Name: Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-01-19T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion at JoVE.com

कोई नहीं।

प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले संक्षिप्ताक्षर पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
1. समाधान और बफ़र्स की तैयारी
नोट: सभी अभिकर्मकों के वाणिज्यिक विवरण सामग्री की ताल...

Enrichment of Host Cell Proteins in Monoclonal Antibody Drug Products

<ol>
	<li>Aboulaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+monitor+clearance+of+host+cell+proteins+associated+with+monoclonal+antibodies.">A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies.</a> Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).</li><li>Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+removal+from+biopharmaceutical+preparations:+Towards+the+implementation+of+quality+by+design.">Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design.</a> Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).</li><li>Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+host+cell+protein+product-associated+impurities+in+monoclonal+antibody+bioprocessing.">Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing.</a> Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).</li><li>Molden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+profiling+of+commercial+therapeutic+protein+drugs+as+a+benchmark+for+monoclonal+antibody-based+therapeutic+protein+development.">Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development.</a> MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).</li><li>Bee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trace+levels+of+the+CHO+host+cell+protease+cathepsin+D+caused+particle+formation+in+a+monoclonal+antibody+product.">Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).</li><li>Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+host+cell+protein+(HCP)+identification+during+process+development+and+manufacturing+linked+to+a+risk-based+management+for+their+control.">The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).</li><li>Chiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+a+difficult-to-remove+CHO+host+cell+protein,+lipoprotein+lipase,+for+improved+polysorbate+stability+in+monoclonal+antibody+formulations.">Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).</li><li>Gilgunn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+tracking+of+problematic+host+cell+proteins+removed+by+a+synthetic,+highly+functionalized+nonwoven+media+in+downstream+bioprocessing+of+monoclonal+antibodies.">Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies.</a> Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).</li><li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+polysorbate-degrading+enzymes+in+a+monoclonal+antibody+formulation.">Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).</li><li>Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysorbates+20+and+80+degradation+by+group+XV+lysosomal+phospholipase+A2+isomer+X1+in+monoclonal+antibody+formulations.">Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).</li><li>Jones, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;High-risk&amp;#34;+host+cell+proteins+(HCPs):+A+multi-company+collaborative+view.">34;High-risk&amp;#34; host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view.</a> Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+residual+host+cell+protein+hexosaminidase+B+associated+with+N-glycan+degradation+during+the+stability+study+of+a+therapeutic+recombinant+monoclonal+antibody+product.">Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product.</a> Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).</li><li>Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+specific+causes+of+polysorbate+20+degradation+in+monoclonal+antibody+formulations+containing+multiple+lipases.">Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases.</a> Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).</li><li>Zhang, S., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+polysorbate+20+by+Sialate+O-Acetylesterase+in+monoclonal+antibody+formulations.">Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).</li><li>Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+polysorbate+80+degradation+by+liver+carboxylesterase+in+a+monoclonal+antibody+formulated+drug+substance+at+early+stage+development.">Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).</li><li>Gunawan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+platform+host+cell+protein+ELISA+to+process-specific+host+cell+protein+ELISA.">Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA.</a> Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).</li><li>Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+molecular+weight+cutoff+enrichment.">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment.</a> Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).</li><li>Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+host+cell+protein+analysis+in+monoclonal+antibody+products+through+ProteoMiner.">Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner.</a> Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).</li><li>Doneanu, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+of+low-abundance+host+cell+protein+impurities+in+high-purity+monoclonal+antibodies+down+to+1+ppm+using+ion+mobility+mass+spectrometry+coupled+with+multidimensional+liquid+chromatography.">Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography.</a> Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+sample+preparation+for+shotgun+proteomics+characterization+of+HCPs+in+antibodies.">A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).</li><li>Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FAIMS,+Protein+A+depletion,+and+native+digest+conditions+enables+deep+proteomic+profiling+of+host+cell+proteins+in+monoclonal+antibodies.">Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies.</a> Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).</li><li>Kreimer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+protein+profiling+by+targeted+and+untargeted+analysis+of+data+independent+acquisition+mass+spectrometry+data+with+parallel+reaction+monitoring+verification.">Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).</li><li>Madsen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+characterization+of+host+cell+proteins+in+biotherapeutics+via+affinity+depletions,+LC-MS/MS,+and+multivariate+analysis.">Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis.</a> MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).</li><li>Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+sensitive+method+for+deep+profiling+of+host+cell+proteins+in+therapeutic+antibodies+by+combining+ultra-low+trypsin+concentration+digestion,+long+chromatographic+gradients,+and+boxcar+mass+spectrometry+acquisition.">Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition.</a> Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).</li><li>Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+LC-MS-Based+workflow+with+robust+0.1+ppm+sensitivity+for+identifying+residual+HCPs+in+biotherapeutic+products.">Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products.</a> Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).</li><li>Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+tracking+of+host+cell+proteins+during+monoclonal+antibody+purifications+using+mass+spectrometry.">Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry.</a> MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+phospholipase+B-Like+2+is+not+responsible+for+polysorbate+degradation+in+monoclonal+antibody+drug+products.">Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).</li><li>Zhang, J., He, J., Smith, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acids+can+induce+the+formation+of+proteinaceous+particles+in+monoclonal+antibody+formulations.">Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).</li><li>Uniprot1. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2023).</li><li>Uniprot2. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2023).</li></ol>

