Name: Author Spotlight: Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00
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Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) número de subvención RGPIN-2020-06111 y por una generosa donación de Brad Lace. Nos gustaría agradecer a Wayne Parrott (Universidad de Georgia) por el K599 Agrobacterium y el protocolo preliminar, y al laboratorio Nakagawa & Hachiya (Universidad de Shimane) por los vectores vacíos pGWB2, pGWB6 y pANDA35HK.

NOTA: Se recomienda que todos los pasos del procedimiento se lleven a cabo en condiciones estériles.
1. Esterilización de semillas de soja
<ol><li>En un gabinete de bioseguridad, coloque 16-20 semillas de soja Williams 82 redondas en perfectas condiciones (es decir, sin grietas ni manchas) en un tubo de centrífuga de 50 ml.</li>
	<li>Agregue 30 ml de alcohol isopropílico al 70%, agite suavemente durante 30 s y luego decanta el alcohol.</li>
	<li>Agitar suavemente las sem...

High-Efficiency Production of Transgenic Soybean Hairy Roots

<ol>
	<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).</li><li>Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiosis+of+soybean+with+nitrogen+fixing+bacteria+affected+by+root+lesion+nematodes+in+a+density-dependent+manner.">Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner.</a> Scientific Reports. 10, 1619 (2020).</li><li>Huang, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizosphere+interactions:+root+exudates,+microbes,+and+microbial+communities.">Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities.</a> Botany. 92 (4), 267-275 (2014).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+and+applications+in+citrus.">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).</li><li>Hwang, H. -. H., Yu, M., Lai, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+biology+and+applications.">Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications.</a> The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+hairy+root+cultures:+prolific+possibilities.">The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li><li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+hairy+roots+produced+in+vitro+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation.">Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).</li><li>Song, J., T&#243;th, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+hairy+root+transformation:+a+rapid+and+highly+efficient+method.">Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method.</a> Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).</li><li>Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-&#946;-cyclodextrin+and+coronatine+as+new+elicitors+of+tropane+alkaloid+biosynthesis+in+Atropa+acuminata+and+Atropa+belladonna+hairy+root+cultures.">Methyl-&#946;-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures.</a> Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).</li><li>Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+biotic+and+chemical+elicitors+enable+additive+elicitation+of+the+anticancer+Phytoalexin+Glyceollin+I.">Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I.</a> Molecules. 22 (8), 1261 (2017).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+hairy+root+transformation+for+gene+functional+and+gene+editing+analysis+in+soybean.">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean.</a> Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).</li><li>Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation:+a+useful+tool+to+explore+gene+function+and+expression+in+Salix+spp.+recalcitrant+to+transformation.">Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).</li><li>Ahmed, S., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phytoalexin+biosynthesis+for+agriculture+and+human+health.">Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health.</a> Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).</li><li>Walker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceollins+trigger+anti-proliferative+effects+in+hormone-dependent+aromatase-inhibitor-resistant+breast+cancer+cells+through+the+induction+of+apoptosis.">Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+cucumopine-type+Agrobacterium+rhizogenes+strain+K599+(NCPPB2659),+a+nature's+genetic+engineer+inducing+hairy+roots.">The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots.</a> International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+dissects+incomplete+activation+of+phytoalexin+biosynthesis+by+the+soybean+transcription+factors+GmMYB29A2+and+GmNAC42-1.">RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1.</a> Plants. 12 (3), 545 (2023).</li><li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceollin+transcription+factor+GmMYB29A2+regulates+soybean+resistance+to+Phytophthora+sojae.">Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).</li><li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAC+family+transcription+factor+GmNAC42-1+regulates+biosynthesis+of+the+anticancer+and+neuroprotective+glyceollins+in+soybean.">The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean.</a> BMC Genomics. 20, 149 (2019).</li><li>Nguyen, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+uricase+and+xanthine+dehydrogenase+in+soybean+nitrogen+fixation+and+nodule+development.">Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development.</a> The Plant Genome. , e20171 (2021).</li><li>Brear, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GmVTL1a+is+an+iron+transporter+on+the+symbiosome+membrane+of+soybean+with+an+important+role+in+nitrogen+fixation.">GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation.</a> New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+transcription+factor+GmTGA15+enhances+drought+tolerance+in+transgenic+soybean+hairy+roots+and+Arabidopsis+plants.">Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants.</a> Agronomy. 11 (1), 170 (2021).</li><li>Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hairy+roots+on+cultivated+soybean+genotypes+and+their+use+to+propagate+the+soybean+cyst+nematode.">Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode.</a> Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).</li><li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+soybean+isoflavone+synthase+genes+leads+to+silencing+in+tissues+distal+to+the+transformation+site+and+to+enhanced+susceptibility+to+Phytophthora+sojae.">RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).</li><li>Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+prenylated+stilbenoids+arachidin-1+and+arachidin-3+and+their+semi-preparative+separation+and+purification+from+hairy+root+cultures+of+peanut+(Arachis+hypogaea+l.).">Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.).</a> Molecules. 27 (18), 6118 (2022).</li><li>Lozovaya, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflavonoid+accumulation+in+soybean+hairy+roots+upon+treatment+with+Fusarium+solani.">Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani.</a> Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).</li><li>Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+photoperiod+and+plant+growth+regulators+on+in+vitro+mass+bulblet+proliferation+of+Narcissus+tazzeta+L.+(Amaryllidaceae),+a+potential+source+of+galantamine.">Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine.</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).</li></ol>

