Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

تم توفير الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران من قبل الدكتور جورج ليكوترافيتيس وشيجو جو من قسم الهندسة الطبية الحيوية في جامعة كونيتيكت (ستورز ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم الحصول على أداة Abberior STED الموجودة في مرفق الفحص المجهري الضوئي المتقدم في مركز موارد ومعدات الأبحاث المفتوحة مع منحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD023618 الممنوحة لكريستوفر أوكونيل. تم تمويل هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01AG065879 الممنوحة لناثان إن ألدر.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يقدم هذا البروتوكول استخدام خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران مع صبغة PKMO الجديدة التي تستهدف IMM لتصوير الخلايا الحية STED. نظرا لحداثة PKMO ، لا يوجد حاليا سوى القليل المنشور باستخدام هذه الصبغة للتصوير المباشر للأمراض المنقولة جنسيا. يشكل استخدام هذه الأنواع من الخلايا لتصوير الأمراض المنقولة جنسيا تحديات ، خاصة لأن الخلايا العصبية تحتوي على ميتوكوندريا أضيق. أحد قيود هذا البروتوكول هو صبغة PKMO المستخدمة ، لأنها يمكن أن تكون سامة للخلايا. تستجيب الخلايا وخطوط الخلايا المختلفة بشكل مختلف للصبغة ، وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على تركيز الصبغة ووقت الحضانة لتحسين النتائج للحصول على إشارة قوية دون الإضرار بالخلايا. الحل المقترح هو خفض التركيز وزيادة وقت التلوين63 ؛ ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى تلطيخ أكثر فقرا دون زيادة صلاحية الخلية.
على غرار PKMO ، تظهر الصبغة التجارية Live Orange mito (جدول المواد) أيضا بعض سمية الخلايا. تم استخدام هذه الصبغة لمجموعة متنوعة من الخلايا المستزرعة ولكنها لم تكن قادرة على إظهار تلطيخ مماثل في خلايا SH-SY5Y المتمايزة RA-MEN بنجاح مع نفس المعلمات مثل نظيراتها غير المتمايزة (ملاحظاتنا غير المنشورة). ومع ذلك ، يمكن تحسين بروتوكولات التلوين القابلة لهذا المسبار وأنواع الخلايا المختارة. مع هذه الصبغة ، تم استخدام أوقات بوابات الكاشف من 1-1.05 إلى 7-7.05 نانوثانية ، مع بقاء جميع المعلمات الأخرى في الجدول 1 كما هي. بشكل عام ، أسفرت خلايا التلوين التي تحتوي على 200-250 نانومتر ميتو برتقالي مباشر لمدة 45 دقيقة عن نتائج مماثلة كما أظهرت نتائج PKMO. يمكن أن يؤدي التلوين عالي التركيز لوقت أقل أو تلطيخ تركيز أقل لنفس الفترة الزمنية أو لفترة أطول قليلا إلى نتائج مختلفة وقد يكون مواتيا لأنواع الخلايا الأخرى أو ظروف النمو.
يختلف تصوير الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران عن الخلايا الخالدة بسبب طبيعة إسقاطات المحور العصبي والتغصنات بالإضافة إلى توزيع الميتوكوندريا في وقت التصوير. تتمثل إحدى الصعوبات في هذا الجزء من البروتوكول في أن كثافة البذر تحدد ما إذا كانت الثقافات الأولية ستكون قادرة على الالتصاق والنمو بشكل صحي ، وعند الكثافات الأعلى ، تميل التوقعات إلى النمو الزائد بمقدار DIV 10. لذلك ، من المحتمل أن تأتي الميتوكوندريا المصورة من هذه الخلايا العصبية الأولية من جسم الخلية وليس من الإسقاطات. ومع ذلك ، فإن النمو الناجح من انخفاض كثافة الخلايا الأولية يعطي نتائج تصوير أفضل في أوقات النمو اللاحقة. المفتاح هو ضمان خلفية منخفضة وضوء خارج التركيز للحصول على أفضل تباين ل STED. لمعالجة المخاوف المتعلقة بعدد الخلايا ، فإن زراعة خلايا الحصين الأولية في وسائط نمو الخلايا العصبية المكملة ب B27 يمنع نمو الخلايا الدبقية ، ويفيد المصدر أن <5٪ من الخلايا هي خلايا نجمية وأن غياب مكمل NbActiv1 في وسائط النمو يقلل من عدد الخلايا النجمية في الثقافات إلى <2٪ 87. بالنسبة لكل من خلايا SH-SY5Y المستزرعة والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران ، يساهم طلاء PDL المستخدم للنمو في ضباب الخلفية في الصور. يتم إنجاز إشارة كافية إلى الضوضاء مع الإعدادات المذكورة في (الجدول 1) وإزالة الالتفاف معظم الخلفية التي تمت ملاحظتها.