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन संवर्धन मोतियों के दो संस्करण हैं: एक छोटी क्षमता के साथ और दूसरा बड़ी क्षमता के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें)। संवर्धन मोतियों के दोनों संस्करणों में पैकेज में ?...

मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो मेजबान जीव की सेल संस्कृति से जारी होती हैं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी)1,2,3,4के साथ सह-शुद्ध होती हैं। एचसीपी का ट्रेस स्तर दवा उत्पाद 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 की गुणवत्ता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, उप-पीपीएम से पीपीएम स्तरों में एचसीपी का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील एचसीपी विश्लेषण विधि वांछित है।
कम बहुतायत में एचसीपी का पता लगाने के लिए ऑर्थोगोनल विधियों को लागू किया जा सकता है। एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) आम तौर पर समग्र एचसीपी मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और यह भी इसी एंटीबॉडी16 उपलब्ध हैं, तो यह भी पता लगाने और व्यक्तिगत एचसीपी मात्रा निर्धारित कर सकते हैं. हालांकि, एचसीपी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन समय लेने वाली और श्रम-गहन है। इसके विपरीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमैटोग्राफी एमएबी दवा उत्पादों में व्यक्तिगत एचसीपी के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकती है और एचसीपी पहचान के लिए व्यापक रूप से लागू होती है 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
एमएस के साथ एचसीपी का पता लगाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें सीमित पाचन20, निस्पंदन17, प्रोटीन ए विलोपन21, इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी), और प्रोटीन माइनर संवर्धन (पीएम)18शामिल हैं। अधिकांश विधियों का उद्देश्य एमएबी की मात्रा को कम करना और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण से पहले एचसीपी को समृद्ध करना है, जिससे एमएबी पेप्टाइड्स और एचसीपी पेप्टाइड्स के बीच गतिशील रेंज कम हो जाती है। यह प्रोटोकॉल एक प्रोटिओमिक नमूना संवर्धन विधि प्रस्तुत करता है जो प्रोटिओमाइनर प्रौद्योगिकी और सीमित पाचन (पीएमएलडी)28को जोड़ती है। ProteoMiner संवर्धन सिद्धांत में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करना शामिल है जिसमें कॉम्बिनेटरियल पेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। ये लिगैंड विशेष रूप से एंटीबॉडी-ड्रग उत्पादों पर प्रोटीन से बंधते हैं, जिससे अतिरिक्त अणुओं को हटाने की अनुमति मिलती है, जबकि उनके संबंधित आत्मीयता लिगैंड पर कम-बहुतायत वाले मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को केंद्रित किया जाता है। दूसरी ओर, सीमित पाचन के सिद्धांत में ट्रिप्सिन की कम सांद्रता का उपयोग करना शामिल है। यह एकाग्रता कम मात्रा वाले एचसीपी को पचाने के लिए पर्याप्त है लेकिन सभी एंटीबॉडी दवा उत्पादों को पचाने के लिए पर्याप्त नहीं है। यह दृष्टिकोण समाधान से पचाने वाले एचसीपी पेप्टाइड्स की वसूली और संवर्धन को सक्षम बनाता है।
निस्पंदन विधियों की तुलना में, पीएमएलडी तकनीक का पता लगाया एचसीपी17 के आकार से सीमित नहीं है. प्रोटीन एक विलोपन विधियां एंटीबॉडी21 से जुड़े एचसीपी का पता लगाने के लिए विशिष्ट हैं, जबकि इम्यूनोप्रिपिटेशन एक विशेष सेल लाइन (जैसे चीनी हम्सटर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन) से पूर्वनिर्धारित एचसीपी तक सीमित है, जहां एक एंटी-एचसीपी एंटीबॉडीउत्पन्न हुई थी 4. इसके विपरीत, पीएमएलडी को किसी भी दवा मॉड्यूल से एचसीपी का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है और विभिन्न सेल लाइनों से दवा उत्पादों के साथ सह-शुद्ध सेल प्रोटीन होस्ट किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, पीएमएलडी उल्लिखित विधियों 17,18,20,21,24 की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता प्रदर्शित करता है।
यह दृष्टिकोण एचसीपी एकाग्रता को 7000 गुना तक समृद्ध कर सकता है और पता लगाने की सीमा को 0.002 पीपीएम28 तक कम कर सकता है। प्रयोगात्मक सेटअप चित्रा 1 में सचित्र है.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>91016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm &#215; 0.075 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>164535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade&#160;</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>LS120-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 analytical column (0.075 mm &#215; 1.7 &#956;m &#215; 30 cm, 100 &#197;)</td>
			<td>CoAnn Technologies</td>
			<td>HEB07503001718I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5405000646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A39255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GL-Tip GC</td>
			<td>GL Sciences Inc&#160;&#160;</td>
			<td>7820-11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in-house mAb</td>
			<td>Regeneron</td>
			<td></td>
			<td>concentration 200 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A39271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>149320025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Histidine monohydrochloride monohydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>53370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>A456-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Millpore</td>
			<td>30035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Exploris 480</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BRE725539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf (VWR)</td>
			<td>22431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 2.0 mL</td>
			<td>Eppendorf (VWR)</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discoverer software 2.4</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1633007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1633006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate (SDC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7970010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoracetic acid (TFA)</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>28904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (Sequencing Grade Modified)&#160; (5 x 20 ug)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Revolver Rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltiMate 3000 RSLC nano system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15568-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade&#160;</td>
			<td>Fisher-Scientific</td>
			<td>LS118-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

