Name: Autore in primo piano: Progressi e sfide nella differenziazione delle cellule β dalle cellule staminali pluripotenti
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements and Challenges in β-Cells Differentiation from Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ines Cherkaoui è stata sostenuta da una borsa di studio di Diabetes UK (BDA 18/0005934) a GAR, che ringrazia anche il Wellcome Trust for an Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC per una sovvenzione del programma (MR/R022259/1), Diabetes UK per la sovvenzione del progetto (BDA16/0005485), CRCHUM per i fondi di start-up, Innovation Canada per un John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) per una sovvenzione per un progetto e CIHR, JDRF per una sovvenzione di gruppo (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion e il dottor Harry Leitch per il loro aiuto nella generazione e nella cultura delle hiPSC umane, presso la struttura di organoidi NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre), Londra.

Prima di iniziare la differenziazione, si raccomanda di determinare il numero richiesto di organoidi simili a isole per scopi sperimentali. In una piastra a 6 pozzetti, un singolo pozzetto con una confluenza superiore all'80% è in genere costituito da 2-2,3 milioni di hPSC. Mentre una previsione accurata è difficile a causa delle variazioni nelle linee hPSC e nell'efficienza di differenziazione, una stima approssimativa è 1,5 volte il numero di pozzi iniziali. Una differenziazione diretta in modo efficace di solito pr...

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane in cellule β pancreatiche

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	<li>Kolios, G., Moodley, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+stem+cells+and+regenerative+medicine.">Introduction to stem cells and regenerative medicine.</a> Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells.">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).</li><li>Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+routes+to+the+generation+of+functional+&#946;-cells+for+diabetes+mellitus+cell+therapy.">Emerging routes to the generation of functional &#946;-cells for diabetes mellitus cell therapy.</a> Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Cell+Replacement+in+mice+using+human+Type+1+diabetes+nuclear+transfer+embryonic+stem+cells.">&#946;-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells.</a> Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells.">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).</li><li>Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. 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L., Egli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+&#946;-cell+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells.">Pancreatic &#946;-cell differentiation from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68 (2018).</li><li>Sui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+replication+fork+speed+promotes+pancreatic+endocrine+differentiation+and+controls+graft+size.">Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size.</a> JCI Insight. 6 (5), 141553 (2021).</li><li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+&#946;-cell+differentiation.">Charting cellular identity during human in vitro &#946;-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li><li>Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+functional+specialisations+of+the+pancreatic+&#946;-cell:+gene+disallowance,+mitochondrial+metabolism+and+intercellular+connectivity.">Metabolic and functional specialisations of the pancreatic &#946;-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity.</a> Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).</li><li>Micallef, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INS(GFP/w)+human+embryonic+stem+cells+facilitate+isolation+of+in+vitro+derived+insulin-producing+cells.">INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells.</a> Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).</li><li>Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+KGF+is+FGF-related+with+properties+of+a+paracrine+effector+of+epithelial+cell+growth.">Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth.</a> Science. 245 (4919), 752-755 (1989).</li></ol>

Il successo della differenziazione delle hPSC in cellule β pancreatiche dipende dall'ottimizzazione di tutti gli aspetti della coltura e del passaggio di routine delle hPSC selezionate. Ciò include la garanzia che la linea cellulare abbia un cariotipo normale, sia negativa per l'infezione da micoplasma e sia priva di genomi plasmidici o vettori virali. Inoltre, quando si utilizzano le hiPSC, è importante evitare di utilizzare i primi passaggi, che sono ancora in fase di riprogrammazione, per esperimenti pilota. Questi...

