Name: Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Adult Zebrafish Brain Research at JoVE.com

이 연구는 분자생물학 연구소(Institute of Molecular Biology), 아카데미아 시니카(Academia Sinica), 대만 국가과학기술위원회(National Science and Technology Council)의 지원을 받았습니다. Institute of Physics, Academia Sinica의 Machine Shop은 맞춤형 설계 부품을 제작하는 데 도움을 주었습니다. 또한 헤드 스테이지의 퀵 락 메커니즘을 설계해 준 P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Switzerland)에게도 감사의 뜻을 전합니다.

모든 동물 시술은 Academia Sinica의 Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 연구 도구에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.
1. 기록실의 준비
<ol><li>반 육각형 탱크, 베이스 플레이트 및 헤드 스테이지를 준비합니다(그림 1A; 보충 파일 1-3). 헤드 스테이지는 원형 플...

Behavior Tracking and Neural Activity Pattern in the Zebrafish Forebrain

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

여기에서는 이광자 칼슘 이미징을 위해 성인 제브라피쉬의 머리를 억제하는 자세한 프로토콜을 설명합니다. 레이저 스캐닝 이미징에 충분히 안정적인 머리 지지대를 얻기 위한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 헤드 바를 두개골의 특정 부착 부위에 붙여야 합니다. 두개골의 다른 부분은 종종 너무 얇아서 기계적 안정성을 제공하지 못하며 격렬한 신체 움직임 중에 골절될 수도 있습니다. ?...

유전적으로 인코딩된 지표 또는 합성 염료를 사용한 칼슘 형광 이미징은 인간이 아닌 영장류, 설치류, 조류 및 곤충을 포함한 행동하는 동물의 신경 활동을 측정하는 강력한 방법이었습니다1. 뇌 표면 아래 최대 약 800μm까지 수백 개의 세포 활동을 다광자 이미징 2,3을 사용하여 동시에 측정할 수 있습니다. 특정 세포 유형의 활성은 유전적으로 정의된 신경 세포 집단에서 칼슘 지표를 발현하여 측정할 수도 있습니다. 작은 척추동물 모델에 이미징 방법을 적용하면 뇌 영역 전반에 걸쳐 신경 계산 분야에서 새로운 가능성이 열립니다.
제브라피시는 신경 과학 연구에서 널리 사용되는 모델 시스템입니다. 수정 후 약 6일이 지난 제브라피시 유충은 작은 뇌와 투명한 몸체로 인해 칼슘 이미징에 사용되어 왔다4. 어린 제브라피시(생후 3-4주)는 감각 운동 경로 5,6의 기저에 있는 신경 메커니즘을 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 연상 학습 및 사회적 행동을 포함한 복잡한 행동에 대한 최대 수행 수준은 7,8세의 나이에 도달합니다. 따라서 이미징 방법을 사용하여 성인 제브라피쉬의 뇌에서 여러 인지 기능을 연구하려면 신뢰할 수 있는 프로토콜이 필요합니다. 제브라피시 유충과 어린 제브라피쉬는 생체 내 이미징을 위해 아가로스에 삽입될 수 있지만, 생후 2개월 이상의 성체 제브라피쉬는 이러한 조건에서 저산소증을 앓고 있으며 신체적으로 너무 강해서 아가로스로 억제할 수 없습니다. 따라서 뇌를 안정시키고 아가미를 통해 동물이 자유롭게 숨을 쉴 수 있도록 하는 수술이 필요합니다.
여기에서는 단일 헤드 바의 새로운 설계와 관련된 머리 지지대 프로토콜에 대해 설명합니다. 25분의 단축된 수술 시간은 이전 방법9보다 두 배 빠릅니다. 또한 기록 챔버(반 육각형 탱크), 헤드 스테이지 및 두 부분을 결합하는 빠른 잠금 메커니즘9의 설계에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 시각적으로 촉발된 뇌 활동과 행동을 연구하기 위해 몰입형 시각적 자극을 제시하는 설정도 설명합니다. 전반적으로, 여기에 설명된 절차는 머리를 고정한 성인 제브라피쉬의 유전적으로 정의된 세포 집단에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 다양한 행동 패러다임 동안 뇌 활동을 조사할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

성인 제브라피시(Danio rerio)는 인지 기능을 연구하기 위한 다양한 행동 레퍼토리를 보여줍니다. 그들은 또한 광학 이미징 방법을 통해 뇌 영역 전체의 활동을 측정하는 데 사용할 수 있는 소형 뇌를 가지고 있습니다. 그러나 성인 제브라피쉬의 뇌 활동 기록에 대한 보고는 드물었다. 본 연구는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 절차를 설명합니다. 우리는 성인 제브라피시가 머리를 움직이지 못하도록 억제하는 단계에 중점을 두며, 이는 뇌 활동의 레이저 스캐닝 이미징을 가능하게 하는 안정성을 제공합니다. 머리에 묶인 동물은 보조 기구 없이 신체 부위를 자유롭게 움직이고 숨을 쉴 수 있습니다. 이 시술은 머리 구속 수술 시간을 단축하고 뇌 운동을 최소화하며 기록되는 뉴런 수를 최대화하는 것을 목표로 합니다. 칼슘 이미징 중에 몰입형 시각적 환경을 제공하기 위한 설정도 여기에 설명되어 있으며, 이는 시각적으로 트리거된 행동의 기본 신경 상관 관계를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

프로토콜은 머리 구속 수술과 전뇌의 신경 활동에 대한 이광자 칼슘 영상의 두 부분으로 구성됩니다. 수술의 성공은 동물의 생존과 머리 지지대의 안정성에 의해 결정됩니다. 수술 중 0.01% TMS 용액을 경구로 자주 관류하면 생존율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 물고기는 어항 물에 잠긴 후 1-2분 이내에 마취에서 회복되고 활발하게 숨을 쉬어야 합니다. 2광자 칼슘 이미징을 통해 뇌 표면에서 온전?...

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Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE

여기에서는 성인 제브라피쉬의 등쪽 전뇌에서 이광자 칼슘 이미징을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

물고기의 전뇌는 복잡한 행동에 관여하는 포유류의 뇌 영역과 상동성으로 의심되는 영역을 숙주합니다. 여기에는 해마, 피질, 편도체가 포함됩니다. 우리는 현재 감각 정보가 이러한 뇌 영역의 활동에 미치는 영향을 이해하려고 노력하고 있습니다.제브라 피쉬 신경 과학의 현재 연구는 고정된 유충의 두 광자 칼슘 이미징을 사용합니다. 가상 현실 기반 행동 에세이와 결합하여 뇌의 감각 운동 처리를 연구합니다. 얼룩말 물고기의 뇌에 대한 대부분의 연구는 유충에 대해 수행되지만 물고기의 일부 복잡한 행동은 성충이 될 때까지 완전히 발달하지 않습니다.우리의 프로토콜은 행동 중 성인의 뇌 활동을 연구할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 이전 방법에 비해 수술 시간을 50% 단축했습니다. 더 나은 이미지를 위해 성인 얼룩말 물고기의 머리를 구속하는 보다 효율적인 접근 방식입니다.이 머리 구속 프로토콜은 성인 얼룩말 물고기 뇌에 대한 생체 내 실험을 수행할 수 있는 기회를 열었습니다. 이광자 칼슘 이미지 외에도 머리 지지대는 잠재적으로 광유전학적 조작, 전기 생리학 및 살아있는 물고기의 초음파 이미징을 가능하게 합니다.