Name: Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00
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Diese Arbeit wurde vom Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, und dem National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt. Die Maschinenwerkstatt des Instituts für Physik der Academia Sinica half bei der Herstellung von kundenspezifischen Teilen. Wir danken auch P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) für die Konstruktion des Schnellverschlussmechanismus der Kopfstufe.

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Vorbereitung der Aufnahmekammer
<ol><li>Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe...

Behavior Tracking and Neural Activity Pattern in the Zebrafish Forebrain

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden...

Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten1. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessenwerden 2,3. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werden. Die Anwendung des bildgebenden Verfahrens für kleine Wirbeltiermodelle eröffnet neue Möglichkeiten im Bereich der neuronalen Berechnung über Hirnregionen hinweg.
Zebrafische sind ein weit verbreitetes Modellsystem in der neurowissenschaftlichen Forschung. Zebrafischlarven etwa 6 Tage nach der Befruchtung wurden aufgrund ihres Miniaturgehirns und ihres transparenten Körpers für die Kalziumbildgebung verwendet4. Juvenile Zebrafische (3-4 Wochen alt) werden auch verwendet, um die neuronalen Mechanismen zu untersuchen, die sensomotorischen Bahnen zugrunde liegen 5,6. Das maximale Leistungsniveau für komplexe Verhaltensweisen, einschließlich assoziativem Lernen und sozialem Verhalten, wird jedoch im Alter von 7,8 Jahren erreicht. Daher ist ein zuverlässiges Protokoll erforderlich, um mehrere kognitive Funktionen im Gehirn erwachsener Zebrafische mit bildgebenden Verfahren zu untersuchen. Während Zebrafischlarven und juvenile Zebrafische für die In-vivo-Bildgebung in Agarose eingebettet werden können, leiden erwachsene Zebrafische ab 2 Monaten unter solchen Bedingungen an Hypoxie und sind körperlich zu stark, um durch Agarose zurückgehalten zu werden. Daher ist ein chirurgischer Eingriff erforderlich, um das Gehirn zu stabilisieren und dem Tier die freie Atmung durch die Kiemen zu ermöglichen.
Hier beschreiben wir ein Kopfstützenprotokoll, das ein neuartiges Design eines einzelnen Kopfbügels beinhaltet. Die verkürzte Operationszeit von 25 Minuten ist doppelt so schnell wie bei der bisherigen Methode9. Wir beschreiben auch das Design der Aufnahmekammer (halbsechseckiger Tank), der Kopfstufe und eines Schnellverschlussmechanismus, um die beiden Teile9 zu verbinden. Abschließend wird auch der Aufbau zur Präsentation eines immersiven visuellen Stimulus zur Untersuchung visuell ausgelöster Gehirnaktivität und -verhaltensweisen beschrieben. Insgesamt können die hier beschriebenen Verfahren zur Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung in genetisch definierten Zellpopulationen in einem kopfgebundenen adulten Zebrafisch verwendet werden, was die Untersuchung von Gehirnaktivitäten während verschiedener Verhaltensparadigmen ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: der Kopfstützenchirurgie und der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung neuronaler Aktivitäten im Vorderhirn. Der Erfolg einer Operation wird durch das Überleben des Tieres und die Stabilität der Kopfstütze bestimmt. Die Überlebensrate kann durch häufige Perfusion von 0,01%iger TMS-Lösung durch den Mund während der Operation stark verbessert werden. Die Fische sollten sich von der Narkose erholen und innerhalb von 1-2 Minuten aktiv atmen, nachdem sie in das Wasser des Aquariums e...

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Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.

Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Das Vorderhirn von Fischen beherbergt Bereiche, von denen angenommen wird, dass sie homolog zu den Hirnregionen von Säugetieren sind, die an komplexem Verhalten beteiligt sind. Dazu gehören der Hippocampus, der Kortex und die Amygdala. Wir versuchen derzeit, die Wirkung von sensorischen Informationen auf die Aktivität dieser Hirnregionen zu verstehen.Aktuelle Forschungen in der Neurowissenschaft von Zebrafischen verwenden Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung von immobilisierten Larven. Kombiniert mit Virtual-Reality-basierten Verhaltensaufsätzen, um die sensomotorische Verarbeitung im Gehirn zu untersuchen. Die meisten Forschungen über das Gehirn von Zebrafischen werden an Larven durchgeführt, einige komplexe Verhaltensweisen bei Fischen entwickeln sich jedoch erst im Erwachsenenalter vollständig.Unser Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Gehirnaktivität beim Erwachsenen während des Verhaltens. Dieses Protokoll reduzierte die Operationszeiten im Vergleich zur vorherigen Methode um fünfzig Prozent. Es ist ein effizienterer Ansatz, um den Kopf eines ausgewachsenen Zebrafisches zu fixieren, um ein besseres Bild zu erzielen.Dieses Kopfstützenprotokoll eröffnete die Möglichkeit, ein In-vivo-Experiment am erwachsenen Zebrafischgehirn durchzuführen. Zusätzlich zum Zwei-Photonen-Kalziumbild ermöglicht die Kopfstütze möglicherweise die optogenetische Manipulation, Elektrophysiologie und sogar Ultraschallbildgebung von lebenden Fischen.