Name: Pleins feux sur l’auteur : Avancées et défis dans la différenciation des cellules β à partir de cellules souches pluripotentes
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements and Challenges in β-Cells Differentiation from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ines Cherkaoui a bénéficié d’une bourse de recherche de Diabetes UK (BDA 18/0005934) à GAR, qui remercie également le Wellcome Trust pour une bourse de chercheur (212625/Z/18/Z), UKRI MRC pour une subvention de programme (MR/R022259/1), Diabetes UK pour une subvention de projet (BDA16/0005485), le CRCHUM pour des fonds de démarrage, Innovation Canada pour une bourse John R. Evans Leader (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) pour une subvention Projet, et IRSC, FRDJ pour une subvention d’équipe (IRSC-IRSC : 0682002550 ; FRDJ 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion et le Dr Harry Leitch pour leur aide à la génération et à la culture d’hiPSC humaines, l’installation d’organoïdes du NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londres.

Avant d’amorcer la différenciation, il est recommandé de déterminer le nombre requis d’organoïdes en forme d’îlots à des fins expérimentales. Dans une plaque à 6 puits, un seul puits avec plus de 80 % de confluence se compose généralement de 2 à 2,3 millions de CSPh. Bien qu’une prédiction précise soit difficile en raison des variations des lignées de hPSC et de l’efficacité de la différenciation, une estimation approximative est 1,5 fois le nombre de puits initiaux. Une différenciation dirigé...

Différenciation des cellules souches pluripotentes humaines en cellules β pancréatiques

<ol>
	<li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine.">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+routes+to+the+generation+of+functional+&#946;-cells+for+diabetes+mellitus+cell+therapy.">Emerging routes to the generation of functional &#946;-cells for diabetes mellitus cell therapy.</a> Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells.">&#946;-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+pancreatic+&#946;-cells+from+multiple+human+stem+cell+lines.">Generation of insulin-producing pancreatic &#946;-cells from multiple human stem cell lines.</a> Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).</li><li>Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+&#946;-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Pancreatic &#946;-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size.">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+&#946;-cell+differentiation.">Charting cellular identity during human in vitro &#946;-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li><li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+gene+disallowance,+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity.">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic &#946;-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li><li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INS(GFP/w)+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells.">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li><li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth.">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li></ol>

La différenciation réussie des CSPh en cellules β pancréatiques dépend de l’optimisation de tous les aspects de la culture de routine et du passage des CSPh sélectionnées. Il s’agit notamment de s’assurer que la lignée cellulaire a un caryotype normal, qu’elle est négative pour l’infection à mycoplasmes et qu’elle est exempte de génomes plasmidiques ou de vecteurs viraux. De plus, lors de l’utilisation de hiPSC, il est important d’éviter d’utiliser le passage le plus ancien qui est encore en...

