Name: लेखक स्पॉटलाइट: प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से β-सेल भेदभाव में प्रगति और चुनौतियां
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements and Challenges in β-Cells Differentiation from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

इनेस चेरकौई को डायबिटीज यूके स्टूडेंटशिप (बीडीए 18/0005934) द्वारा जीएआर का समर्थन किया गया था, जो एक अन्वेषक पुरस्कार (212625/Z/18/Z) के लिए वेलकम ट्रस्ट को भी धन्यवाद देता है, एक कार्यक्रम अनुदान के लिए UKRI MRC (MR/R022259/1), प्रोजेक्ट ग्रांट के लिए डायबिटीज यूके (BDA16/0005485), स्टार्ट-अप फंड के लिए CRCHUM, जॉन आर. इवांस लीडर अवार्ड (CFI 42649) के लिए इनोवेशन कनाडा, परियोजना अनुदान के लिए एनआईएच-एनआईडीडीके (R01DK135268), और टीम अनुदान के लिए सीआईएचआर, जेडीआरएफ (सीआईएचआर-आईआरएससी:0682002550; जेडीआरएफ 4-एसआरए-2023-1182-एसएन)। केमिली डायोन और डॉ हैरी लीच मानव hiPSCs पीढ़ी और संस्कृति के साथ उनकी मदद के लिए, NIHR इंपीरियल BRC (बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर) ऑर्गेनॉइड सुविधा, लंदन।

भेदभाव शुरू करने से पहले, प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए आइलेट जैसे ऑर्गेनोइड की आवश्यक संख्या निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। 6 अच्छी प्लेट में, 80% से अधिक संगम वाले एक कुएं में आमतौर पर 2-2.3 मिलियन ए...

अग्नाशयी β-कोशिकाओं में मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को विभेदित करना

<ol>
	<li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine.">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Martin, G. 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L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+&#946;-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Pancreatic &#946;-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size.">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+&#946;-cell+differentiation.">Charting cellular identity during human in vitro &#946;-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li><li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+gene+disallowance,+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity.">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic &#946;-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li><li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INS(GFP/w)+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells.">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li><li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth.">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li></ol>

अग्नाशयी β-कोशिकाओं में एचपीएससी का सफल भेदभाव नियमित संवर्धन और चयनित एचपीएससी के पारित होने के सभी पहलुओं को अनुकूलित करने पर निर्भर करता है। इसमें यह सुनिश्चित करना शामिल है कि सेल लाइन में एक सामा?...