host cell protein analysis using enrichment beads coupled with limited digestion

मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) अशुद्धियां हैं जो चिकित्सीय प्रोटीन पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकती हैं, यहां तक कि कम मात्रा में भी। दवा उत्पादों से जुड़े संभावित जोखिमों का मूल्यांकन करने के लिए, कम बहुतायत वाले एचसीपी की पहचान करने के लिए तरीके विकसित किए गए हैं। एक संवेदनशील एचसीपी डिटेक्शन विधि विकसित करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण में एचसीपी को समृद्ध करना शामिल है, साथ ही विश्लेषण से पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबीएस) को हटाना, तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) का उपयोग करना।
इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटिओम संवर्धन मोती का उपयोग मेजबान सेल प्रोटीन को समृद्ध करने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करता है. इन मोतियों में विभिन्न प्रोटीनों के लिए विशिष्ट समानता के साथ हेक्सापेप्टाइड लिगैंड की एक विविध लाइब्रेरी होती है। प्रोटोकॉल में नैनो एलसी-एमएस / एमएस का उपयोग करके सीमित पाचन और बाद में पेप्टाइड का पता लगाना भी शामिल है। इन तकनीकों को नियोजित करके, कम बहुतायत वाले एचसीपी को 7000 गुना से अधिक समृद्ध किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप 0.002 पीपीएम जितनी कम प्रभावशाली पहचान सीमा होती है। गौरतलब है कि यह प्रोटोकॉल एनआईएसटी एमएबी का उपयोग करके उच्च स्तर के आत्मविश्वास के साथ 850 एचसीपी का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसे उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाया गया है और इसके कार्यान्वयन में सहायता के लिए एक वीडियो प्रदर्शन शामिल है। इन चरणों का पालन करके, शोधकर्ता एचसीपी को प्रभावी ढंग से समृद्ध और पहचान सकते हैं, जिससे दवा उत्पादों के लिए जोखिम मूल्यांकन की संवेदनशीलता और सटीकता बढ़ जाती है।

