Name: RNA FISH for Locating lncRNA-SNHG6 in Osteosarcoma Cells (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA FISH for Locating lncRNA-SNHG6 in Osteosarcoma Cells at JoVE.com

Эта работа поддержана грантами (1) Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (2) Национальный фонд естественных наук (81973877 и 82174408); (3) Шанхайский совместный инновационный центр промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах; (4) Исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).

См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе. На рисунке 1 показан общий протокол для RNA FISH; Таблица 1 содержит состав всех растворов, а таблица 2 содержит...

FISH for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Этот протокол RNA FISH может не только обнаруживать локализацию днкРНК в клетках, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков в клетках, что также может быть использовано для обнаружения местоположения днкРНК в тканях, погруженных в парафин. Однако конкретный протокол в так?...

Наше понимание генома человека значительно расширилось благодаря недавним достижениям в области полногеномных технологий. Около 93% генома человека могут быть транскрибированы в РНК, но только 2% РНК могут быть транстранслированы в белки; остальные 98% РНК, которые не имеют функции трансляции белков, называются некодирующими РНК (нРНК)1. Как класс некодирующих РНК (нРНК), длинные нРНК (днкРНК), содержащие более 200 нуклеотидов2, привлекают все большее внимание в связи с их участием во многих физиологических и патологических процессах клеток, таких как дифференцировка, контроль цикла, апоптоз, миграция и инвазия 3,4,5 . LncRNA играют свою роль через различные механизмы, такие как регуляция структуры хроматина и экспрессии ядерных генов, контроль процесса сплайсинга мРНК и посттранскрипционная модификация6. ДнкРНК регулируют возникновение, развитие и метастазирование злокачественных новообразований как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Транскрипционная регуляция реализуется в ядре путем воздействия на транскрипцию РНК через связывание с хромосомными структурами, в то время как посттранскрипционная регуляция осуществляется в цитоплазме путем управления генами-мишенями через механизм эндогенной конкурентной РНК (цРНК) 5,7,8. CeRNA выявила новый механизм взаимодействия РНК, а именно, что днкРНК могут действовать как губка, адсорбируя микроРНК и ингибируя опосредованную микроРНК деградацию родственных генов-мишеней9. Таким образом, информация о субклеточной локализации днкРНК, независимо от того, находится ли конкретная днкРНК в цитоплазме или ядре, важна для определения их биологических функций.
В настоящее время локализация днкРНК в основном определяется двумя методами: методом выделения фракции ядра/цитоплазмы и РНК FISH. В первом случае выделяют РНК в цитоплазматической и ядерной фракциях соответственно, а затем проводят ПЦР-амплификацию со специфическими праймерами днкРНК для определения соотношения днкРНК в цитоплазме и ядре. Преимуществом этого метода является экономия времени, в то время как недостатком является то, что фактическая локализация днкРНК не отражается напрямую на относительной доле днкРНК в цитоплазме и ядре. РНК FISH может обнаруживать локализацию днкРНК в клетках путем разработки специфичных для днкРНК антисмысловых цепных последовательностей с последующим мечением флуоресцентными красителями10. Методы RNA FISH были усовершенствованы благодаря достижениям в области зондовых техник и методов обнаружения, включая множественные наборы олигозондов, меченные флуорофорами11, зонды LNA 12 и зонды с разветвленной ДНК (бДНК)13. RNA FISH может не только обнаруживать локализацию lncRNA, но и обнаруживать колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции14.
В данной работе в качестве примера был включен подробный протокол обнаружения внутриклеточной локализации малоядрышковой РНК гена хозяина 6 (SNHG6) lncRNA в клетках остеосаркомы (143B) с помощью РНК FISH. SNHG6 представляет собой 600-730 нуклеотидную днкРНК в зрелой сплайсированной форме и идентифицирован как новый онкоген при различных видах рака человека, включая колоректальный рак, рак желудка, светлоклеточную карциному яичников, остеосаркому и гепатоцеллюлярную карциному15,16,17,18. Исследования подтвердили участие SNHG6 в биологическом поведении раковых клеток, таком как пролиферация, ЭМП и аутофагия, и показали цитоплазматическую локализацию SNHG6, где он может влиять на гены-мишени путем связывания (губирования) микроРНК15,16,17. В статье представлен подробный протокол детектирования внутриклеточной локализации SNHG6 с помощью РНК FISH.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Изучена важная роль длинных некодирующих РНК (днкРНК) в раке, такая как регуляция пролиферации, эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), миграция, инфильтрация и аутофагия раковых клеток. Локализация днкРНК в клетках может дать представление об их функциях. Путем разработки последовательности антисмысловой цепи, специфичной для днкРНК, с последующим мечением флуоресцентными красителями, флуоресцентная гибридизация РНК in situ (FISH) может быть применена для обнаружения клеточной локализации днкРНК. Вместе с развитием микроскопии методы RNA FISH теперь позволяют визуализировать даже плохо экспрессируемые днкРНК. Этот метод позволяет не только обнаружить локализацию только днкРНК, но и обнаружить колокализацию других РНК, ДНК или белков с помощью двухцветной или многоцветной иммунофлуоресценции. Здесь мы включили подробную процедуру экспериментальной эксплуатации и меры предосторожности RNA FISH на примере lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) в клетках остеосаркомы человека (143B), чтобы обеспечить справочную информацию для исследователей, которые хотят проводить эксперименты с РНК FISH, особенно с lncRNA FISH.

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

Представлены репрезентативные изображения SNHG6 FISH в клетках остеосаркомы человека (рис. 2). Отрицательный элемент управления обрабатывается отрицательным зондом Ctrl; положительный контроль обрабатывается зондом U6 20. Зонд SNHG6 и зонд U6 помечены Cy3, который излу?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA FISH for Locating lncRNA-SNHG6 in Osteosarcoma Cells at JoVE.com

RNA FISH for Locating lncRNA-SNHG6 in Osteosarcoma Cells (Video) | JoVE

В настоящем протоколе описан метод флуоресцентной гибридизации РНК in situ для локализации днкРНК в клетках остеосаркомы человека.

Флуоресцентная гибридизация РНК in situ для длительной некодирующей локализации РНК в клетках остеосаркомы человека

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Цель нашего исследования состоит в том, чтобы предоставить подробный протокол RNA FISH, который является справочным материалом для ученых, которые хотят проводить эксперименты с РНК FISH. Наши исследования установили, что РНК FISH может быть использована для локализации днкРНК в клетках остеосаркомы человека. Наш протокол обеспечил всестороннюю экспериментальную процедуру и меры предосторожности для РНК FISH с использованием lncRNA-SNHG6 в клетках остеосаркомы человека в качестве эталона.