Name: Author Spotlight: Establishing CENP-E Knockout HeLa Cells &#8211; A Novel Approach to Study Kinesin-7 CENP-E Biology and its Inhibitors
Uploaded: 2023-06-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System at JoVE.com

Wir danken allen Mitgliedern des Zytoskelett-Labors der Fujian Medical University für hilfreiche Gespräche. Wir danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin und Min-Xia Wu vom Public Technology Service Center der Fujian Medical University für ihre technische Unterstützung. Wir danken Si-Yi Zheng, Ying Lin und Qi Ke vom Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences an der Fujian Medical University für ihre Unterstützung. Diese Studie wurde durch die folgenden Zuschüsse unterstützt: National Natural Science Foundation of China (Fördernummer 82001608 und 82101678), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (Fördernummer 2019J05071), die Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, die Provinz Fujian, China (Fördernummer 2021Y9160) und das Fujian Medical University High-Level Talents Scientific Research Start-up Funding Project (Fördernummer XRCZX2017025).

1. Aufbau der CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Vektoren
<ol><li>Wählen Sie die genomische Ziel-DNA-Sequenz auf dem humanen CENP-E-Gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) und entwerfen Sie die sgRNA mit einem Online-CRISPR-Design-Tool (http://crispor.tefor.net/).</li>
	<li>Geben Sie eine einzelne genomische Sequenz ein, wählen Sie das Genom von "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" und wählen Sie das Protospacer-benachba...

Centromere-Associated Protein-E Gene Editing Using the CRISPR/Cas9 System

Kinesin-7 CENP-E ist ein wichtiger Regulator bei der Chromosomenausrichtung und dem Kontrollpunkt der Spindelassemblierung während der Zellteilung 17,19,20. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zur Aktivierung des Spindelmontage-Checkpoints, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod 27,29,51,52.<sup class="xref"...