Host Cell Protein Analysis using Enrichment Beads Coupled with Limited Digestion

इस प्रोटोकॉल एक नमूना तैयारी कार्यप्रवाह प्रस्तुत किया, सीमित पाचन के साथ युग्मित प्रोटीन संवर्धन कहा जाता है (PMLD), एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) नमूने में मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) के विश्लेषण के लि?...

Watch this Scientific Journal Video about Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion at JoVE.com

Detecting Low-Abundant Host Cell Proteins in Drug Products Using Enrichment Beads and Limited Digestion (Video) | JoVE

दवा उत्पादों (डीपी) से मेजबान सेल प्रोटीन (एचसीपी) को समृद्ध करने और प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करके पेप्टाइड्स का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है। विधि को इन-हाउस निर्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) दवा पदार्थ (डीएस) का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, जो प्रदर्शन के संदर्भ में विभिन्न तरीकों के मूल्यांकन और तुलना के लिए एक अच्छी तरह से विशेषता संदर्भ सामग्री है।

सीमित पाचन के साथ युग्मित संवर्धन मोती का उपयोग करके मेजबान सेल प्रोटीन विश्लेषण

Host cell proteins (HCPs) are impurities that can adversely affect therapeutic proteins, even in small quantities. To evaluate the potential risks ...

हमने प्रोटिओम संवर्धन मोतियों का उपयोग करके दवा उत्पाद से उन कम-प्रचुर मात्रा में मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि विकसित की है। यह दृष्टिकोण हमें मूल कारण और दवा उत्पाद से जुड़े जोखिम को खोजने में मदद करता है। एचसीपी विश्लेषण की पहचान सीमा में सुधार करने के कई तरीके हैं, अलक्षित विधि सहित लेकिन प्रोटीन ए की कमी, सीमित पाचन, आणविक भार कटऑफ, इम्यूनोप्रिपिटेशन तक सीमित नहीं है।मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगाने का लक्षित तरीका, जिसमें तरल क्रोमैटोग्राफी, एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी और गैर-तरल क्रोमैटोग्राफी समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी शामिल है। इन एचसीपी विश्लेषण के साथ सहयोगी प्रमुख चुनौती एंटीबॉडी दवा और मेजबान सेल प्रोटीन के बीच महत्वपूर्ण गतिशील रेंज है। इसलिए अधिकांश विधि एंटीबॉडी पेप्टाइड्स और एचसीपी पेप्टाइड्स के बीच गतिशील रेंज को कम करने के लिए एलसीएमएस विश्लेषण से पहले एंटीबॉडी और समृद्ध एचसीपी की मात्रा को कम करने का लक्ष्य रखती है।इसलिए ProteoMiner तकनीक और सीमित पाचन प्रोटोकॉल अन्य तरीकों की तुलना में HCP विश्लेषण की पहचान सीमा में काफी सुधार करता है। यह इम्यूनोप्रिपिटेशन की तुलना में गैर-पक्षपाती है और प्रोटीन ए रिक्तीकरण विधि की तुलना में विभिन्न दवा मॉड्यूल पर लागू किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल भी सरल और सीधा है।इसलिए ProteoMiner तकनीक और सीमित पाचन प्रोटोकॉल हमें कई एचसीपी की पहचान करने में मदद करते हैं जो पॉलीसॉर्बेट और फ्रैगमेंट एंटीबॉडी दवा को नीचा दिखाते हैं। नैनो एलसीएमपीआरएम विधि के संयोजन में, संवर्धन विधि समस्याग्रस्त मेजबान सेल प्रोटीन की जैविक प्रासंगिक एकाग्रता को खोजने के लिए मात्रात्मक परिणाम भी प्रदान कर सकती है।