Name: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات والتحديات في تمايز الخلايا β من الخلايا الجذعية متعددة القدرات
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements and Challenges in β-Cells Differentiation from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

تم دعم إيناس الشرقاوي من قبل منحة دراسية لمرض السكري في المملكة المتحدة (BDA 18/0005934) إلى GAR ، التي تشكر أيضا Wellcome Trust لجائزة الباحث (212625 / Z / 18 / Z) ، UKRI MRC لمنحة البرنامج (MR / R022259 / 1) ، Diabetes UK لمنحة المشروع (BDA16 / 0005485) ، CRCHUM لصناديق بدء التشغيل ، Innovation Canada لجائزة John R. Evans Leader (CFI 42649) ، NIH-NIDDK (R01DK135268) للحصول على منحة مشروع، ومركز القاهرة لحقوق الإنسان، JDRF للحصول على منحة الفريق (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). كاميل ديون والدكتور هاري ليتش لمساعدتهما في توليد وثقافة hiPSCs البشرية ، منشأة NIHR Imperial BRC (مركز البحوث الطبية الحيوية) العضوية ، لندن.

قبل البدء في التمايز ، يوصى بتحديد العدد المطلوب من الكائنات العضوية الشبيهة بالجزر للأغراض التجريبية. في صفيحة 6 آبار ، يتكون البئر الواحد الذي يزيد عن 80٪ من التقاء 2-2.3 مليون hPSCs. في حين أن التنبؤ الدقيق يمثل تحديا بسبب الاختلافات في خطوط hPSC وكفاءة التمايز ، فإن التقدير التقريبي هو 1.5 ضعف عد...

تمييز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى خلايا β البنكرياس

<ol>
	<li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine.">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+routes+to+the+generation+of+functional+&#946;-cells+for+diabetes+mellitus+cell+therapy.">Emerging routes to the generation of functional &#946;-cells for diabetes mellitus cell therapy.</a> Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells.">&#946;-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+pancreatic+&#946;-cells+from+multiple+human+stem+cell+lines.">Generation of insulin-producing pancreatic &#946;-cells from multiple human stem cell lines.</a> Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).</li><li>Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+&#946;-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Pancreatic &#946;-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size.">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+&#946;-cell+differentiation.">Charting cellular identity during human in vitro &#946;-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li><li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+gene+disallowance,+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity.">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic &#946;-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li><li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INS(GFP/w)+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells.">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li><li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth.">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li></ol>

يعتمد التمايز الناجح ل hPSCs إلى خلايا β البنكرياس على تحسين جميع جوانب الزراعة الروتينية ومرور hPSCs المختارة. وهذا يشمل التأكد من أن خط الخلية لديه نمط نووي طبيعي ، وسلبي لعدوى الميكوبلازما ، وخالي من جينومات البلازميد أو الناقل الفيروسي. علاوة على ذلك ، عند استخدام hiPSCs ، من المهم تجنب استخدا...