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) hanno la capacità unica di differenziarsi in vari tipi di cellule, il che le rende una valida alternativa alle cellule β pancreatiche umane1. Queste hPSC sono classificate in due tipi: cellule staminali embrionali (hESCs), derivate dalla blastocisti2, e cellule pluripotenti indotte (hiPSCs), generate dalla riprogrammazione diretta delle cellule somatiche3. Lo sviluppo di tecniche per differenziare le hPSC in cellule β ha importanti implicazioni sia per la ricerca di base che per la pratica clinica 1,4. Il diabete mellito è una malattia cronica che colpisce >400 milioni di persone in tutto il mondo e deriva dall'incapacità dell'organismo di regolare la glicemia a causa di un malfunzionamento o della perdita di cellule β pancreatiche5. La limitata disponibilità di cellule delle isole pancreatiche per il trapianto ha ostacolato lo sviluppo di terapie di sostituzione cellulare per il diabete 2,4,6,7. La capacità di generare cellule che secernono insulina sensibili al glucosio utilizzando hPSC funge da modello cellulare utile per studiare lo sviluppo e la funzione delle isole umane. Può anche essere utilizzato per testare potenziali candidati terapeutici per il trattamento del diabete in un ambiente controllato. Inoltre, le hPSC hanno il potenziale per produrre cellule delle isole pancreatiche geneticamente identiche al paziente, riducendo il rischio di rigetto immunitario dopo il trapianto 2,4,7.
Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nel perfezionamento dei protocolli di coltura e differenziazione delle hPSC, con conseguente aumento dell'efficienza e della riproducibilità del processo di differenziazione verso la generazione di cellule β pancreatiche 8,9.
Il seguente protocollo delinea le fasi essenziali della differenziazione diretta delle cellule β pancreatiche. Implica la regolazione di specifiche vie di segnalazione cellulare in punti temporali distinti. Si basa sul protocollo sviluppato da Sui L. et al.10 (2018) per la generazione di hPSC in cellule β pancreatiche. Il protocollo è stato adattato ai recenti aggiornamenti di Sui L. et al.11 (2021), poiché le ultime ricerche sottolineano l'importanza dell'utilizzo del trattamento con afidicolina (APH) per migliorare la differenziazione delle cellule β. L'attuale protocollo prevede l'aggiunta di APH al mezzo durante le fasi successive del processo. Inoltre, sono state apportate modifiche alla composizione del terreno durante le prime fasi di differenziazione rispetto al protocollo iniziale. Un cambiamento notevole è l'aggiunta del fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) il giorno 6 e continuando fino al giorno 8. Il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) viene introdotto dal giorno 6 al giorno 8, che differisce leggermente dal protocollo iniziale10, in cui KGF non era incluso nel terreno di stadio 4.
Il primo ed essenziale passo nella generazione di cellule simili a cellule β è la differenziazione diretta delle hPSC nell'endoderma definitivo (DE), uno strato germinale primitivo che dà origine al rivestimento epiteliale di vari organi, incluso il pancreas. Dopo la formazione di DE, le cellule subiscono la differenziazione nel tubo intestinale primitivo, a cui segue la specificazione del destino dell'intestino anteriore posteriore. L'intestino anteriore posteriore si sviluppa quindi in cellule progenitrici pancreatiche, che hanno il potenziale per differenziarsi in tutti i tipi di cellule del pancreas, comprese le cellule endocrine ed esocrine. La fase successiva del processo coinvolge i progenitori endocrini pancreatici che danno origine alle cellule che secernono ormoni che si trovano nelle isole di Langerhans. Alla fine, il processo di differenziazione raggiunge la sua fase finale producendo cellule pancreatiche simili a cellule β pancreatichecompletamente funzionali 9,10. È importante notare che questo processo è complesso e spesso richiede l'ottimizzazione delle condizioni di coltura, come fattori di crescita specifici e componenti della matrice extracellulare, per migliorare l'efficienza e la specificità del differenziamento 9,10. Inoltre, la generazione di cellule β simili a cellule funzionali da hPSC in vitro è ancora una sfida importante. La ricerca in corso si concentra sul miglioramento dei protocolli di differenziamento e sul miglioramento della maturazione e della funzione delle cellule β risultanti9.
In questo protocollo, l'uso della dissociazione cellulare delicata durante la coltura e il passaggio delle hPSC è essenziale per mantenere la vitalità e la pluripotenza cellulare, migliorando significativamente l'efficienza del differenziamento in cellule β pancreatiche. Inoltre, ogni terreno specifico per stadio è stato meticolosamente ottimizzato seguendo il protocollo sviluppato da Sui L. et al.10 per promuovere un'elevata resa di cellule che secernono insulina in cluster che assomigliano molto all'isolotto umano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Starlabs</td>
			<td>S1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 6-well plate&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>34425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Glucagon&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G2654-100UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Insulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NKX6.1</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-49672SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PDX1&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab84987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aphidicolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3803-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium/Magnesium free D-PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine-KAAD</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>239804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose,BioXtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phosphate, anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94046-100ML-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM plus GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10566016</td>
			<td>For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10149870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20821.33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma-Secretase Inhibitor XX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J64904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHG0094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>295426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG4582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN193189</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0559-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound 118 mL</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGR1180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular cover glasses, 22&#215;50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RepSox (Hydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon Immu-mount</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>9990402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dihydrogen phosphate anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Endoderm&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFlex Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A3349401</td>
			<td>Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4&#176;C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thyroid Tormone 3 (T3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypL Express Enzyme (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>38071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z4750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for generating functional pancreatic insulin-secreting cells from human pluripotent stem cells