Durante la última década, el método HR de soja se ha desarrollado como una poderosa herramienta para estudiar genes involucrados en la fijación de nitrógeno 22,23, tolerancia al estrés biótico y abiótico 24,25 y vías biosintéticas de metabolitos 26,27. El conocimiento de cómo las plantas producen metabolitos tiene una gran cantidad de b...

La soja (Glycine max) es uno de los cultivos más valiosos en la agricultura. Tiene miles de usos comerciales e industriales, como alimentos, piensos, aceite y como fuente de materias primas para la fabricación1. Su capacidad para formar una relación simbiótica con los microorganismos del suelo fijadores de nitrógeno, a saber, los rizobios, eleva aún más la importancia de estudiar la genética de la soja2. Por ejemplo, ajustar las propiedades de fijación de nitrógeno en las raíces de soja puede conducir a la reducción de las emisiones de carbono y reducir en gran medida los requisitos de fertilizante nitrogenado3. Por lo tanto, comprender la genética que controla aspectos de la biología de la raíz de la soja, en particular, tiene amplias aplicaciones en la agricultura y la industria. Teniendo en cuenta estos beneficios, es importante contar con un protocolo confiable para analizar la función de los genes de la soja.
Agrobacterium tumefaciens es quizás la herramienta más utilizada para la transformación genética de plantas, ya que tiene la capacidad de integrar el ADN de transferencia (ADN-T) en el genoma nuclear de muchas especies de plantas. Cuando Agrobacterium infecta una planta, transfiere el plásmido inductor de tumores (Ti) al cromosoma huésped, lo que lleva a la formación de un tumor en el sitio de la infección. La transformación mediada por Agrobacterium ha sido ampliamente utilizada durante décadas para el análisis funcional de genes y para modificar los rasgos de los cultivos4. Aunque cualquier gen de interés puede transferirse fácilmente a las células vegetales huésped a través de la transformación mediada por A. tumefaciens, este método tiene varios inconvenientes; Requiere mucho tiempo, es costoso y requiere una amplia experiencia para muchas especies de plantas, como la soja. Aunque algunas variedades de soja pueden ser transformadas por el enfoque de nodo cotiledonario utilizando A. tumefaciens, la ineficiencia de este enfoque requiere la necesidad de una tecnología alternativa de transformación genética que sea rápida y altamente eficiente 4,5. Incluso un no experto puede usar este método de transformación de raíz pilosa (HR) mediado por Agrobacterium rhizogenes para superar estas desventajas.
La transformación de HR es una herramienta relativamente rápida, no solo para analizar la función de los genes, sino también para aplicaciones biotecnológicas, como la producción de metabolitos especializados y productos químicos finos, y glicoproteínas bioactivas complejas6. La producción de HRs de soja no requiere una amplia experiencia, ya que pueden generarse hiriendo las superficies de los cotiledones, seguido de la inoculación con Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresa genes de virulencia (Vir) codificados por su plásmido Ti que transfieren, transportan e integran su segmento de ADN-T en el genoma de las células vegetales mientras estimulan simultáneamente el crecimiento de raíces ectópicas8.
En comparación con otros sistemas de expresión génica de soja, como los biolistics o la transformación de tejidos, células y cultivos de órganos basados en A. tumefaciens, el sistema de expresión de HR exhibe varias ventajas. En primer lugar, los HR son genéticamente estables y se producen rápidamente en medios libres de hormonas 1,9,10. Además, los HR pueden producir metabolitos especializados en cantidades equivalentes o mayores que las raíces nativas11,12. Estas ventajas hacen de los HR una herramienta biotecnológica deseable para especies vegetales que son incompatibles con A. tumefaciens o que requieren condiciones especiales de cultivo de tejidos para formar tejidos compatibles. El método HR es un enfoque eficiente para analizar las interacciones proteína-proteína, la localización subcelular de proteínas, la producción de proteínas recombinantes, la fitorremediación, la mutagénesis y los efectos de todo el genoma utilizando la secuenciación de ARN13,14,15. También puede ser utilizado para estudiar la producción de metabolitos especializados que tienen valor en la industria, incluyendo glicomolinas, que medican la defensa de la soja contra el importante patógeno microbiano Phytophthora sojae y tienen impresionantes actividades anticancerígenas y neuroprotectoras en humanos16,17.
Este informe demuestra un protocolo fácil y eficiente para producir HR de soja. En comparación con los métodos anteriores de transformación de HR, este protocolo proporciona una mejora significativa (33% -50%) en la tasa de formación de HR mediante la preselección de transformadores de A. rhizogenes para detectar la presencia del plásmido Ti antes de inocular cotiledones de soja. Demostramos la aplicabilidad de este protocolo transformando varios vectores binarios que sobreexpresan o silencian los genes del factor de transcripción de soja.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>lavo</td>
			<td>21124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>195679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelzan</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>HYY3251089A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>HHA0397050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>SQS0378007G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB powder</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>200318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS powder</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>2210001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>194171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>192946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-11</td>
			<td>100 mm x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphinothricin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>P034-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REDExtract-N-Amp PCR Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>2D76475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>12222002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>2211010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