تتمتع الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بقدرة فريدة على التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يجعلها بديلا قابلا للتطبيق لخلايا β البنكرياس البشرية1. يتم تصنيف هذه hPSCs إلى نوعين: الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) ، المشتقة من الكيسة الأريمية2 ، والخلايا المستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) ، الناتجة عن إعادة برمجة الخلايا الجسدية مباشرة3. إن تطوير تقنيات للتمييز بين hPSCs إلى خلايا β ، له آثار مهمة على كل من البحث الأساسي والممارسة السريرية 1,4. داء السكري هو مرض مزمن يصيب > 400 مليون شخص في جميع أنحاء العالم وينتج عن عدم قدرة الجسم على تنظيم نسبة السكر في الدم بسبب خلل أو فقدان خلايا β البنكرياس5. أدى التوافر المحدود لخلايا جزيرة البنكرياس للزراعة إلى إعاقة تطوير علاجات استبدال الخلايا لمرض السكري2،4،6،7. تعمل القدرة على توليد خلايا إفراز الأنسولين المستجيبة للجلوكوز باستخدام hPSCs كنموذج خلوي مفيد لدراسة تطور الجزر البشرية ووظيفتها. يمكن استخدامه أيضا لاختبار المرشحين العلاجيين المحتملين لعلاج مرض السكري في بيئة خاضعة للرقابة. علاوة على ذلك ، فإن hPSCs لديها القدرة على إنتاج خلايا جزيرة البنكرياس المتطابقة وراثيا للمريض ، مما يقلل من خطر الرفض المناعي بعد الزرع2،4،7.
في السنوات الأخيرة ، كانت هناك تطورات كبيرة في تحسين ثقافة hPSC وبروتوكولات التمايز ، مما أدى إلى زيادة الكفاءة وقابلية استنساخ عملية التمايز نحو توليد خلايا β البنكرياس 8,9.
يوضح البروتوكول التالي المراحل الأساسية للتمايز الموجه لخلايا β البنكرياس. وهو ينطوي على تنظيم مسارات إشارات خلية محددة في نقاط زمنية متميزة. يعتمد على البروتوكول الذي طوره Sui L. et al.10 (2018) لتوليد hPSCs في خلايا β البنكرياس. تم تعديل البروتوكول وفقا للتحديثات الأخيرة من Sui L. et al.11 (2021) ، حيث تؤكد أحدث الأبحاث على أهمية استخدام علاج aphidicolin (APH) لتعزيز تمايز الخلايا β. يتضمن البروتوكول الحالي إضافة APH إلى الوسيط خلال المراحل اللاحقة من العملية. وعلاوة على ذلك، أدخلت تعديلات على تكوين الوسط خلال المراحل المبكرة من التمايز مقارنة بالبروتوكول الأولي. التغيير الملحوظ هو إضافة عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) في اليوم 6 ويستمر حتى اليوم 8. يتم تقديم عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) من اليوم 6 إلى اليوم 8 ، والذي يختلف قليلا عن البروتوكول الأولي10 ، حيث لم يتم تضمين KGF في وسط المرحلة 4.
الخطوة الأولى والأساسية في توليد الخلايا الشبيهة بالخلايا β هي التمايز الموجه ل hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وهي طبقة جرثومية بدائية تؤدي إلى ظهور البطانة الظهارية للأعضاء المختلفة ، بما في ذلك البنكرياس. بعد تكوين DE ، تخضع الخلايا للتمايز في أنبوب الأمعاء البدائي ، والذي يتبعه تحديد مصير الأمعاء الأمامية الخلفية. تتطور الأمعاء الأمامية الخلفية بعد ذلك إلى خلايا سلف للبنكرياس ، والتي لديها القدرة على التمايز إلى جميع أنواع خلايا البنكرياس ، بما في ذلك خلايا الغدد الصماء وخلايا الإفراز الخارجية. تتضمن المرحلة اللاحقة من العملية أسلاف الغدد الصماء في البنكرياس مما يؤدي إلى ظهور الخلايا المفرزة للهرمونات الموجودة في جزر لانجرهانز. في النهاية ، تصل عملية التمايز إلى مرحلتها النهائية من خلال إنتاج خلايا تشبه خلايا البنكرياس β تعمل بكامل طاقتها 9,10. من المهم ملاحظة أن هذه العملية معقدة وغالبا ما تتطلب تحسين ظروف الثقافة ، مثل عوامل النمو المحددة ومكونات المصفوفة خارج الخلية ، لتحسين كفاءة وخصوصية التمايز 9,10. علاوة على ذلك ، لا يزال توليد خلايا وظيفية تشبه الخلايا β من hPSCs في المختبر يمثل تحديا كبيرا. تركز الأبحاث الجارية على تحسين بروتوكولات التمايز وتعزيز نضج ووظيفة الخلايا βالناتجة 9.
في هذا البروتوكول ، يعد استخدام تفكك الخلايا اللطيف أثناء زراعة ومرور hPSCs أمرا ضروريا للحفاظ على صلاحية الخلية وتعدد القدرات ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة التمايز في خلايا β البنكرياس. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحسين كل وسيط خاص بالمرحلة بدقة وفقا للبروتوكول الذي طوره Sui L. et al.10 لتعزيز إنتاجية عالية من الخلايا التي تفرز الأنسولين في مجموعات تشبه إلى حد كبير الجزيرة البشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Starlabs</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 6-well plate&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G2654-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Insulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NKX6.1</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-49672SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3803-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/Magnesium free D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine-KAAD</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>239804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose,BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94046-100ML-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM plus GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td>For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J64904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound 118 mL</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, 22&#215;50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RepSox (Hydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Immu-mount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Endoderm&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4&#176;C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid Tormone 3 (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>38071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for generating functional pancreatic insulin-secreting cells from human pluripotent stem cells