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula, rendendole un'eccellente fonte alternativa di cellule β pancreatiche umane. Le hPSC possono essere cellule staminali embrionali (hESC) derivate dalla blastocisti o cellule pluripotenti indotte (hiPSC) generate direttamente da cellule somatiche utilizzando un processo di riprogrammazione. Qui viene presentato un protocollo basato su video per delineare le condizioni ottimali di coltura e passaggio per le hPSC, prima della loro differenziazione e della successiva generazione di cellule pancreatiche produttrici di insulina. Questa metodologia segue il processo in sei fasi per la differenziazione diretta a β cellule, in cui le hPSC si differenziano in endoderma definitivo (DE), tubo intestinale primitivo, destino dell'intestino anteriore posteriore, progenitori pancreatici, progenitori endocrini pancreatici e, infine, cellule β pancreatiche. È interessante notare che questa metodologia di differenziazione impiega un periodo di 27 giorni per generare cellule β pancreatiche umane. Il potenziale della secrezione di insulina è stato valutato attraverso due esperimenti, che includevano l'immunocolorazione e la secrezione di insulina stimolata dal glucosio.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the unique ability to differentiate into various cell types, making them a viable alternative to human pancreatic &#946;-cells1. These hPSCs are categorized into two types: embryonic stem cells (hESCs), derived from the blastocyst2, and induced pluripotent cells (hiPSCs), generated by reprogramming somatic cells directly3. The development of techniques to differentiate hPSCs into &#946;-cells, has important implications for both fundamental research and clinical practice1,4. Diabetes mellitus is a chronic disease affecting &#62;400 million people worldwide and results from the inability of the body to regulate glycemia due to malfunction or loss of pancreatic &#946;-cells5. The limited availability of pancreatic islet cells for transplantation has hindered the development of cell replacement therapies for diabetes2,4,6,7. The ability to generate glucose-responsive insulin-secreting cells using hPSCs serves as a useful cellular model for studying human islet development and function. It can also be used to test potential therapeutic candidates for diabetes treatment in a controlled environment. Moreover, hPSCs have the potential to produce pancreatic islet cells that are genetically identical to the patient, reducing the risk of immune rejection after transplantation2,4,7.
In recent years, there have been significant advancements in the refinement of hPSC culture and differentiation protocols, resulting in increased efficiency and reproducibility of the differentiation process toward generating pancreatic &#946;-cells8,9.
The following protocol outlines the essential stages of directed differentiation of pancreatic &#946;-cells. It involves the regulation of specific cell signaling pathways at distinct time points. It is based on the protocol developed by Sui L. et al.10 (2018) for the generation of hPSCs into pancreatic &#946;-cells. The protocol was adjusted to recent updates from Sui L. et al.11 (2021), as the latest research emphasizes the significance of using aphidicolin (APH) treatment to enhance the differentiation of &#946;-cells. The current protocol includes the addition of APH to the medium during the later stages of the process. Furthermore, modifications have been made to the composition of the medium during the early stages of differentiation compared to the initial protocol. A notable change is the addition of Keratinocyte Growth Factor (KGF) on Day 6 and continuing until Day 8. The keratinocyte growth factor (KGF) is introduced from day 6 to day 8, which slightly differs from the initial protocol10, where KGF was not included in the stage 4 medium.
The first and essential step in the generation of &#946;-cell-like cells is the directed differentiation of hPSCs into definitive endoderm (DE), a primitive germ layer that gives rise to the epithelial lining of various organs, including the pancreas. After the formation of DE, the cells undergo differentiation into the primitive gut tube, which is followed by the specification of the posterior foregut fate. The posterior foregut then develops into pancreatic progenitor cells, which have the potential to differentiate into all cell types of the pancreas, including the endocrine and exocrine cells. The subsequent stage in the process involves pancreatic endocrine progenitors giving rise to the hormone-secreting cells found in the islets of Langerhans. In the end, the differentiation process reaches its final stage by producing fully functional pancreatic &#946;-cell like cells9,10. It is important to note that this process is complex and often requires optimization of the culture conditions, such as specific growth factors and extracellular matrix components, to improve the efficiency and specificity of differentiation9,10. Furthermore, generating functional &#946;-cell like cells from hPSCs in vitro is still a major challenge. Ongoing research focuses on improving differentiation protocols and enhancing the maturation and function of the resulting &#946;-cells9.
In this protocol, the use of gentle cell dissociation during the culture and passage of hPSCs is essential to maintain cell viability and pluripotency, significantly improving the efficiency of differentiation into pancreatic &#946;-cells. Additionally, each stage-specific medium has been meticulously optimized following the protocol developed by Sui L. et al.10 to promote a high yield of insulin-secreting cells in clusters that closely resemble the human islet.

