Name: A Comprehensive Protocol for Acinetobacter Biofilm Quantification, Assessment, and Visualization (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-08-04T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Comprehensive Protocol for Acinetobacter Biofilm Quantification, Assessment, and Visualization at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata dal Main Research Program (E0210702-03) del Korea Food Research Institute (KFRI), finanziato dal Ministero della Scienza e delle TIC.

1. Preparazione dell'inoculo batterico
<ol><li>Rimuovere il flaconcino di glicerolo conservato a -80 °C.</li>
	<li>Rimuovere il ceppo batterico (2-10 μL) dal flaconcino utilizzando un puntale sterile per pipetta. NOTA: In questo protocollo vengono utilizzati ceppi di Acinetobacter, A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) e A. ursingii (24-1). </li>
	<li>Inoculare una...

Assessment of Acinetobacter Biofilm Formation and Characterization of Biofilms

<ol>
	<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+pathophysiological+overview+of+Acinetobacter+infections:+a+century+of+challenges.">Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges.</a> Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).</li><li>Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+spp.+in+food+and+drinking+water+-+A+review.">Acinetobacter spp. in food and drinking water - A review.</a> Food Microbiology. 95, 103675 (2021).</li><li>Towner, K. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).</li><li>Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+microbial+&amp;#34;protective+clothing&amp;#34;+in+extreme+environments.">Biofilms: the microbial &amp;#34;protective clothing&amp;#34; in extreme environments.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).</li><li>Gedefie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilm+formation+and+its+role+in+disease+pathogenesis:+a+review.">Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review.</a> Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).</li><li>Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii.">Acinetobacter baumannii.</a> Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).</li><li>Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii.</a> New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+characteristics+and+transcriptomic+profiling+of+Acinetobacter+johnsonii+defines+signatures+for+planktonic+and+biofilm+cells.">Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells.</a> Environmental Research. 213, 113714 (2022).</li><li>Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+in+Acinetobacter+baumannii:+genotype-phenotype+correlation.">Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation.</a> Molecules. 24 (10), 1849 (2019).</li><li>Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-formation+in+clonally+unrelated+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+isolates.">Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates.</a> Pathogens. 9 (8), 630 (2020).</li><li>Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+Acinetobacter+and+Bacillus+for+Escherichia+coli+O157:H7+in+biofilms+against+sodium+hypochlorite+and+extracellular+matrix-degrading+enzymes.">Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes.</a> Food Microbiology. 109, 104125 (2023).</li><li>Stepanovi&#263;, S., &#262;irkovi&#263;, I., Ranin, L., Svabi&#263;-Vlahovi&#263;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+Salmonella+spp.+and+Listeria+monocytogenes+on+plastic+surface.">Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface.</a> Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).</li><li>Boone, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+virulence+phenotypes+and+antibiotic+resistance+in+clinical+strains+of+Acinetobacter+baumannii+isolated+in+Nashville,+Tennessee.">Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee.</a> BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).</li><li>Otter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-attached+cells,+biofilms+and+biocide+susceptibility:+implications+for+hospital+cleaning+and+disinfection.">Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection.</a> Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).</li><li>Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. 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J., Actis, L., Pach&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+human+infections,+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models.">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).</li><li>McQueary, C. N., Actis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+biofilms:+variations+among+strains+and+correlations+with+other+cell+properties.">Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties.</a> The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).</li></ol>

Utilizzando il protocollo descritto, è stata misurata, visualizzata la formazione di biofilm di isolati di Acinetobacter con vari gradi e sono state stimate le cellule vitali nei biofilm (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
In questo protocollo sono state utilizzate due diverse temperature, 30 °C per la crescita e 25 °C per la formazione del biofilm di Acinetobacter. È stata utilizzata u...