يمكن أن تتمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) إلى أي نوع من الخلايا ، مما يجعلها مصدرا بديلا ممتازا لخلايا β البنكرياس البشرية. يمكن أن تكون hPSCs إما خلايا جذعية جنينية (hESCs) مشتقة من الكيسة الأريمية أو خلايا مستحثة متعددة القدرات (hiPSCs) متولدة مباشرة من الخلايا الجسدية باستخدام عملية إعادة البرمجة. هنا يتم تقديم بروتوكول قائم على الفيديو لتحديد الثقافة المثلى وظروف المرور ل hPSCs ، قبل تمايزها وتوليدها لاحقا لخلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. تتبع هذه المنهجية العملية المكونة من ست مراحل للتمايز الموجه للخلايا β ، حيث تتمايز hPSCs إلى الأديم الباطن النهائي (DE) ، وأنبوب الأمعاء البدائي ، ومصير الأمعاء الأمامية الخلفية ، وأسلاف البنكرياس ، وأسلاف الغدد الصماء في البنكرياس ، وفي النهاية خلايا β البنكرياس. من الجدير بالذكر أن منهجية التمايز هذه تستغرق فترة 27 يوما لتوليد خلايا β البنكرياس البشرية. تم تقييم إمكانات إفراز الأنسولين من خلال تجربتين ، والتي تضمنت التلوين المناعي وإفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات والتحديات في تمايز الخلايا β من الخلايا الجذعية متعددة القدرات

بروتوكول محسن لتوليد خلايا إفراز الأنسولين البنكرياسية الوظيفية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

يقدم البروتوكول الموصوف في هذه الورقة نهجا عالي الكفاءة للتمييز بين الخلايا الشبيهة ب β من hPSCs10. تستخدم هذه العملية نظام ثقافة 2D قابل للتطوير بسهولة ، مما يتيح استخدامه في بيئات تجريبية مختلفة ، مثل تمايز التعلم ، والمشاريع الصغيرة والمختبرات ، والاختبارات التجريبية لتقييم إ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements and Challenges in β-Cells Differentiation from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للتمايز الموجه والتحليل الوظيفي للخلايا الشبيهة بالخلايا β. نحن نصف ظروف وممرات الثقافة المثلى للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات قبل توليد خلايا البنكرياس المنتجة للأنسولين. يتطور التمايز المكون من ست مراحل من تكوين الأديم الباطن النهائي إلى خلايا وظيفية تشبه الخلايا β تفرز الأنسولين استجابة للجلوكوز.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

يمثل تحقيق كفاءة عالية ومتسقة في عملية التمايز لتحويل الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا بيتا بشرية تحديا ملحوظا. يتأثر هذا التحدي بالدقة والاتساق الذي يتبع به المجرب البروتوكول. علاوة على ذلك ، فإن كمية خلايا بيتا التي تم الحصول عليها في كل تجربة متغيرة تماما ، مما قد يؤدي إلى انخفاض وظيفة خلايا بيتا عبر تجارب متعددة.في سياق أبحاث خلايا بيتا عالية اللبتين في مرض السكري ، فإن توافر المتبرعين بالثقب الجثة محدود للغاية. وبالتالي ، فإن استخدام خلايا بيتا المتمايزة للخلايا الجذعية يوفر إمدادات غير محدودة وفيرة من الخلايا المفرزة للأنسولين. تمايز خلايا بيتا هو تقدم محوري في مجالنا ، ويقدم العديد من الفوائد.يسمح لنا باستكشاف تطور ووظيفة خلايا بيتا ، مما يؤدي إلى فهم أعمق لأسباب مرض السكري واختلال خلايا بيتا. نهدف إلى استخدام هذه التقنية لأبحاثنا التي تركز على علم الوراثة لمرض السكري. هدفنا الأساسي هو التركيز على طفرة جينات معينة يمكن أن تؤثر على خلايا بيتا ووظيفة العيينة.لذلك سيسهل هذا البروتوكول الوصول إلى العيينة البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية القوية مسبقا مع الطفرات ذات الأهمية.

optimized-protocol-for-generating-functional-pancreatic-insulin

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic &#946;-cells. hPSCs can either be embryonic stem cells (hESCs) derived from the blastocyst or induced pluripotent cells (hiPSCs) generated directly from somatic cells using a reprogramming process. Here a video-based protocol is presented to outline the optimal culture and passage conditions for hPSCs, prior to their differentiation and subsequent generation of insulin-producing pancreatic cells. This methodology follows the six-stage process for &#946;-cell directed differentiation, wherein hPSCs differentiate into definitive endoderm (DE), primitive gut tube, posterior foregut fate, pancreatic progenitors, pancreatic endocrine progenitors, and ultimately pancreatic &#946;-cells. It is noteworthy that this differentiation methodology takes a period of 27 days to generate human pancreatic &#946;-cells. The potential of insulin secretion was evaluated through two experiments, which included immunostaining and glucose-stimulated insulin secretion.

This article presents a protocol for directed differentiation and functional analysis of &#946;-cell like cells. We describe optimal culture conditions and passages for human pluripotent stem cells before generating insulin-producing pancreatic cells. The six-stage differentiation progresses from definitive endoderm formation to functional &#946;-cell like cells secreting insulin in response to glucose.