Name: Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-23T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function at JoVE.com

Queremos agradecer a la clínica de Andrología Fertilab, especialmente a José María Montes y Andrea Torrents, por permitirnos el acceso a los donantes. Financiamiento: A.C. cuenta con el apoyo de becas de la Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Se obtuvo financiamiento adicional del Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Uruguay). P.I. y R.S. cuentan con el apoyo de la Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 y FMV_1_2017_1_136490 ANII- Uruguay). P.I. cuenta con el apoyo de POS_FMV_2018_1_1007814 y CAP-UDELAR 2020. Las figuras se ilustraron con Biorender.com.

Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para la respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos intactos y permeabilizados. El protocolo se d...

Determining Respiration in Human Sperm Cells by High-Resolution Respirometry

<ol>
	<li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe.">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).</li><li>Guzick, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+morphology,+motility,+and+concentration+in+fertile+and+infertile+men.">Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men.</a> The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1388-1393 (2001).</li><li>Wang, C., Swerdloff, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+semen+analysis+as+a+test+of+male+fertility+and+anticipated+needs+from+newer+tests.">Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1502-1507 (2014).</li><li>Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+mammalian+sperm+motility.">Energy metabolism in mammalian sperm motility.</a> WIREs Mechanisms of Disease. 14 (5), e1569 (2022).</li><li>Leung, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+structures+of+conserved+supramolecular+protein+arrays+at+the+mitochondria-cytoskeleton+interface+in+mammalian+sperm.">In-cell structures of conserved supramolecular protein arrays at the mitochondria-cytoskeleton interface in mammalian sperm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (45), e2110996118 (2021).</li><li>Moraes, C. R., Meyers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sperm+mitochondrion:+Organelle+of+many+functions.">The sperm mitochondrion: Organelle of many functions.</a> Animal Reproduction Science. 194, 71-80 (2018).</li><li>Cassina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+human+sperm+cells+are+associated+with+mitochondrial+dysfunction+and+oxidant+production.">Defective human sperm cells are associated with mitochondrial dysfunction and oxidant production.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 119 (2015).</li><li>Marchetti, C., Obert, G., Deffosez, A., Formstecher, P., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+mitochondrial+membrane+potential,+reactive+oxygen+species,+DNA+fragmentation+and+cell+viability+by+flow+cytometry+in+human+sperm.">Study of mitochondrial membrane potential, reactive oxygen species, DNA fragmentation and cell viability by flow cytometry in human sperm.</a> Human Reproduction. 17 (5), 1257-1265 (2002).</li><li>Amaral, A., Louren&#231;o, B., Marques, M., Ramalho-Santos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+functionality+and+sperm+quality.">Mitochondria functionality and sperm quality.</a> Reproduction. 146 (5), R163-R174 (2013).</li><li>Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+sperm+mitochondrial+dysfunction.">Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction.</a> Andrologia. 53 (1), e13666 (2021).</li><li>Uribe, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+fluorescent+dye+tetramethylrhodamine+methyl+ester+perchlorate+for+mitochondrial+membrane+potential+assessment+in+human+spermatozoa.">Use of the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester perchlorate for mitochondrial membrane potential assessment in human spermatozoa.</a> Andrologia. 49 (9), e12753 (2017).</li><li>Storey, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+sperm+metabolism:+Oxygen+and+sugar,+friend+and+foe.">Mammalian sperm metabolism: Oxygen and sugar, friend and foe.</a> The International Journal of Developmental Biology. 52 (5-6), 427-437 (2008).</li><li>Tourmente, M., Sansegundo, E., Rial, E., Roldan, E. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitation+promotes+a+shift+in+energy+metabolism+in+murine+sperm.">Capacitation promotes a shift in energy metabolism in murine sperm.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 950979 (2022).</li><li>Gnaiger, E., Dykens, J. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12+-+Polarographic+oxygen+sensors,+the+oxygraph,+and+high-resolution+respirometry+to+assess+mitochondrial+function.">Chapter 12 - Polarographic oxygen sensors, the oxygraph, and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function.</a> Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 325-352 (2008).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Awadhpersad, R., Jackson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry+to+assess+bioenergetics+in+cells+and+tissues+using+chamber-+and+plate-based+respirometers.">High-resolution respirometry to assess bioenergetics in cells and tissues using chamber- and plate-based respirometers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e63000 (2021).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+assay+of+oxidative+phosphorylation.">A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).</li><li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode.">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li><li>Stendardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mitochondrial+respiratory+efficiency+during+in+vitro+capacitation+of+human+spermatozoa.">Evaluation of mitochondrial respiratory efficiency during in vitro capacitation of human spermatozoa.</a> International Journal of Andrology. 34 (3), 247-255 (2011).</li><li>Ferramosca, A., Focarelli, R., Piomboni, P., Coppola, L., Zara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+uptake+by+mitochondria+in+demembranated+human+spermatozoa:+A+reliable+tool+for+the+evaluation+of+sperm+respiratory+efficiency.">Oxygen uptake by mitochondria in demembranated human spermatozoa: A reliable tool for the evaluation of sperm respiratory efficiency.</a> International Journal of Andrology. 31 (3), 337-345 (2008).</li><li>Ferramosca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+human+sperm+mitochondrial+respiration+efficiency+by+plant+polyphenols.">Modulation of human sperm mitochondrial respiration efficiency by plant polyphenols.</a> Antioxidants. 10 (2), 217 (2021).</li><li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., M&#233;ndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen.">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 27 (6), 583-596 (1995).</li><li>. O2k Quality Control 1: Polarographic oxygen sensors and accuracy of calibration Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf">https://www.bioblst.at/images/archive/7/77/20210819114548%21MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP.pdf</a> (2020)</li><li>WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787">https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787</a> (2010)</li><li>. O2k-protocols SOP: O2k quality control 1 Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf">https://www.bioblast.at/images/9/9c/MiPNet06.03_POS-Calibration-SOP_DatLab8.pdf</a> (2021)</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. , (2012).</li><li>Steinlechner-Maran, R., Eberl, T., Kunc, M., Margreiter, R., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+dependence+of+respiration+in+coupled+and+uncoupled+endothelial+cells.">Oxygen dependence of respiration in coupled and uncoupled endothelial cells.</a> The American Journal of Physiology. 271, C2053-C2061 (1996).</li><li>Holt, W. V., Van Look, K. J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sperm+heterogeneity,+sperm+selection+and+sperm+competition+as+biological+foundations+for+laboratory+tests+of+semen+quality.">Concepts in sperm heterogeneity, sperm selection and sperm competition as biological foundations for laboratory tests of semen quality.</a> Reproduction. 127 (5), 527-535 (2004).</li><li>Sousa, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+all+sperm+are+equal:+Functional+mitochondria+characterize+a+subpopulation+of+human+sperm+with+better+fertilization+potential.">Not all sperm are equal: Functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential.</a> PloS One. 6 (3), e18112 (2011).</li><li>Moscatelli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-based+evaluation+of+sperm+progressive+motility+via+fluorescent+assessment+of+mitochondria+membrane+potential.">Single-cell-based evaluation of sperm progressive motility via fluorescent assessment of mitochondria membrane potential.</a> Scientific Reports. 7, 17931 (2017).</li><li>Ferreira, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+mitochondrial+activity+upon+CatSper+channel+activation+is+required+for+mouse+sperm+capacitation.">Increased mitochondrial activity upon CatSper channel activation is required for mouse sperm capacitation.</a> Redox Biology. 48, 102176 (2021).</li><li>Irigoyen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+metabolism+determines+the+functional+status+of+human+sperm+and+correlates+with+semen+parameters.">Mitochondrial metabolism determines the functional status of human sperm and correlates with semen parameters.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 926684 (2022).</li></ol>