بالإضافة إلى التصوير المغطى هنا ، من الممكن أيضا إضافة علاجات أو إجهاد للخلايا قبل أو أثناء التصوير. على سبيل المثال ، تؤدي إضافة بيروكسيد الهيدروجين ثلاثي بوتيل (tBHP) إلى الإجهاد التأكسدي ، ومن الممكن مراقبة التغيرات في الميتوكوندريا بمرور الوقت بعد الإضافة. تسمح إضافة β الأميلويد (Aβ) بعلامة الفلورسنت بمراقبة توزيع هذا الببتيد فيما يتعلق بالميتوكوندريا وكذلك بنية الميتوكوندريا بمرور الوقت. كانت صحة الميتوكوندريا متورطة بشكل كبير في مرض الزهايمر وهي مدعومة على نطاق واسع للعب دور في سمية Aβ43،71،72. والجدير بالذكر أن حالة التمايز لخلايا SH-SY5Y تؤثر على توطين سلائف البروتين Aβ (AβPP)85 ، ويجب بناء التجارب باستخدام AβPP بعناية.
كمثال على كيفية تكييف هذا البروتوكول ، يظهر أنه يمكن إضافة المتغير الفلوري Aβ (1-42) -HiLyte 647 إلى الخلايا الملطخة ب PKMO قبل 15 دقيقة من التصوير (الشكل التكميلي 1). تتشابه معلمات التصوير (الجدول التكميلي 2) ، والفرق الرئيسي هو أن هناك حاجة إلى ثقب أصغر عند تصوير الميتوكوندريا الأضيق. يتطلب تصوير Aβ-HiLyte647 باستخدام STED إثارة إجمالية أقل (6٪ -8٪) واستنفاد STED (10٪ -12٪) طاقة ليزر وتراكمات أقل (ستة). يتم تمديد بوابة الكاشف أيضا من 0.1 إلى 10 نانوثانية. على الرغم من أن دقة STED ل Aβ ليست ضرورية ، إلا أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء الإجمالية وحجم جسيمات Aβ ل STED الخام كانت أفضل من تلك الموجودة في الصور متحدة البؤر ، ويمكن أيضا إجراء إزالة الالتفاف اللاحقة. يبدو أن جمع صور الأمراض المنقولة جنسيا وإسقاطات z-stack الأولية STED ل Aβ مفيدة بشكل خاص عند الاندماج مع صور STED الخام أو صور STED غير الملتوية لصبغة PKMO (الشكل التكميلي 1B ، C). تم جمع كلتا القناتين في خطوة إطار واحدة. يمكن الحصول على قياسات التوطين المعتمد على الوقت ، على غرار تلك المدرجة في الشكل 2 والموضحة في الشكل 5 ، عند الاقتضاء ، واختلافات بنية cristae بعد معالجة الإجهاد أو الإضافات الأخرى.
تشمل الطرق الأخرى الممكنة لوضع العلامات المزدوجة في الخلية الحية STED للميتوكوندريا التي لم يتم الإبلاغ عنها هنا ولكن تم الإبلاغ عنها من قبل الآخرين استخدام البروتينات الموسومةب SNAP 93 ، والبروتينات الموسومة بالهالة ، واستخدام أصباغ أخرى منفذة للخلايا ذات أهداف عامة ، مثل mtDNA63. والجدير بالذكر أن استراتيجية وضع العلامات الخاصة بوضع علامات SNAP و Halo تؤثر على شدة إشارة التألق الناتجة وطول العمر عند التصوير94. بالإضافة إلى ذلك ، بينما يقدم هذا البروتوكول العديد من الأمثلة على التحليلات التي يمكن تطبيقها على الميتوكوندريا المجزأة ، هناك العديد من التحليلات الأخرى التي يمكن أن تجريها حزم البرامج على هذه الصور.

