi için yapılan klinik çalışmalarda büyük fayda sağlamış ve modern kanser immünoterapisinde temel bir yaklaşım haline gelmiştir. Bununla birlikte, hastaların sadece bir alt kümesi kontrol noktası monoklonal antikor immünoterapisine yanıt verir. Bu nedenle, kansere karşı yeni terapötik stratejiler geliştirmek aciliyet arz etmektedir. Yeni bir B-hücresi peptit epitopu PDL1 (programlanmış ölüm ligandı 1) kanser aşısı, 130-147 amino asitleri bir GPSL bağlayıcı aracılığıyla MVF peptidine ("karışık" T hücresi kızamık virüsü füzyon proteini) bağlanmıştır. Klinik öncesi testler, bu PDL1 aşısının (PDL1-Vaxx) hayvanlarda yüksek immünojenik antikorları etkili bir şekilde uyardığını göstermiştir. PDL1-Vaxx ile aşılanan hayvanlar, çeşitli hayvan kanseri modellerinde tümör yükünün azaldığını ve hayatta kalma oranlarının uzadığını göstermektedir. Etki mekanizmaları, aşı kaynaklı antikorların tümör hücresi proliferasyonunu inhibe ettiğini, apoptozu indüklediğini ve PD-1/PD-L1 etkileşimini bloke ettiğini göstermektedir. Bu makale, PD-1/PD-L1 etkileşimini ve PDL1-Vaxx'a karşı ortaya çıkan anti-PDL1 antikorları tarafından blokajını değerlendirmek için çift raportörlü bir akış analiz sistemi kullanan manyetik boncuk tabanlı bir testi tanıtmaktadır.

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction

Test, potansiyel kanser terapötik ajanları olarak araştırılan rhPD-L1 aşı peptitlerine karşı üretilen dört benzersiz poliklonal antikor tarafından PD-1 / PD-L1 etkileşiminin inhibisyonunu kesin olarak ölçebildi. Bu tahlilin şeması Şekil 1'de verilmiştir. rhPD-1-konjuge boncuklara bağlanan biyotinile rhPD-L1 miktarı ve bu bağlanmanın dört PLD1-Vaxx ile indüklenen antikor adayı tarafından inhibisyonu, rhPD-L1'i doğrudan bağlayan bir streptavidin-PE tespit reaktifi kullanılarak Reporter Channel 1'de ölçüldü (Şekil 2).
Dört poliklonal anti-PDL1-peptit antikorunun tümü, mikroküreler üzerinde değişken derecelerde hareketsiz hale getirilmiş olan PD-1 ile rhPD-L1 etkileşimini bloke etti. Farklı anti-PDL1 peptit antikorlarının inhibisyon yüzdesi, test edilen maksimum 1.000 μg / mL konsantrasyonda% 48 ila% 74 arasında değişmektedir. Pozitif kontrol monoklonal antikoru atezolizumab, test edilen maksimumkonsantrasyon 14 4 μg/mL'de PD-1/PD-L1 etkileşiminin% 92 blokajını elde etti (Şekil 2). Deneysel PDL1-Vaxx antikorlarının tümü, PD-1/PD-L1 sistemi ile etkileşime girmesi beklenmeyen negatif kontrol antikoru olan trastuzumab ile karşılaştırıldığında, rhPD-L1'in rhPD-1 konjuge boncuklara bağlanmasının konsantrasyona bağlı inhibisyonunu gösterdi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig02.jpg"> Şekil 2: Yeni bir floresan boncuk bazlı immünolojik test ile gösterildiği gibi, anti-PDL1-peptit antikorları tarafından manyetik boncuklara bağlanmış rhPD-1 ile rhPD-L1 etkileşiminin blokajı. Rekombinant insan PD-1, manyetik mikrokürelere bağlandı ve boncuklar daha sonra farklı anti-PDL1-peptit antikorları ile önceden inkübe edilmiş biyotinile rhPD-L1 ile inkübe edildi. Biyotini bağlamak ve böylece PD-1'e bağlanmak için mevcut olan rhPD-L1'in nispi miktarını değerlendirmek için bir streptavidin-fikoeritrin tespit reaktifi kullanıldı. Tavşanlarda PDL1 peptit aşılarına (anti-PDL1 [36], anti-PDL1 [50], anti-PDL1 [95] ve anti-PDL1 [130]) karşı yetiştirilen poliklonal antikorlar, inhibitör aktivite açısından test edildi ve test edilen en yüksek konsantrasyonda rekombinant PD-1/PD-L1 etkileşimlerinin %48-74 blokajını gösterdi. Pozitif kontrol olarak Atezolizumab (farklı bir anti-PDL1 monoklonal antikor) kullanıldı. Negatif kontrol olarak ilişkisiz ticari monoklonal antikor trastuzumab (anti-HER2) kullanıldı. Bu rakam Guo ve ark.14'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65467/65467fig03.jpg"> Şekil 3: Farklı PDL1-Vaxx ile indüklenen antikorların, rhPD1 kaplı manyetik boncuklara komplekslenmiş rhPD-L1'e karşılaştırmalı bağlanması. Farklı tavşan poliklonal anti-PDL1-peptit antikorlarının rhPD-1 kaplı boncuklar yoluyla rhPD-L1'e bağlanmasını karşılaştırmak için parlak menekşe 421-konjuge ikincil tespit antikoru kullanıldı. BV421 mavi floresan sinyali, çift muhabir cihazının Muhabir Kanal 2'sine kaydedildi; bu sinyal, deneysel anti-PDL1-peptit antikorlarının nispi bağlanma etkinliği ile ilişkilidir. PD-1 / PD-L1'den farklı bir kontrol noktasını hedefleyen bir monoklonal antikor olan trastezumab (anti-HER2), negatif kontrol olarak kullanıldı. MFI, koşul başına çift reaksiyon kuyularında ölçülen ortalama boncuk medyan floresan yoğunluğunu temsil eder. Bu rakam Guo ve ark.14'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65467/65467fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Dört deneysel PDL1-Vaxx ile indüklenen aday antikorun rhPD-L1'i bağlama konusundaki nispi yetenekleri, cihazın ikinci raportör kanalında değerlendirilen ayrı bir tespit sistemi (BV421-konjuge anti-tavşan IgG) kullanılarak karşılaştırıldı. Bu sonuçlar, dört poliklonal anti-PDL1-peptit antikorunun tümünün konsantrasyona bağlı bir şekilde rhPD-L1'e bağlandığını göstermiştir14 (Şekil 3). Anti-PDL1 (130) antikoru, dört PDL1-Vaxx ile indüklenen antikor adayının en yüksek rhPDL1 bağlanma sinyalini gösterdi.