La HRR depende críticamente de varios pasos: (a) el mantenimiento del equipo, (b) la calibración precisa de los sensores de oxígeno, (c) la valoración del desacoplador26 y, finalmente, (d) el uso adecuado de índices representativos de la función mitocondrial. El mantenimiento del equipo es crucial. Se recomienda reemplazar las membranas del sensor polarográfico de oxígeno con regularidad y corregir el fondo instrumental. El lavado exhaustivo después de la recolección de espermatozoides d...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result&#160;sections were&#160;updated.
Step 2.4.12 of the Protocol was updated from:
Finally, inject 1 &#181;L of 5 mM antimycin A (2.5 &#181;M final concentration). This is a complex II inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 &#181;L of 1 mM rotenone (0.5 &#181;M final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
to:
Finally, inject 1 &#181;L of 5 mM antimycin A (2.5 &#181;M final concentration). This is a complex III inhibitor to discriminate between the mitochondrial and residual oxygen consumption (non-mitochondrial respiration). For the analysis of complex I, add 1 &#181;L of 1 mM rotenone (0.5 &#181;M final concentration), an inhibitor of this complex, instead of AA. Measure the oxygen consumption until the signal decreases and stabilizes.
Figure 3 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig03.jpg" /> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 &#176;C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means &#177; standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Determination of the optimal concentration of digitonin for the permeabilization of human sperm cells. The respiration rates were measured at 37 &#176;C in MRM medium with glutamate, malate, and adenosine diphosphate. (A) Representative respiratory trace. The blue line is the O2 concentration, and the red line represents the O2 flow per volume correlated. (B) Mitochondria respiration rate means &#177; standard error, n = 4. The red arrow represents the optimal concentration. Abbreviation: dig = digitonin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65493/65493fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65493">High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa</a>. The Protocol and Representative Result&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Se estima que la infertilidad masculina representa entre el 40% y el 50% de todos los casos de infertilidad en las parejas1. El análisis de semen convencional juega un papel crucial en la determinación de la fertilidad masculina; sin embargo, aproximadamente el 15% de los hombres infértiles tienen parámetros espermatozoides normales2. Además, el análisis rutinario del semen proporciona información limitada sobre la función de los espermatozoides y no refleja defectos sutiles de los espermatozoides3.
Las mitocondrias de los espermatozoides tienen una estructura especial, ya que están dispuestas como una vaina helicoidal alrededor de los flagelos. La vaina mitocondrial contiene un número variable de mitocondrias conectadas por enlazadores intermitocondriales y ancladas al citoesqueleto mediante disposiciones proteicas ordenadas en la membrana mitocondrial externa 4,5. Esta estructura hace que sea particularmente difícil aislar las mitocondrias de los espermatozoides. Por lo tanto, la mayoría de los estudios de la función mitocondrial de los espermatozoides utilizan análisis in situ o espermatozoides desembranados6.
La estructura y función mitocondrial de los espermatozoides se ha relacionado consistentemente con la infertilidad masculina 7,8,9,10,11, lo que sugiere que el análisis de la estructura y función de estos orgánulos puede ser un buen candidato para su inclusión en el análisis de espermatozoides.
Las mitocondrias desempeñan un papel importante en el metabolismo energético celular, en particular mediante el uso de oxígeno para producir trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). En los espermatozoides, en particular, la fuente de ATP (glucólisis vs. OXPHOS) es discutida, y gran parte de los datos siguen siendo controvertidos y dependen de diferentes enfoques experimentales 4,12,13. Las mediciones de la respiración por oximetría ofrecen información significativa sobre la capacidad respiratoria mitocondrial, la integridad mitocondrial y el metabolismo energético de la célula14,15,16. Tradicionalmente, esta técnica se ha realizado utilizando el electrodo de oxígeno Clark, un instrumento que se ha utilizado para medir la respiración mitocondrial durante más de 50 años17,18. Además, se ha analizado el consumo de oxígeno mitocondrial de los espermatozoides utilizando el electrodo de oxígeno clásico de Clark 19,20,21. La respirometría de alta resolución (HRR) con oxígrafos (Oroboros) proporciona una mayor sensibilidad que con los dispositivos de respirometría clásicos22. Los oxígrafos están compuestos por dos cámaras con puertos de inyección, y cada cámara tiene un sensor polarográfico de oxígeno. Con esta técnica, es posible analizar portaobjetos de tejidos, células y suspensiones mitocondriales aisladas. La muestra se agita continuamente en la cámara y, durante el experimento, se mide el consumo de oxígeno y se calculan las tasas de oxígeno utilizando un software específico. Las cámaras muestran una fuga de oxígeno reducida, lo que es una ventaja sobre los dispositivos convencionales de electrodos de oxígeno14,23.
Al igual que ocurre con otras células, en el caso de los espermatozoides, la sensibilidad de los equipos de HRR es mayor que la de la respirometría convencional, por lo que los equipos de HRR pueden utilizarse para el análisis de un número limitado de espermatozoides intactos o permeabilizados. Existen dos estrategias principales para evaluar la función mitocondrial de los espermatozoides mediante HRR: (a) medir el consumo de oxígeno en células intactas, lo que implica reproducir la función respiratoria en un medio que contiene sustratos como la glucosa, o (b) medir el consumo de oxígeno en células permeabilizadas utilizando uno de los complejos OXPHOS, con la adición de sustratos específicos para monitorizar cada función por separado.
En el presente estudio, describimos el uso de HRR para determinar la respiración mitocondrial en espermatozoides humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid free- Bovine serum albumine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DatLab sofware version 4,2</td>
			<td>Oroboros Instruments GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L malic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87900 or 80400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Basler</td>
			<td>acA780-75gc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monopotassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2 K</td>
			<td>Oroboros Instruments GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power O2k-Respirometer</td>
			<td>Oroboros Intruments</td>
			<td>10033-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lactate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research</td>
			<td>Microptic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sperm Counting Chamber DRM-600</td>
			<td>Millennium Sciences CELL-VU</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate disodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution respirometry to assess mitochondrial function in human spermatozoa