È noto che l'Acinetobacter causa infezioni nosocomiali e la sua infezione umana, soprattutto nelle strutture sanitarie, è sempre più segnalata1. È diffuso negli ospedali, nelle strutture sanitarie e negli ambienti associati al cibo 2,3,4. Può sopravvivere per un lungo periodo in ambienti come le superfici ospedaliere come le sponde dei letti, i comodini, la superficie dei ventilatori e i lavandini4. Tale persistenza sulle superfici ambientali può essere uno dei fattori significativi che contribuiscono alle infezioni nosocomiali di Acinetobacter4.
Il biofilm è una forma di vita microbica ed è una matrice microbica composta da cellule microbiche vive e sostanze polimeriche extracellulari (EPS) provenienti dalle cellule5. Le cellule microbiche sono incorporate nella matrice e sono spesso altamente resistenti agli stress ambientali come calore, sali, secchezza, antibiotici, disinfettanti e forze di taglio 6,7.
L'Acinetobacter può formare biofilm sulle superfici, suggerendo che può contribuire a prolungare la sopravvivenza sulle superfici ambientali, comprese le superfici ospedaliere, e a migliorare la resistenza al trattamento antibiotico 8,9. Inoltre, la formazione di biofilm di Acinetobacter potrebbe essere altamente associata agli esiti clinici nell'uomo8. Pertanto, la formabilità del biofilm dei ceppi di Acinetobacter potrebbe essere uno degli indicatori nel predire la sopravvivenza ambientale e le infezioni umane 8,10.
I biofilm attaccati alla superficie possono essere quantificati e visualizzati per valutare la formabilità del biofilm. Per quantificare i biofilm attaccati alla superficie, i biofilm vengono normalmente colorati con coloranti coloranti per biofilm come il crystal violet e i coloranti vengono eluiti in soluzione e misurati per la densità ottica11. La visualizzazione dei biofilm è un altro buon approccio per valutare la formabilità del biofilm11. Il metodo di visualizzazione della microscopia laser a scansione confocale (CLSM) che impiega la specificità utilizzando coloranti fluorescenti potrebbe essere più utile per caratterizzare la morfologia del biofilm rispetto ad altre tecniche come SEM12,13.
Le cellule vitali nei biofilm possono essere contate per stimare il numero di cellule vitali nei biofilm11. Le cellule vitali incorporate nei biofilm vengono staccate, diluite, distribuite su piastre di agar, incubate ed enumerate. Poiché è probabile che il numero maggiore di cellule soddisfi la dose infettiva, può fornire informazioni più dettagliate sui biofilm, come i potenziali di infezione associati al numero di cellule13,14.
Questo articolo presenta protocolli passo-passo per (1) quantificare i biofilm attaccati alla superficie, (2) contare le cellule vitali nei biofilm e (3) visualizzare i biofilm utilizzando il CLSM di Acinetobacter. I protocolli presentati descrivono i metodi per valutare la formabilità del biofilm degli isolati di Acinetobacter e caratterizzare i loro biofilm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well cell culture plate</td>
			<td>SPL</td>
			<td>30096</td>
			<td>Polystyrene 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI (Brain Heart Infusion) broth</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1.10493.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Agar Base Plate</td>
			<td>KisanBio</td>
			<td>MB-B1005-P50</td>
			<td>Growth media for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHROMagar Acinetobacter</td>
			<td>CHROMagar</td>
			<td>AC092</td>
			<td>Selective plate for Acinetobacter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V5265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L10316</td>
			<td>SYTO9 and propidium iodide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 PRO NanoQuant</td>
			<td>Biofilm measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Glass Plating Beads</td>
			<td>RBC</td>
			<td>RG001</td>
			<td>Glass beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;-Plate 96 Well Black</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>89621</td>
			<td>Microplate intended for CLSM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification, viability assessment, and visualization strategies for acinetobacter biofilms

L'Acinetobacter provoca infezioni nosocomiali e la sua formazione di biofilm può contribuire alla sopravvivenza su superfici asciutte come gli ambienti ospedalieri. Pertanto, la quantificazione e la visualizzazione del biofilm sono metodi importanti per valutare il potenziale dei ceppi di Acinetobacter di causare infezioni nosocomiali. I biofilm che si formano sulla superficie della micropiastra possono essere quantificati in termini di volume e numero di cellule. I volumi del biofilm possono essere quantificati mediante colorazione con crystal violet, lavaggio, decolorazione con etanolo, quindi misurazione del colorante solubilizzato con un lettore di micropiastre. Per quantificare il numero di cellule incorporate nei biofilm, i biofilm vengono raschiati utilizzando raschietti cellulari, raccolti nella soluzione salina, agitati vigorosamente in presenza di perle di vetro e sparsi su Acinetobacter agar. Successivamente, le piastre vengono incubate a 30 °C per 24-42 ore. Dopo l'incubazione, le colonie rosse vengono enumerate per stimare il numero di cellule nei biofilm. Questo metodo di conteggio può essere utile anche per contare le cellule di Acinetobacter nei biofilm di specie miste. I biofilm di Acinetobacter possono essere visualizzati utilizzando coloranti fluorescenti. Una micropiastra disponibile in commercio progettata per l'analisi microscopica viene impiegata per formare biofilm. Quindi, i biofilm attaccati alla superficie inferiore vengono colorati con SYTO9 e coloranti allo ioduro di propidio, lavati, quindi visualizzati con microscopia a scansione laser confocale.

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Seguendo il protocollo, i biofilm di isolati di Acinetobacter, originariamente isolati dalle superfici delle cucine, sono stati formati su una piastra di polistirene a 96 pozzetti, colorata con crystal violet, e i coloranti sono stati solubilizzati in etanolo e misurati per la massa del biofilm (Figura 1). Il numero di biofilm variava notevolmente a seconda dei ceppi che variavano da OD 0,04 a 1,69 (Figura 1). Sulla base dei criteri stabiliti da Stepano...

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A Comprehensive Protocol for Acinetobacter Biofilm Quantification, Assessment, and Visualization (Video) | JoVE

Questo protocollo descrive la preparazione dell'inoculo, la quantificazione del biofilm su piastre per microtitolazione utilizzando un colorante crystal violet, la conta vitale nei biofilm e la visualizzazione dei biofilm di Acinetobacter.

Strategie di quantificazione, valutazione della vitalità e visualizzazione per biofilm di Acinetobacter

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

I biofilm sono composti da cellule microbiche vive e sono difficili da rimuovere dalle superfici. I ceppi di Acinetobacter che si trovano comunemente nel nostro ambiente, causando infezioni nosocomiali, sono anche noti per formare biofilm sulle superfici. Pertanto, miriamo a sviluppare metodi per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter.Il nostro protocollo fornisce un metodo semplice e facile per quantificare e visualizzare i biofilm di Acinetobacter. Il numero vitale di cellule all'interno dei biofilm viene quantificato utilizzando il metodo del conteggio vitale. I risultati della nostra ricerca rivelano che i ceppi vettori di Acinetobacter esistenti in natura hanno un potenziale molto variabile per la formazione di biofilm.Inoltre, esisteranno differenze morfologiche distinte all'interno dei vari biofilm. Ciò ha aperto la strada alla ricerca incentrata sulle cause di una variazione così ampia tra i ceppi di Acinetobacter.