Name: Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-28T14:40:00
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Este trabajo contó con el apoyo del Instituto de Biología Molecular, la Academia Sinica y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán. El Taller de Máquinas del Instituto de Física de la Academia Sinica ayudó a fabricar piezas diseñadas a medida. También queremos agradecer a P. Argast (Instituto Friedrich Miescher de Investigación Biomédica, Basilea, Suiza) por el diseño del mecanismo de bloqueo rápido de la platina de la cabeza.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con los lineamientos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Academia Sinica. Los detalles de las herramientas de investigación se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de la cámara de registro
<ol><li>Prepare un tanque semihexagonal, una placa base y una etapa de cabeza (Figura 1A; Legajos Complementa...

Behavior Tracking and Neural Activity Pattern in the Zebrafish Forebrain

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

Aquí, describimos un protocolo detallado para sujetar la cabeza de un pez cebra adulto para obtener imágenes de calcio de dos fotones. Hay dos pasos críticos para lograr un reposacabezas que sea lo suficientemente estable para las imágenes de escaneo láser. Primero, la barra de la cabeza debe pegarse a los sitios de fijación específicos de los cráneos. Otras partes del cráneo suelen ser demasiado delgadas para proporcionar estabilidad mecánica e incluso pueden fracturarse durante los movimientos fuertes del cue...

Las imágenes de fluorescencia de calcio con indicadores codificados genéticamente o colorantes sintéticos han sido un método poderoso para medir la actividad neuronal en animales que se comportan, incluidos primates no humanos, roedores, aves e insectos. La actividad de cientos de células, hasta aproximadamente 800 μm por debajo de la superficie del cerebro, puede medirse simultáneamente utilizando imágenes multifotónicas 2,3. La actividad de tipos celulares específicos también se puede medir mediante la expresión de indicadores de calcio en poblaciones neuronales definidas genéticamente. La aplicación del método de imagen para modelos de pequeños vertebrados abre nuevas posibilidades en el campo de la computación neuronal en todas las regiones cerebrales.
El pez cebra es un sistema modelo ampliamente utilizado en la investigación en neurociencia. Las larvas de pez cebra alrededor de 6 días después de la fertilización se han utilizado para obtener imágenes de calcio debido a su cerebro en miniatura y su cuerpo transparente4. Los peces cebra juveniles (3-4 semanas de edad) también se utilizan para estudiar los mecanismos neuronales que subyacen a las vías sensoriomotoras 5,6. Sin embargo, el nivel máximo de rendimiento para conductas complejas, incluyendo el aprendizaje asociativo y las conductas sociales, se alcanza a una edad más avanzada 7,8. Por lo tanto, se requiere un protocolo confiable para estudiar múltiples funciones cognitivas en el cerebro de peces cebra adultos utilizando métodos de imagen. Mientras que las larvas de pez cebra y los peces cebra juveniles pueden incluirse en agarosa para obtener imágenes in vivo, los peces cebra adultos a los 2 meses o más sufren de hipoxia en tales condiciones y son físicamente demasiado fuertes para ser restringidos por agarosa. Por lo tanto, se requiere un procedimiento quirúrgico para estabilizar el cerebro y permitir que el animal respire libremente a través de las branquias.
Aquí, describimos un protocolo de reposacabezas que implica un diseño novedoso de una sola barra para la cabeza. El tiempo quirúrgico reducido de 25 min es dos veces más rápido que el método anterior9. También describimos el diseño de la cámara de registro (tanque semihexagonal), la etapa de la cabeza y un mecanismo de bloqueo rápido para combinar las dos partes9. Por último, también se describe la configuración para presentar un estímulo visual inmersivo para estudiar la actividad y los comportamientos cerebrales activados visualmente. En general, los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para realizar imágenes de calcio de dos fotones en poblaciones celulares definidas genéticamente en un pez cebra adulto con la cabeza restringida, lo que permite la investigación de las actividades cerebrales durante varios paradigmas de comportamiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

El pez cebra adulto (Danio rerio) exhibe un rico repertorio de comportamientos para estudiar las funciones cognitivas. También tienen un cerebro en miniatura que se puede utilizar para medir las actividades en todas las regiones del cerebro a través de métodos de imágenes ópticas. Sin embargo, los informes sobre el registro de la actividad cerebral en el pez cebra adulto han sido escasos. El presente estudio describe los procedimientos para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal del pez cebra adulto. Nos centramos en los pasos para evitar que los peces cebra adultos muevan la cabeza, lo que proporciona una estabilidad que permite la obtención de imágenes de escaneo láser de la actividad cerebral. Los animales con la cabeza sujeta pueden mover libremente las partes de su cuerpo y respirar sin ayudas. El procedimiento tiene como objetivo acortar el tiempo de la cirugía del reposacabezas, minimizar el movimiento del cerebro y maximizar el número de neuronas registradas. Aquí también se describe una configuración para presentar un entorno visual inmersivo durante las imágenes de calcio, que se puede utilizar para estudiar los correlatos neuronales subyacentes a los comportamientos desencadenados visualmente.

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

El protocolo consta de dos partes: cirugía de reposacabezas e imágenes de calcio de dos fotones de las actividades neuronales en el prosencéfalo. El éxito de la cirugía se define por la supervivencia del animal y la estabilidad del reposacabezas. La tasa de supervivencia puede mejorarse en gran medida mediante la perfusión frecuente de una solución de TMS al 0,01% a través de la boca durante la cirugía. Los peces deben recuperarse de la anestesia y respirar activamente dentro de 1-2 minutos después de sumergirs...

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Advancements in Adult Zebrafish Brain Research (Video) | JoVE

Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

El prosencéfalo de los peces alberga áreas que se sospecha que son homólogas a las regiones cerebrales de los mamíferos involucradas en un comportamiento complejo. Estos incluyen el hipocampo, la corteza y la amígdala. Actualmente estamos tratando de comprender el efecto de la información sensorial en la actividad de estas regiones cerebrales.La investigación actual en neurociencia del pez cebra utiliza imágenes de calcio de dos fotones de larvas inmovilizadas. Combinado con ensayos conductuales basados en la realidad virtual, para estudiar el procesamiento sensoriomotor en el cerebro. La mayoría de las investigaciones sobre el cerebro del pez cebra se realizan en larvas, sin embargo, algunos comportamientos complejos en los peces no se desarrollan completamente hasta la edad adulta.Nuestro protocolo permite el estudio de la actividad cerebral en el adulto durante la conducta. Este protocolo redujo los tiempos de cirugía en un cincuenta por ciento en comparación con el método anterior. Es un enfoque más eficiente para sujetar la cabeza de los peces cebra adultos para obtener una mejor imagen.Este protocolo de sujeción de la cabeza abrió la oportunidad de realizar un experimento in vivo en el cerebro de un pez cebra adulto. Además de la imagen de calcio de dos fotones, el reposacabezas permite potencialmente la manipulación optogenética, la electrofisiología e incluso la obtención de imágenes de ultrasonido de peces vivos.