La calidad del semen a menudo se estudia mediante análisis de semen de rutina, que es descriptivo y a menudo no concluyente. La infertilidad masculina se asocia con una alteración de la actividad mitocondrial de los espermatozoides, por lo que la medición de la función mitocondrial de los espermatozoides es un indicador de la calidad del esperma. La respirometría de alta resolución es un método para medir el consumo de oxígeno de células o tejidos en un sistema de cámara cerrada. Esta técnica se puede implementar para medir la respiración en espermatozoides humanos y proporciona información sobre la calidad e integridad de las mitocondrias de los espermatozoides. La respirometría de alta resolución permite que las células se muevan libremente, lo que supone una ventaja a priori en el caso de los espermatozoides. Esta técnica se puede aplicar con espermatozoides intactos o permeabilizados y permite el estudio de la función mitocondrial de los espermatozoides intactos y la actividad de los complejos de cadenas respiratorias individuales. El instrumento oxígrafo de alta resolución utiliza sensores para medir la concentración de oxígeno junto con un software sensible para calcular el consumo de oxígeno. Los datos se utilizan para calcular los índices respiratorios en función de los índices de consumo de oxígeno. En consecuencia, los índices son las proporciones de dos tasas de consumo de oxígeno y se normalizan internamente al número de células o masa proteica. Los índices respiratorios son un indicador de la función y disfunción mitocondrial de los espermatozoides.