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) में विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर करने की अनूठी क्षमता होती है, जिससे वे मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बनजाते हैं। इन एचपीएससी को दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जाता है: भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी), ब्लास्टोसिस्ट2 से व्युत्पन्न, और प्रेरित प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं (एचआईपीएससी), सीधे दैहिक कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करके उत्पन्नहोती हैं 3. β कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए तकनीक के विकास, मौलिक अनुसंधान और नैदानिक अभ्यास 1,4 दोनों के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है. मधुमेह मेलिटस दुनिया भर में >400 मिलियन लोगों को प्रभावित करने वाली एक पुरानी बीमारी है और अग्नाशय की β-कोशिकाओं की खराबी या हानि के कारण ग्लाइसेमिया को विनियमित करने में शरीर की अक्षमता के परिणामस्वरूपहोती है। प्रत्यारोपण के लिए अग्नाशय आइलेट कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता मधुमेह 2,4,6,7 के लिए सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के विकास में बाधा उत्पन्न हुई है. एचपीएससी का उपयोग करके ग्लूकोज-उत्तरदायी इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को उत्पन्न करने की क्षमता मानव आइलेट विकास और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सेलुलर मॉडल के रूप में कार्य करती है। इसका उपयोग नियंत्रित वातावरण में मधुमेह के उपचार के लिए संभावित चिकित्सीय उम्मीदवारों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, एचपीएससी में अग्नाशयी आइलेट कोशिकाओं का उत्पादन करने की क्षमता होती है जो आनुवंशिक रूप से रोगी के समान होती हैं, प्रत्यारोपण 2,4,7के बाद प्रतिरक्षा अस्वीकृति के जोखिम को कम करती हैं।
हाल के वर्षों में, एचपीएससी संस्कृति और भेदभाव प्रोटोकॉल के शोधन में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, जिसके परिणामस्वरूप अग्नाशयीβ-कोशिकाओं 8,9उत्पन्न करने की दिशा में भेदभाव प्रक्रिया की दक्षता और प्रजनन क्षमता में वृद्धि हुई है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल अग्नाशय β कोशिकाओं के निर्देशित भेदभाव के आवश्यक चरणों की रूपरेखा. इसमें अलग-अलग समय बिंदुओं पर विशिष्ट सेल सिग्नलिंग मार्गों का विनियमन शामिल है। यह अग्नाशयी β-कोशिकाओं में एचपीएससी की पीढ़ी के लिए सुई एल एट अल.10 (2018) द्वारा विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है। प्रोटोकॉल को सुई एल एट अल.11 (2021) के हालिया अपडेट में समायोजित किया गया था, क्योंकि नवीनतम शोध β-कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ाने के लिए एफिडिकोलिन (एपीएच) उपचार का उपयोग करने के महत्व पर जोर देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रक्रिया के बाद के चरणों के दौरान माध्यम के लिए APH के अलावा भी शामिल है. इसके अलावा, प्रारंभिक प्रोटोकॉल की तुलना में भेदभाव के प्रारंभिक चरणों के दौरान माध्यम की संरचना में संशोधन किए गए हैं। एक उल्लेखनीय परिवर्तन दिन 6 पर केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ) को जोड़ना और दिन 8 तक जारी रखना है। केराटिनोसाइट ग्रोथ फैक्टर (केजीएफ) को दिन 6 से दिन 8 तक पेश किया जाता है, जो प्रारंभिक प्रोटोकॉल10 से थोड़ा अलग होता है, जहां केजीएफ को चरण 4 माध्यम में शामिल नहीं किया गया था।
β-सेल जैसी कोशिकाओं की पीढ़ी में पहला और आवश्यक कदम एचपीएससी का निश्चित एंडोडर्म (डीई) में निर्देशित भेदभाव है, एक आदिम रोगाणु परत जो अग्न्याशय सहित विभिन्न अंगों के उपकला अस्तर को जन्म देती है। डीई के गठन के बाद, कोशिकाएं आदिम आंत ट्यूब में भेदभाव से गुजरती हैं, जिसके बाद पीछे के अग्रदूत भाग्य के विनिर्देश होते हैं। पीछे का अग्रभाग तब अग्नाशयी पूर्वज कोशिकाओं में विकसित होता है, जिसमें अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन कोशिकाओं सहित अग्न्याशय के सभी प्रकार के सेल में अंतर करने की क्षमता होती है। प्रक्रिया में बाद के चरण में अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज शामिल होते हैं जो लैंगरहैंस के टापुओं में पाए जाने वाले हार्मोन-स्रावित कोशिकाओं को जन्म देते हैं। अंत में, भेदभाव प्रक्रिया कोशिकाओं 9,10 की तरह पूरी तरह कार्यात्मक अग्नाशय β सेल उत्पादन के द्वारा अपने अंतिम चरण तक पहुँचता है. यह इस प्रक्रिया जटिल है कि ध्यान दें और अक्सर इस तरह के विशिष्ट विकास कारकों और बाह्य मैट्रिक्स घटकों, दक्षता और भेदभाव 9,10 की विशिष्टता में सुधार करने के लिए के रूप में संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन की आवश्यकता है महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, इन विट्रो में एचपीएससी से कार्यात्मक β-सेल जैसी कोशिकाओं को उत्पन्न करना अभी भी एक बड़ी चुनौती है। चल रहे अनुसंधान भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार लाने और परिपक्वता और जिसके परिणामस्वरूपβ कोशिकाओं 9 के समारोह को बढ़ाने पर केंद्रित है.
इस प्रोटोकॉल में, संस्कृति और एचपीएससी के पारित होने के दौरान कोमल सेल पृथक्करण का उपयोग सेल व्यवहार्यता और प्लुरिपोटेंसी को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, अग्नाशयी β कोशिकाओं में भेदभाव की दक्षता में काफी सुधार करता है। इसके अतिरिक्त, प्रत्येक चरण-विशिष्ट माध्यम को सुई एल एट अल 10 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल के बाद सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया है ताकि मानव आइलेट से मिलते-जुलते समूहों में इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं की उच्च उपज को बढ़ावा दिया जा सके।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Starlabs</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 6-well plate&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G2654-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Insulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NKX6.1</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-49672SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3803-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/Magnesium free D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine-KAAD</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>239804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose,BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94046-100ML-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM plus GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td>For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J64904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound 118 mL</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, 22&#215;50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RepSox (Hydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Immu-mount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Endoderm&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4&#176;C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid Tormone 3 (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>38071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for generating functional pancreatic insulin-secreting cells from human pluripotent stem cells