soybean hairy root transformation for the analysis of gene function

La soja (Glycine max) es un cultivo valioso en la agricultura que tiene miles de usos industriales. Las raíces de soja son el sitio principal de interacción con los microbios transmitidos por el suelo que forman simbiosis para fijar nitrógeno y patógenos, lo que hace que la investigación que involucra la genética de la raíz de soja sea de suma importancia para mejorar su producción agrícola. La transformación genética de las raíces peludas de soja (HRs) está mediada por la cepa NCPPB2659 de Agrobacterium rhizogenes (K599) y es una herramienta eficiente para estudiar la función génica en las raíces de soja, tomando solo 2 meses de principio a fin. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe el método para sobreexpresar y silenciar un gen de interés en las HR de soja. Esta metodología incluye la esterilización de semillas de soja, la infección de cotiledones con K599 y la selección y recolección de HR genéticamente transformadas para el aislamiento de ARN y, si se justifica, análisis de metabolitos. El rendimiento del enfoque es suficiente para estudiar simultáneamente varios genes o redes y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estables a largo plazo.

Soybean (Glycine max) is among the most valuable crops in agriculture. It has thousands of commercial and industrial uses, such as food, animal feed, oil, and as a source of raw materials for manufacturing1. Its ability to form a symbiotic relationship with nitrogen-fixing soil microorganisms, namely rhizobia, further elevates the importance of studying soybean genetics2. For instance, fine-tuning nitrogen fixation properties in soybean roots can lead to the reduction of carbon emissions and greatly reduce requirements for nitrogen fertilizer3. Thus, understanding the genetics that controls aspects of soybean root biology, in particular, has wide applications in agriculture and industry. Considering these benefits, it is important to have a reliable protocol to analyze the function of soybean genes.
Agrobacterium tumefaciens is perhaps the most commonly used tool for plant genetic transformation as it has the capability of integrating transfer DNA (T-DNA) into the nuclear genome of many plant species. When Agrobacterium infects a plant, it transfers the tumor-inducing (Ti) plasmid into the host chromosome, leading to the formation of a tumor at the infection site. The Agrobacterium-mediated transformation has been widely used for decades for gene functional analysis and in order to modify crop traits4. Although any gene of interest can be readily transferred into host plant cells through A. tumefaciens-mediated transformation, this method has several drawbacks; it is time-consuming, expensive, and requires extensive expertise for many plant species, such as soybean. Although a few varieties of soybean can be transformed by the cotyledonary node approach using A. tumefaciens, the inefficiency of this approach necessitates the need for an alternative genetic transformation technology that is rapid and highly efficient4,5. Even a non-expert can use this Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root (HR) transformation method to overcome these disadvantages.
HR transformation is a relatively fast tool, not only for analyzing gene function, but also for biotechnological applications, such as the production of specialized metabolites and fine chemicals, and complex bioactive glycoproteins6. The production of soybean HRs does not require extensive expertise, as they can be generated by wounding the surfaces of cotyledons, followed by inoculation with Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresses virulence (Vir) genes encoded by its Ti plasmid that transfer, carry, and integrate its T-DNA segment into the genome of plant cells while simultaneously stimulating ectopic root growth8.