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Determinación de la concentración óptima de digitonina en los espermatozoides En este protocolo, presentamos el uso de HRR para monitorizar en tiempo real los cambios en OXPHOS en espermatozoides humanos. Dado que el método se puede utilizar para analizar espermatozoides intactos o permeabilizados con digitonina, primero presentamos la estandarización de la concentración de digitonina necesaria para permeabilizar los espermatozoides (Figura 3).
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Advancing Male Infertility Research by Unraveling Sperm Metabolism and Mitochondrial Function (Video) | JoVE

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

Nuestro trabajo se centra en la infertilidad masculina, concretamente en las mitocondrias espermáticas. Los espermatozoides pierden la mayor parte de su citoplasto y orgánulos durante la espermatogénesis, pero conservan las mitocondrias. Además de su papel principal en la producción de ATP, las mitocondrias participan en la producción de especies reactivas de oxígeno, el almacenamiento de calcio y la apoptosis.El papel de las mitocondrias de los espermatozoides no se comprende completamente. Comprender la función de las mitocondrias en los espermatozoides es clave para esclarecer el metabolismo energético de los espermatozoides y la infertilidad masculina. Hemos demostrado que la función mitocondrial de los espermatozoides humanos se correlaciona con los parámetros del espermiograma.Nuestro grupo demuestra que las mitocondrias son la principal fuente de superóxido en condiciones normales y patológicas. Además, hemos podido establecer valores de corte metabólico mediante respirometría de alta resolución que permite diferenciar entre varones con espermiograma anormal y normal. El espermiograma es el estudio de laboratorio de referencia para analizar la infertilidad masculina.Proporciona mucha información, pero no refleja los defectos septales de los espermatozoides. Aunque se han propuesto muchos estudios, en la actualidad, la medición de la función mitocondrial no está incluida en el estudio. La respirometría de alta resolución tiene una sensibilidad más alta que los electrodos Clark convencionales.Con este enfoque experimental, podemos analizar cada paso de la actividad mitocondrial. Determinamos la producción de ATP, la capacidad de reserva respiratoria y el estado de cumplimiento. Además, nos permite estudiar la suspensión experimental sin afectar el movimiento y la función.