Les cellules souches pluripotentes humaines (CSPh) ont la capacité unique de se différencier en différents types de cellules, ce qui en fait une alternative viable aux cellules β pancréatiques humaines1. Ces hPSC sont classées en deux types : les cellules souches embryonnaires (hESC), dérivées du blastocyste2, et les cellules pluripotentes induites (hiPSC), générées par la reprogrammation directe des cellules somatiques3. Le développement de techniques permettant de différencier les CSPh en cellules β a des implications importantes pour la recherche fondamentale et la pratique clinique 1,4. Le diabète sucré est une maladie chronique qui touche > 400 millions de personnes dans le monde et résulte de l’incapacité de l’organisme à réguler la glycémie en raison d’un dysfonctionnement ou d’une perte de cellules β pancréatiques5. La disponibilité limitée de cellules d’îlots pancréatiques pour la transplantation a entravé le développement de thérapies de remplacement cellulaire pour le diabète 2,4,6,7. La capacité de générer des cellules sécrétant de l’insuline sensibles au glucose à l’aide de hPSC sert de modèle cellulaire utile pour étudier le développement et la fonction des îlots de Langerhans humains. Il peut également être utilisé pour tester des candidats thérapeutiques potentiels pour le traitement du diabète dans un environnement contrôlé. De plus, les CSPh ont le potentiel de produire des cellules d’îlots pancréatiques génétiquement identiques à celles du patient, réduisant ainsi le risque de rejet immunitaire après la transplantation 2,4,7.
Ces dernières années, des progrès significatifs ont été réalisés dans le perfectionnement des protocoles de culture et de différenciation des CSPh, ce qui a permis d’accroître l’efficacité et la reproductibilité du processus de différenciation en vue de générer des cellules β pancréatiques 8,9.
Le protocole suivant décrit les étapes essentielles de la différenciation dirigée des β-cellules pancréatiques. Il implique la régulation de voies de signalisation cellulaire spécifiques à des moments distincts. Il est basé sur le protocole développé par Sui L. et al.10 (2018) pour la génération de CSPh dans les cellules β pancréatiques. Le protocole a été ajusté aux récentes mises à jour de Sui L. et al.11 (2021), car les dernières recherches soulignent l’importance de l’utilisation d’un traitement à l’aphidicoline (APH) pour améliorer la différenciation des β-cellules. Le protocole actuel comprend l’ajout d’APH au milieu au cours des étapes ultérieures du processus. De plus, des modifications ont été apportées à la composition du milieu au cours des premiers stades de différenciation par rapport au protocole initial. Un changement notable est l’ajout du facteur de croissance des kératinocytes (KGF) le jour 6 et se poursuit jusqu’au jour 8. Le facteur de croissance des kératinocytes (KGF) est introduit du 6e au 8e jour, ce qui diffère légèrement du protocole10 initial, où le KGF n’était pas inclus dans le milieu de stade 4.
La première étape essentielle de la génération de cellules de type β est la différenciation dirigée des CSPh en endoderme définitif (DE), une couche germinale primitive qui donne naissance à la muqueuse épithéliale de divers organes, y compris le pancréas. Après la formation de DE, les cellules subissent une différenciation dans le tube intestinal primitif, qui est suivie de la spécification du destin postérieur de l’intestin antérieur. L’intestin antérieur postérieur se développe ensuite en cellules progénitrices pancréatiques, qui ont le potentiel de se différencier en tous les types de cellules du pancréas, y compris les cellules endocrines et exocrines. L’étape suivante du processus implique des progéniteurs endocriniens pancréatiques donnant naissance aux cellules sécrétant des hormones trouvées dans les îlots de Langerhans. En fin de compte, le processus de différenciation atteint son stade final en produisant des cellules pancréatiques de type β-cellules 9,10 entièrement fonctionnelles. Il est important de noter que ce processus est complexe et nécessite souvent une optimisation des conditions de culture, telles que des facteurs de croissance spécifiques et des composants de la matrice extracellulaire, pour améliorer l’efficacité et la spécificité de la différenciation 9,10. De plus, la génération de cellules fonctionnelles de type β-cellules à partir de hPSC in vitro reste un défi majeur. Les recherches en cours se concentrent sur l’amélioration des protocoles de différenciation et l’amélioration de la maturation et de la fonction des β-cellules résultantes9.
Dans ce protocole, l’utilisation de la dissociation cellulaire douce pendant la culture et le passage des hPSC est essentielle pour maintenir la viabilité et la pluripotence cellulaires, améliorant considérablement l’efficacité de la différenciation en β-cellules pancréatiques. De plus, chaque milieu spécifique à l’étape a été méticuleusement optimisé selon le protocole développé par Sui L. et al.10 pour favoriser un rendement élevé de cellules sécrétant de l’insuline en grappes qui ressemblent étroitement à l’îlot humain.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Starlabs</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 6-well plate&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G2654-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Insulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NKX6.1</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-49672SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3803-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/Magnesium free D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine-KAAD</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>239804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose,BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94046-100ML-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM plus GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td>For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J64904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound 118 mL</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, 22&#215;50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RepSox (Hydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Immu-mount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Endoderm&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4&#176;C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid Tormone 3 (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>38071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for generating functional pancreatic insulin-secreting cells from human pluripotent stem cells