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) किसी भी प्रकार की कोशिका में अंतर कर सकते हैं, जिससे वे मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं का एक उत्कृष्ट वैकल्पिक स्रोत बन जाते हैं। एचपीएससी या तो भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) हो सकते हैं जो ब्लास्टोसिस्ट से प्राप्त होते हैं या प्रेरित प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं (एचआईपीएससी) एक रिप्रोग्रामिंग प्रक्रिया का उपयोग करके सीधे दैहिक कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं। यहाँ एक वीडियो आधारित प्रोटोकॉल एचपीएससी के लिए इष्टतम संस्कृति और पारित होने की स्थिति की रूपरेखा प्रस्तुत किया है, उनके भेदभाव और इंसुलिन उत्पादक अग्नाशय कोशिकाओं के बाद पीढ़ी से पहले. यह पद्धति β-सेल निर्देशित भेदभाव के लिए छह-चरण की प्रक्रिया का अनुसरण करती है, जिसमें एचपीएससी निश्चित एंडोडर्म (डीई), आदिम आंत ट्यूब, पश्च अग्रगुट भाग्य, अग्नाशयी पूर्वज, अग्नाशयी अंतःस्रावी पूर्वज और अंततः अग्नाशयी β-कोशिकाओं में अंतर करते हैं। यह उल्लेखनीय है कि इस भेदभाव पद्धति को मानव अग्नाशयी β-कोशिकाओं को उत्पन्न करने में 27 दिनों की अवधि लगती है। इंसुलिन स्राव की क्षमता का मूल्यांकन दो प्रयोगों के माध्यम से किया गया था, जिसमें इम्यूनोस्टेनिंग और ग्लूकोज-उत्तेजित इंसुलिन स्राव शामिल थे।

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

लेखक स्पॉटलाइट: प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से β-सेल भेदभाव में प्रगति और चुनौतियां

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से कार्यात्मक अग्नाशयी इंसुलिन-स्रावित कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल एचपीएससी10 से β जैसी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक अत्यधिक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह प्रक्रिया एक 2 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करती है जो आसानी से स्केले?...

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यह लेख कोशिकाओं की तरह β सेल के निर्देशित भेदभाव और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। हम इंसुलिन उत्पादक अग्नाशय कोशिकाओं को उत्पन्न करने से पहले मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए इष्टतम संस्कृति की स्थिति और मार्ग का वर्णन करते हैं। छह-चरण भेदभाव निश्चित एंडोडर्म गठन से कार्यात्मक β-सेल जैसी कोशिकाओं तक ग्लूकोज के जवाब में इंसुलिन को स्रावित करने वाली कोशिकाओं की तरह आगे बढ़ता है।

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को मानव बीटा कोशिकाओं में परिवर्तित करने के लिए भेदभाव प्रक्रिया में एक उच्च और सुसंगत दक्षता प्राप्त करना एक उल्लेखनीय चुनौती है। यह चुनौती सटीकता और स्थिरता से प्रभावित होती है जिसके साथ प्रयोगकर्ता प्रोटोकॉल का पालन करता है। इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोग में प्राप्त बीटा कोशिकाओं की मात्रा कई प्रयोगों में बीटा कोशिकाओं के कम समारोह में परिणाम हो सकता है, जो काफी परिवर्तनशील है.मधुमेह में उच्च लेप्टिन बीटा सेल अनुसंधान के संदर्भ में, कैडेवरिक सुराख़ दाताओं की उपलब्धता काफी सीमित है। नतीजतन, स्टेम सेल विभेदित बीटा कोशिकाओं का उपयोग इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं की असीमित और प्रचुर मात्रा में आपूर्ति की पेशकश कर रहा है। बीटा सेल भेदभाव हमारे क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति है, जो कई लाभ प्रदान करता है।यह हमें बीटा कोशिकाओं के विकास और कार्य का पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे मधुमेह के कारणों और बीटा सेल डिसफंक्शन की गहरी समझ होती है। हम मधुमेह के आनुवंशिकी पर ध्यान केंद्रित करने वाले हमारे शोध के लिए इस तकनीक का उपयोग करना चाहते हैं। हमारा प्राथमिक उद्देश्य कुछ जीनों के उत्परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करना है जो बीटा कोशिकाओं और सुराख़ समारोह को प्रभावित कर सकते हैं।तो इस प्रोटोकॉल ब्याज की उत्परिवर्तन के साथ पूर्व शक्तिशाली स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न मानव सुराख़ के लिए उपयोग की सुविधा होगी.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic &#946;-cells. hPSCs can either be embryonic stem cells (hESCs) derived from the blastocyst or induced pluripotent cells (hiPSCs) generated directly from somatic cells using a reprogramming process. Here a video-based protocol is presented to outline the optimal culture and passage conditions for hPSCs, prior to their differentiation and subsequent generation of insulin-producing pancreatic cells. This methodology follows the six-stage process for &#946;-cell directed differentiation, wherein hPSCs differentiate into definitive endoderm (DE), primitive gut tube, posterior foregut fate, pancreatic progenitors, pancreatic endocrine progenitors, and ultimately pancreatic &#946;-cells. It is noteworthy that this differentiation methodology takes a period of 27 days to generate human pancreatic &#946;-cells. The potential of insulin secretion was evaluated through two experiments, which included immunostaining and glucose-stimulated insulin secretion.

This article presents a protocol for directed differentiation and functional analysis of &#946;-cell like cells. We describe optimal culture conditions and passages for human pluripotent stem cells before generating insulin-producing pancreatic cells. The six-stage differentiation progresses from definitive endoderm formation to functional &#946;-cell like cells secreting insulin in response to glucose.