Watch this Scientific Journal Video about Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction at JoVE.com

Magnetic Fluorescent Bead-Based Dual-Reporter Flow Analysis of PDL1-Vaxx Peptide Vaccine-Induced Antibody Blockade of the PD-1/PD-L1 Interaction (Video) | JoVE

Kontrol noktası inhibitörleri, kansere karşı savaşa yönelik tedavilerin geliştirilmesinde önemli hedeflerdir. Bu rapor, PD-1/PDL1 kompleks oluşumunu bloke eden nötralize edici poliklonal antikor üretimini indükleyen yeni bir PDL1 peptit bazlı kanser aşısı olan PDL1-Vaxx'ı tanıtmaktadır. Bu çalışma aynı zamanda bu aktiviteyi analiz etmek için floresan boncuk bazlı bir tahlilin geliştirilmesini ve test edilmesini de detaylandırmaktadır.

PD-1/PD-L1 Etkileşiminin PDL1-Vaxx Peptit Aşısı ile İndüklenen Antikor Blokajının Manyetik Floresan Boncuk Tabanlı Çift Raportörlü Akış Analizi

The inhibition of checkpoint receptors (PD-1, PD-L1, and CTLA-4) with monoclonal antibodies has shown great benefit in clinical trials for treating cancer ...

Profesör Pravin Kaumaya liderliğindeki projemiz, kansere karşı daha iyi savaşmak için bağışıklık sistemini güçlendirmek için kullanılabilecek B hücreli epitop peptit aşıları geliştirmeye odaklanmıştır. Bağışıklık kontrol noktası hedeflerini hedefleyen peptit aşılarının, hasta sonuçlarını iyileştirmek için diğer tedavilerle bile birleştirilebileceğine inanıyoruz. Anti PD-L1 antikorlarımızın bloke etme yeteneğini, insan rekombinant PD-L1 proteininin MagPlex boncuklarına bağlandığı geleneksel bir mikroboncuk testinde test etmek istedik.PD-L1 boncuklara bağlandıktan sonra, PD-1 ligandı için düşük bir bağlanma kapasitesine sahip olduklarını bulduk. Bu, bu test engelleme yolunu kullanmamızı engelledi. Proteinin boncuklara bağlanması ligand veya antikorlara bağlanmayı inhibe ettiğinde, çözelti içindeki test antikorları ile ön işlem bir seçenektir, daha sonra hedef bloker karışımına ligand kaplı boncuklar eklenir.Etkileşimleri incelenebilir. Bu, aynı hedef-ligand-bağlanma etkileşimini incelemek için farklı bir yol olabilir B-Vaxx, PD1-Vaxx, PDL1-Vaxx ve CTLA4-Vaxx kanser aşılarını geliştirdik. Bu aşılar HER2'yi hedef alır ve çeşitli bağışıklık kontrol noktası belirteçleri çeşitli kanser türlerinde rol oynar.B-Vaxx ve PD1-Vaxx, Avustralya ve ABD'de devam eden klinik çalışmalardadır. Bağışıklık kontrol noktası aşılarımızın daha fazla hastaya fayda sağlayacağını umuyoruz. Önceki mikroküre deneylerinde, PD-1'in ligandı PD-L1 ile iyi etkileşime girdiğini bulduk. Bu nedenle, PD-1 etiketli MagPlex boncuklarını eklemeden önce anti-PD-L1 peptit antikorlarını biyotinile PD-L1 proteinine önceden bağlayarak protokolü yeniden tasarladık.Bu, antikorlarımızı PD-1 / PD-L1 etkileşimini bloke etme yetenekleri açısından test etmemizi sağladı. Tedavi direncinin üstesinden gelen kombinasyon immünoterapilerine odaklanmaya devam edeceğiz. Ayrıca tümör büyümesini daha iyi inhibe eden, metastazı önleyen ve hasta sağkalım oranlarını uzatan daha etkili kombinasyon tedavilerini keşfetmek istiyoruz.