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule, ce qui en fait une excellente source alternative de β-cellules pancréatiques humaines. Les CSPh peuvent être soit des cellules souches embryonnaires (CSEh) dérivées du blastocyste, soit des cellules pluripotentes induites (CSPh) générées directement à partir de cellules somatiques par un processus de reprogrammation. Ici, un protocole vidéo est présenté pour décrire les conditions optimales de culture et de passage des hPSC, avant leur différenciation et la génération ultérieure de cellules pancréatiques productrices d’insuline. Cette méthodologie suit le processus en six étapes de différenciation dirigée par les cellules β, dans lequel les hPSC se différencient en endoderme définitif (DE), tube intestinal primitif, destin de l’intestin antérieur postérieur, progéniteurs pancréatiques, progéniteurs endocriniens pancréatiques et finalement cellules β pancréatiques. Il convient de noter que cette méthodologie de différenciation prend une période de 27 jours pour générer des β-cellules pancréatiques humaines. Le potentiel de sécrétion d’insuline a été évalué par le biais de deux expériences, qui comprenaient l’immunomarquage et la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

Pleins feux sur l’auteur : Avancées et défis dans la différenciation des cellules β à partir de cellules souches pluripotentes

Protocole optimisé pour la génération de cellules pancréatiques fonctionnelles sécrétant de l’insuline à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

Le protocole décrit dans cet article offre une approche très efficace pour différencier les cellules de type β des hPSC10. Ce processus utilise un système de culture 2D facilement évolutif, permettant son utilisation dans divers contextes expérimentaux, tels que la différenciation de l’apprentissage, des projets et des laboratoires plus petits, et des tests pilotes pour évaluer le potentiel de différenciation d’une lignée iPSC.
Il est essentiel de caract?...

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Cet article présente un protocole de différenciation dirigée et d’analyse fonctionnelle des cellules de type β-cellules. Nous décrivons les conditions de culture et les passages optimaux pour les cellules souches pluripotentes humaines avant de générer des cellules pancréatiques productrices d’insuline. La différenciation en six étapes progresse de la formation définitive de l’endoderme à des cellules fonctionnelles de type β sécrétant de l’insuline en réponse au glucose.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

Atteindre une efficacité élevée et constante dans le processus de différenciation pour convertir les cellules souches pluripotentes en cellules bêta humaines est un défi de taille. Ce défi est influencé par la précision et la cohérence avec lesquelles l’expérimentateur suit le protocole. De plus, la quantité de cellules bêta obtenue dans chaque expérience est assez variable, ce qui peut entraîner une réduction de la fonction des cellules bêta dans plusieurs expériences.Dans le contexte de la recherche sur les cellules bêta à forte teneur en leptine dans le diabète, la disponibilité des donneurs d’œillets cadavériques est assez limitée. Par conséquent, l’utilisation de cellules bêta différenciées par cellules souches offre un approvisionnement illimité et abondant en cellules sécrétant de l’insuline. La différenciation des cellules bêta est une avancée cruciale dans notre domaine, offrant de nombreux avantages.Il nous permet d’explorer le développement et la fonction des cellules bêta, ce qui permet de mieux comprendre les causes du diabète et le dysfonctionnement des cellules bêta. Nous visons à utiliser cette technique pour nos recherches axées sur la génétique du diabète. Notre objectif principal est de nous concentrer sur la mutation de certains gènes qui peuvent influencer les cellules bêta et la fonction des œillets.Ce protocole facilitera donc l’accès à l’œillet humain dérivé de cellules souches pré-puissantes présentant des mutations d’intérêt.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic &#946;-cells. hPSCs can either be embryonic stem cells (hESCs) derived from the blastocyst or induced pluripotent cells (hiPSCs) generated directly from somatic cells using a reprogramming process. Here a video-based protocol is presented to outline the optimal culture and passage conditions for hPSCs, prior to their differentiation and subsequent generation of insulin-producing pancreatic cells. This methodology follows the six-stage process for &#946;-cell directed differentiation, wherein hPSCs differentiate into definitive endoderm (DE), primitive gut tube, posterior foregut fate, pancreatic progenitors, pancreatic endocrine progenitors, and ultimately pancreatic &#946;-cells. It is noteworthy that this differentiation methodology takes a period of 27 days to generate human pancreatic &#946;-cells. The potential of insulin secretion was evaluated through two experiments, which included immunostaining and glucose-stimulated insulin secretion.

This article presents a protocol for directed differentiation and functional analysis of &#946;-cell like cells. We describe optimal culture conditions and passages for human pluripotent stem cells before generating insulin-producing pancreatic cells. The six-stage differentiation progresses from definitive endoderm formation to functional &#946;-cell like cells secreting insulin in response to glucose.