Engineered Genome Editing vermittelt die gezielte Modifikation von Genen in einer Vielzahl von Zellen und Organismen. In Eukaryoten kann die ortsspezifische Mutagenese durch die Anwendung sequenzspezifischer Nukleasen eingeführt werden, die die homologe Rekombination der Ziel-DNAstimulieren 1. In den letzten Jahren wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs)2,3, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen (TALENs)4,5 und Homing-Meganukleasen 6,7, entwickelt, um Genome an bestimmten Stellen zu spalten, aber diese Ansätze erfordern komplexes Protein-Engineering und redundante experimentelle Verfahren. Studien haben gezeigt, dass das prokaryotische CRISPR/Cas-System (CRISPR)/Cas-System (Typ II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) eine effiziente Gen-Editing-Technologie ist, die spezifisch die RNA-gesteuerte, ortsspezifische DNA-Spaltung in einer Vielzahl von Zellen und Spezies vermittelt 8,9,10,11. Die CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Technologie hat die Bereiche Grundlagenbiologie, Biotechnologie und Medizin revolutioniert12.
Bakterien und die meisten Archaeen haben ein RNA-basiertes adaptives Immunsystem entwickelt, das CRISPR- und Cas-Proteine verwendet, um Viren und Plasmide zu identifizieren und zu zerstören13. Streptococcus pyogenes Die Cas9 (SpCas9)-Endonuklease enthält die RuvC-ähnliche Holliday-Junction-Resolvase (RuvC) und die His-Asn-His (HNH)-Domäne, die sequenzspezifische, doppelsträngige Brüche (DSBs) effizient vermitteln kann, indem sie eine synthetische Single-Guide-RNA (sgRNA) bereitstellt, die CRISPR-RNAs (crRNA) und transaktivierende crRNA (tracrRNA) enthält14,15,16. DSBs können über den Indel-bildenden nicht-homologen Endverknüpfungsweg (NHEJ) oder den homologiegesteuerten Reparaturweg (HDR) repariert werden, der mehrere Mutationen, einschließlich Insertionen, Deletionen oder narbenlose Einzelnukleotidsubstitutionen, in Säugetierzellen einführt 1,8. Sowohl der fehleranfällige NHEJ- als auch der High-Fidelity-HDR-Signalweg können verwendet werden, um Gen-Knockout durch Insertionen oder Deletionen zu vermitteln, was zu Frameshift-Mutationen und vorzeitigen Stoppcodons führen kann10.
Kinesin-7 CENP-E wird für die Kinetochor-Mikrotubuli-Bindung und die Chromosomenausrichtung während der Zellteilung benötigt 17,18,19. Antikörper-Mikroinjektion 20,21, siRNA-Depletion22,23, chemische Hemmung 24,25,26 und genetische Deletion 27,28,29 von CENP-E führt zu einer Chromosomenfehlstellung, der Aktivierung des Spindelanordnungs-Checkpoints und mitotischen Defekten, was zu Aneuploidie und chromosomaler Instabilität führt 19,30. Bei Mäusen führt die CENP-E-Deletion zu einer abnormalen Entwicklung und embryonalen Letalität in den sehr frühen Entwicklungsstadien 27,29,31. Die genetische Deletion von CENP-E führt in der Regel zu einer Chromosomenfehlstellung und zum Zelltod 26,27,29, was ein Hindernis für die Untersuchung der Funktionen und Mechanismen der CENP-E-Proteine darstellt.
Eine kürzlich durchgeführte Studie hat eine bedingte CENP-E-Knockout-Zelllinie unter Verwendung einer Auxin-induzierbaren CRISPR/Cas9-Gen-Editing-Methode32 etabliert, die einen schnellen Abbau von CENP-E-Proteinen in relativ kurzer Zeit ermöglicht33. Bisher wurden jedoch keine stabilen CENP-E-Knockout-Zelllinien etabliert, was eine ungelöste technische Herausforderung in der CENP-E-Biologie darstellt. Unter Berücksichtigung der genetischen Robustheit34, der genetischen Kompensationsreaktionen 35,36,37 und der komplexen intrazellulären Umgebungen, da die direkten Folgen einer vollständigen Deletion von CENP-E komplex und unvorhersehbar sein können, ist es wichtig, CENP-E-Knockout-Zelllinien für die Untersuchung von Mechanismen der Chromosomenausrichtung, des Spindelassemblierungs-Checkpoints und der nachgeschalteten Signalwege zu etablieren.
Die Entdeckung und Anwendung von CENP-E-Inhibitoren ist wichtig für die Krebsbehandlung. Bisher wurden sieben Arten von CENP-E-Inhibitoren gefunden und synthetisiert, darunter GSK923295 und seine Derivate24,25, PF-277138,39, Imidazo[1,2-a]pyridin-Gerüstderivate40,41, Compound-A42,43, Syntelin44,45, UA6278446 und Benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazol-Derivate47. Unter diesen Inhibitoren ist GSK923295 ein allosterischer und effizienter CENP-E-Inhibitor, der an die motorische Domäne von CENP-E bindet und die CENP-E-Mikrotubuli-stimulierte ATPase-Aktivität mit einem Ki von 3,2 ± 0,2 nMhemmt 24,25. Im Vergleich zu den hemmenden Wirkungen von GSK923295 auf kultivierte Krebszellen sind die therapeutischen Wirkungen von GSK923295 bei klinischen Krebspatienten jedoch nicht ideal48,49, was auch Bedenken hinsichtlich der Spezifität der GSK923295 für CENP-E aufkommen ließ. Darüber hinaus sind die Spezifität und die Nebenwirkungen anderer CENP-E-Inhibitoren auf die CENP-E-Proteine zentrale Themen in der Krebsforschung.
In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System vollständig ausgeschaltet. Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Phänotypen der Chromosomenausrichtung und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, um die Screening-Effizienz und Erfolgsrate der CENP-E-Geneditierung zu verbessern. Darüber hinaus können CENP-E-Knockout-Zelllinien verwendet werden, um die Spezifität von Kandidatenverbindungen für CENP-E zu testen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4S Gelred, 10,000x in water</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A616697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10009164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10000218</td>
			<td>Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A620014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0423</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0460</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrous ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>100092690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab254326</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376392</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133583</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-fade mounting medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0131</td>
			<td>Slowing down the quenching of fluorescent signals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-tubulin mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7291</td>
			<td>For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Biotek Epoch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>69003435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BpiI (BbsI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424BK745380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colchicine</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>61001563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica TCS SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80344-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent cells</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B528413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL2000 DNA marker</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>3427A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo-free plasmid mini kit <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/65476/65476eq02.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Zhejiang Tianhang Biotechnology</td>
			<td>11011-8611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentian violet</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>71019944</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa staining solution</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>71020260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism version 8.0 software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td>Statistical analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK923295</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10299</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td>HF90/HF240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Image processing and analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nanjing Jiangnan Novel Optics</td>
			<td>XD-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar powder</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>A507003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipo6000 transfection reagent</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Ti-S2 microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#160;reduced&#160;serum&#160;medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>80096618</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep column DNA gel extraction kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SanPrep&#160;column&#160;plasmid&#160;mini-preps&#160;kit</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai)</td>
			<td>B518191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2011A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaKaRa Ex Taq</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30188928</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>30189328</td>
			<td>Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of centromere-associated protein-e cenp-e-/- knockout cell lines using the crispr/cas9 system

Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9-System hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die präzise und effiziente Genbearbeitung in einer Vielzahl von Organismen entwickelt. Das Zentromer-assoziierte Protein-E (CENP-E) ist ein Plus-End-gerichtetes Kinesin, das für die Kinetochor-Mikrotubuli-Erfassung, die Chromosomenausrichtung und den Kontrollpunkt der Spindelassemblierung benötigt wird. Obwohl die zellulären Funktionen der CENP-E-Proteine gut untersucht wurden, war es schwierig, die direkten Funktionen von CENP-E-Proteinen mit herkömmlichen Protokollen zu untersuchen, da die CENP-E-Ablation in der Regel zur Aktivierung des Checkpoints der Spindelassemblierung, zum Zellzyklusarrest und zum Zelltod führt. In dieser Studie haben wir das CENP-E-Gen in humanen HeLa-Zellen vollständig ausgeschaltet und die CENP-E-/- HeLa-Zellen mit dem CRISPR/Cas9-System erfolgreich erzeugt.
Es wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter Zellkolonie-Screening, Chromosomenausrichtungsphänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-E-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate der CENP-E-Knockout-Zellen effektiv verbessern. Wichtig ist, dass die CENP-E-Deletion zu einer Chromosomenfehlstellung, der abnormalen Position der BUB1-mitotischen Checkpoint-Serin/Threonin-Kinase-B-Proteine (BubR1) und mitotischen Defekten führt. Darüber hinaus haben wir das CENP-E-Knockout-HeLa-Zellmodell verwendet, um eine Identifizierungsmethode für CENP-E-spezifische Inhibitoren zu entwickeln.
In dieser Studie wurde ein nützlicher Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität von CENP-E-Inhibitoren etabliert. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die Protokolle der CENP-E-Geneditierung mit dem CRISPR/Cas9-System vorgestellt, das ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen von CENP-E bei der Zellteilung sein könnte. Darüber hinaus würde die CENP-E-Knockout-Zelllinie zur Entdeckung und Validierung von CENP-E-Inhibitoren beitragen, die wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von Antitumormedikamenten, die Untersuchung von Zellteilungsmechanismen in der Zellbiologie und klinische Anwendungen haben.

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

Die CENP-E-/- HeLa-Zellen wurden erfolgreich mit dem CRISPR/Cas9-System erzeugt (Abbildung 1). Der Zeitplan und die kritischen experimentellen Schritte dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt. Zuerst haben wir die CENP-E-spezifischen sgRNAs entworfen und synthetisiert, die sgRNAs in das pX458-Plasmid getempert und ligiert, das Plasmid in HeLa-Zellen transfiziert und sie 48 h lang kultiviert. Die transfizierten Zellen wurden di...

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Author Spotlight: Establishing CENP-E Knockout HeLa Cells &#8211; A Novel Approach to Study Kinesin-7 CENP-E Biology and its Inhibitors

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

Erzeugung von Zentromer-assoziierten Protein-E CENP-E-/- Knockout-Zelllinien mit dem CRISPR/Cas9-System

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing ...

Die genetische Deletion von Kinesin-7 und CENP führt in der Regel zu einem Zellzyklusstillstand und Zelltod. Die Konstruktion stabiler CENP-Knockout-Zelllinien ist ein wichtiges ungelöstes Problem in der CENP-Biologie. In dieser Studie erzeugten wir CENP-Knockout-HeLa-Zellen mit einem CRISPR/Cas9-System und etablierten drei optimierte Screening-Strategien.In jüngster Zeit wurden mehrere Genom-Editing-Technologien, darunter Zinkfinger-Nukleasen, Transkriptionsaktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen und die Art und Weise, wie wir unsere Nukleasen herstellen, entwickelt, um Genome bei einer bestimmten Größe zu spalten. Die CRISPR/Cas9-Gen-Knockout-Technologie hat die Grundlagenbiologie, Biotechnologie und Medizin revolutioniert. CENP ist unerlässlich, um Kinetochore an Mikrotubuli zu binden und Chromosomen auszurichten.Die Störung von CENP, sei es durch Antikörper-Mikroinjektion, sgRNA-Deletion, chemische Hemmung oder genetische Deletion, führt zu Chromosomenfehlstellungen, mitotischen Defekten und oft zum Zelltod, was die Untersuchung der CENP-Proteinmechanismen erschwert. In dieser Studie wurden drei optimierte phänotypbasierte Screening-Strategien etabliert, darunter das Screening von Zellkolonien, die Chromosomenausrichtung von Phänotypen und die Fluoreszenzintensitäten von CENP-Proteinen, die die Screening-Effizienz und die experimentelle Erfolgsrate verbesserten. Wichtig ist, dass die CENP-Deletion zu einer Fehlausrichtung der Chromosomen, der abnormalen Position von BubR1-Proteinen und mitotischen Defekten führt.Die Interaktionsmodi und die molekularen Mechanismen von CENP und seinen Inhibitoren sind wichtige Forschungsfelder in der Zellbiologie und Krebsforschung. In dieser Studie wurde die CENP-Knockout-HeLa-Zelllinie als wertvolles Werkzeug zur Validierung der Spezifität und der Toxizität von CENP-Inhibitoren etabliert.