Compared to other soybean gene&#160;expression systems, such as biolistics or A. tumefaciens-based transformation of tissue, cell, and organ culture, the HR expression system exhibits several advantages. Firstly, HRs are genetically stable and produced quickly on hormone-free media1,9,10. Additionally, HRs can produce specialized metabolites in amounts equivalent to or greater than native roots11,12. These advantages make HRs a desirable biotechnological tool for plant species that are incompatible with A. tumefaciens or that require special tissue culture conditions to form compatible tissues. The HR method is an efficient approach for analyzing protein-protein interactions, protein subcellular localization, recombinant protein production, phytoremediation, mutagenesis, and genome wide effects using RNA sequencing13,14,15. It can also be used to study the production of specialized metabolites that have value in the industry, including glyceollins, which medicate soybean&#39;s defense against the important microbial pathogen Phytophthora sojae and have impressive anticancer and neuroprotective activities in humans16,17.
This report demonstrates an easy, efficient protocol to produce soybean HRs. Compared to previous HR transformation methods, this protocol provides a significant (33%-50%) improvement in the rate of HR formation by prescreening A. rhizogenes transformants for the presence of the Ti plasmid prior to inoculating soybean cotyledons. We demonstrate the applicability of this protocol by transforming several binary vectors that overexpress or silence soybean transcription factor genes.

Author Spotlight: Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function  

Transformación de la raíz peluda de soja para el análisis de la función génica

Los resultados representativos provienen de los datos publicados19,20. Los resultados de la PCR de colonias (cPCR) de la K599 Agrobacterium transformada se muestran en la Figura 1. Como indican las colonias positivas en la Figura 1, el gen de interés fue detectado por cPCR (Figura 1A). Sin embargo, entre un tercio y la mitad de las colonias fueron negativas para el...

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Aquí, presentamos un protocolo para la producción de alta eficiencia de raíces peludas de soja transgénica.

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Nuestro método de transformación de raíces peludas de soja es suficiente para estudiar simultáneamente las funciones de varios genes o redes, y podría determinar las estrategias de ingeniería óptimas antes de comprometerse con enfoques de transformación estable a largo plazo. La transformación de la raíz peluda de la soja es una herramienta útil para el análisis de la función génica en las plantas de soja. La tecnología que se utiliza actualmente incluye la edición del genoma CRISPR-Cas9, la interferencia de ARN, la transcriptómica y la proteómica, y las tecnologías de imagen.El principal desafío en la era del modelo de genómica funcional es suficiente analizar la función de numerosos genes. La mayoría de los genes son poligénicos, siendo logrados por la interacción de muchos genes. Nuestro protocolo de raíz peluda facilitará el análisis de la función génica con suficiente rendimiento, para que las redes poligénicas puedan comenzar a comprenderse.Hemos establecido la importancia del plásmido Ti en cepas de agrobacterium rhizogene. Encontramos que sin la detección del plásmido Ti, aumentó el riesgo de que el cotiledón de soja transformado no produzca ningún colorante. Como resultado, la detección del plásmido se convirtió en un paso vital antes de la transformación.En comparación con otras técnicas de expresión génica, nuestro sistema de expresión de raíces capilares es fácil de manejar, consume menos tiempo y es rentable. Además, nuestro nuevo protocolo ha mejorado la tasa de transformación de la raíz peluda hasta en un 50% al verificar el plásmido Ti y la agrobacteria antes de la transformación del cotiledón. Al caracterizar la función de más de una docena de genes de factores de transcripción, nuestros resultados recientes han allanado el camino para estudios de ingeniería multigénica, destinados a desbloquear la biosíntesis de valiosos metabolitos de fitoalexina en plantas.En el futuro, utilizaremos este método de transformación de raíces peludas para diseccionar las redes de genes del factor de transcripción que regulan la biosíntesis de fitoalexinas. El enfoque podría utilizarse para mejorar la producción de estos metabolitos especializados para las industrias farmacéutica y agrícola.