Autore in primo piano: Progressi e sfide nella differenziazione delle cellule β dalle cellule staminali pluripotenti

Protocollo ottimizzato per la generazione di cellule pancreatiche funzionali secernenti insulina da cellule staminali pluripotenti umane

Attaining a high and consistent efficiency in the differentiation process for converting pluripotent stem cells into human beta cells is a notable challenge. This challenge is influenced by the precision and the consistency with which the experimenter follows the protocol. Moreover, the amount of beta cells obtained in each experiment is quite variable, which may result in the reduced function of beta cells across multiple experiments.In the context of high leptin beta cell research in diabetes, the availability of cadaveric eyelet donors is quite limited. Consequently, the use of stem cell differentiated beta cells is offering an unlimited and abundant supply of insulin secreting cells. Beta cell differentiation is a pivotal advancement in our field, offering numerous benefits.It allows us to explore the development and function of beta cells, leading to a deeper understanding of diabetes causes and beta cell dysfunction. We aim to use this technique for our research focusing on the genetics of diabetes. Our primary objective is to focus on mutation of certain genes that can influence beta cells and eyelet function.So this protocol will facilitate the access to human eyelet derived from pre-potent stem cells with mutations of interest.

Il protocollo descritto in questo articolo offre un approccio altamente efficiente per differenziare le cellule β-like dalle hPSC10. Questo processo utilizza un sistema di coltura 2D facilmente scalabile, che ne consente l'uso in vari contesti sperimentali, come la differenziazione dell'apprendimento, progetti e laboratori più piccoli e test pilota per valutare il potenziale di una linea di iPSC per la differenziazione.
È essenziale caratterizzare le proprietà funzi...

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Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione diretta e l'analisi funzionale di cellule simili a cellule β. Descriviamo le condizioni e i passaggi di coltura ottimali per le cellule staminali pluripotenti umane prima di generare cellule pancreatiche produttrici di insulina. La differenziazione a sei stadi progredisce dalla formazione definitiva dell'endoderma alle cellule funzionali simili a cellule β che secernono insulina in risposta al glucosio.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

Raggiungere un'efficienza elevata e costante nel processo di differenziazione per la conversione delle cellule staminali pluripotenti in cellule beta umane è una sfida notevole. Questa sfida è influenzata dalla precisione e dalla coerenza con cui lo sperimentatore segue il protocollo. Inoltre, la quantità di cellule beta ottenute in ogni esperimento è piuttosto variabile, il che può comportare una riduzione della funzione delle cellule beta in più esperimenti.Nel contesto della ricerca sulle cellule beta ad alto contenuto di leptina nel diabete, la disponibilità di donatori di occhielli da cadavere è piuttosto limitata. Di conseguenza, l'uso di cellule beta differenziate da cellule staminali offre un apporto illimitato e abbondante di cellule secernenti insulina. La differenziazione delle cellule beta è un progresso fondamentale nel nostro campo, che offre numerosi vantaggi.Ci permette di esplorare lo sviluppo e la funzione delle cellule beta, portando a una comprensione più profonda delle cause del diabete e della disfunzione delle cellule beta. Miriamo a utilizzare questa tecnica per la nostra ricerca incentrata sulla genetica del diabete. Il nostro obiettivo primario è quello di concentrarci sulla mutazione di alcuni geni che possono influenzare le cellule beta e la funzione degli occhielli.Quindi questo protocollo faciliterà l'accesso all'occhiello umano derivato da cellule staminali pre-potenti con mutazioni di interesse.

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Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic &#946;-cells. hPSCs can either be embryonic stem cells (hESCs) derived from the blastocyst or induced pluripotent cells (hiPSCs) generated directly from somatic cells using a reprogramming process. Here a video-based protocol is presented to outline the optimal culture and passage conditions for hPSCs, prior to their differentiation and subsequent generation of insulin-producing pancreatic cells. This methodology follows the six-stage process for &#946;-cell directed differentiation, wherein hPSCs differentiate into definitive endoderm (DE), primitive gut tube, posterior foregut fate, pancreatic progenitors, pancreatic endocrine progenitors, and ultimately pancreatic &#946;-cells. It is noteworthy that this differentiation methodology takes a period of 27 days to generate human pancreatic &#946;-cells. The potential of insulin secretion was evaluated through two experiments, which included immunostaining and glucose-stimulated insulin secretion.

This article presents a protocol for directed differentiation and functional analysis of &#946;-cell like cells. We describe optimal culture conditions and passages for human pluripotent stem cells before generating insulin-producing pancreatic cells. The six-stage differentiation progresses from definitive endoderm formation to functional &#946;-cell like cells secreting insulin in response to glucose.