الميتوكوندريا هي عضيات حقيقية النواة من أصل تكافلي داخلي مسؤولة عن تنظيم العديد من العمليات الخلوية الرئيسية ، بما في ذلك التمثيل الغذائي الوسيط وإنتاج ATP ، والتوازن الأيوني ، والتخليق الحيوي للدهون ، وموت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). هذه العضيات معقدة طوبولوجيا ، وتحتوي على نظام غشاء مزدوج ينشئ مقصورات فرعية متعددة1 (الشكل 1 أ). يتفاعل غشاء الميتوكوندريا الخارجي (OMM) مع السيتوسول ويؤسس اتصالات مباشرة بين العضيات 2,3. غشاء الميتوكوندريا الداخلي (IMM) هو غشاء يحافظ على الطاقة يحافظ على التدرجات الأيونية المخزنة بشكل أساسي كجهد غشاء كهربائي (ΔΨm) لدفع تخليق ATP والعمليات الأخرى التي تتطلب الطاقة 4,5. ينقسم IMM أيضا إلى غشاء الحدود الداخلية (IBM) ، والذي يتم ضغطه بشكل وثيق على OMM ، والهياكل البارزة التي تسمى cristae المرتبطة بغشاء cristae (CM). يحدد هذا الغشاء حجرة المصفوفة الأعمق من الفضاء داخل الغشاء (ICS) والفضاء بين الأغشية (IMS).
تحتوي الميتوكوندريا على مورفولوجيا ديناميكية تعتمد على عمليات مستمرة ومتوازنة من الانشطار والاندماج التي تحكمها الإنزيمات الميكانيكية لعائلة الدينامينالفائقة 6. يسمح الاندماج بزيادة الاتصال وتشكيل الشبكات الشبكية ، في حين أن الانشطار يؤدي إلى تجزئة الميتوكوندريا ويمكن من إزالة الميتوكوندريا التالفة بواسطة الميتوفاجي7. يختلف مورفولوجيا الميتوكوندريا حسب نوع الأنسجة8 والمرحلةالتنموية 9 ويتم تنظيمها للسماح للخلايا بالتكيف مع العوامل بما في ذلك الاحتياجات النشطة 10,11 والضغوطات 12. يمكن قياس السمات المورفومترية القياسية للميتوكوندريا ، مثل مدى تكوين الشبكة (مترابطة مقابل مجزأة) ، والمحيط ، والمساحة ، والحجم ، والطول (نسبة العرض إلى الارتفاع) ، والاستدارة ، ودرجة التفرع ، وقياسها بواسطة المجهر الضوئي القياسي لأن أحجام هذه الميزات أكبر من حد حيود الضوء (~ 200 نانومتر) 13.
تحدد بنية Cristae البنية الداخلية للميتوكوندريا (الشكل 1 ب). يمكن تصنيف تنوع أشكال cristae على نطاق واسع على أنها مسطحة (رقائقي أو قرصي) أو أنبوبيحويصلي 14. يتم إرفاق جميع cristae في IBM من خلال هياكل أنبوبية أو تشبه الفتحة تسمى تقاطعات cristae (CJs) التي يمكن أن تعمل على تجزئة IMS من ICS و IBM من CM15. يتم تنظيم مورفولوجيا Cristae بواسطة مجمعات البروتين الرئيسية في IMM ، بما في ذلك (1) موقع اتصال الميتوكوندريا ونظام تنظيم cristae (MICOS) الموجود في CJs ويستقر اتصالات IMM-OMM16 ، (2) الضمور البصري 1 (OPA1) GTPase الذي ينظم إعادة تشكيل cristae17،18،19 ، و (3) F1FO ATP سينسيز الذي يشكل تجميعات قليلة القسيمات المثبتة عند أطراف cristae (CTs)20 ، 21. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إثراء IMM في الدهون الفوسفاتية غير ثنائية الطبقة فوسفاتيديل إيثانولامين وكارديوليبين التي تعمل على استقرار IMM22 المنحني للغاية. Cristae هي أيضا ديناميكية ، مما يدل على التغيرات المورفولوجية في ظل ظروف مختلفة ، مثل حالات التمثيل الغذائي المختلفة 23,24 ، مع ركائز تنفسية مختلفة 25 ، تحت الجوع والإجهاد التأكسدي 26,27 ، مع موت الخلايا المبرمج 28,29 ، ومع الشيخوخة 30. لقد ثبت مؤخرا أن cristae يمكن أن يخضع لأحداث إعادة عرض رئيسية على مقياس زمني من الثواني ، مما يؤكد طبيعتها الديناميكية31. يمكن قياس العديد من ميزات cristae ، بما في ذلك أبعاد الهياكل داخل cristae الفردية (على سبيل المثال ، عرض CJ وطول crista والعرض) والمعلمات التي تربط crista الفردية بالهياكل الأخرى (على سبيل المثال ، التباعد داخل cristae وزاوية حادث cristae بالنسبة إلى OMM)32. تظهر معلمات cristae القابلة للقياس الكمي ارتباطا مباشرا بالوظيفة. على سبيل المثال ، يرتبط مدى إنتاج ATP للميتوكوندريا بشكل إيجابي بوفرة cristae ، ويتم قياسه كميا ككثافة cristae أو رقم cristae طبيعي لميزة أخرى (على سبيل المثال ، cristae لكل منطقة OMM)33،34،35. نظرا لأن مورفولوجيا IMM يتم تعريفها من خلال ميزات المقياس النانوي ، فإنها تشتمل على بنية فائقة للميتوكوندريا ، والتي تتطلب تقنيات تصوير توفر دقة أكبر من حد حيود الضوء. كما هو موضح أدناه ، تشمل هذه التقنيات المجهر الإلكتروني والمجهر فائق الدقة (الفحص النانوي).
تعتمد الخلايا العصبية والدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) بشكل خاص على وظيفة الميتوكوندريا. في المتوسط ، يشكل الدماغ 2٪ فقط من إجمالي وزن الجسم ، ولكنه يستخدم 25٪ من إجمالي الجلوكوز في الجسم ويمثل 20٪ من استهلاك الأكسجين في الجسم ، مما يجعله عرضة لضعف استقلاب الطاقة36. تعد الأمراض التنكسية العصبية التقدمية (NDs) ، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ، والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، ومرض هنتنغتون (HD) ، والتصلب المتعدد (MS) ، ومرض باركنسون (PD) ، من أكثر الأمراض التي تمت دراستها على نطاق واسع حتى الآن ، مع جهود بحثية تتراوح من فهم الأسس الجزيئية لهذه الأمراض إلى البحث عن الوقاية والتدخلات العلاجية المحتملة. ترتبط NDs بزيادة الإجهاد التأكسدي الذي ينشأ جزئيا من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) الناتجة عن سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETC) 37 ، بالإضافة إلى معالجة الكالسيوم الميتوكوندرياالمتغيرة 38 واستقلاب الدهون في الميتوكوندريا39. هذه التغيرات الفسيولوجية مصحوبة بعيوب ملحوظة في مورفولوجيا الميتوكوندريا المرتبطة ب AD 40،41،42،43،44 ، ALS45،46 ، HD 47،48،49 ، MS50 ، و PD 51،52،53. يمكن أن تقترن هذه العيوب الهيكلية والوظيفية بعلاقات معقدة بين السبب والنتيجة. على سبيل المثال ، بالنظر إلى أن مورفولوجيا cristae تعمل على استقرار إنزيمات OXPHOS54 ، فإن أنواع الأكسجين التفاعلية للميتوكوندريا لا يتم إنشاؤها بواسطة ETC فحسب ، بل تعمل أيضا على إتلاف البنية التحتية التي توجد فيها مجموعة الاتصالات في حالات الطوارئ ، مما يعزز دورة التغذية إلى الأمام ROS التي تعزز التعرض للضرر التأكسدي. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن عدم تنظيم cristae يؤدي إلى عمليات مثل إطلاق الحمض النووي للميتوكوندريا (mtDNA) والمسارات الالتهابية المرتبطة باضطرابات المناعة الذاتية والتمثيل الغذائي والاضطرابات المرتبطة بالعمر55. لذلك ، فإن تحليل بنية الميتوكوندريا هو المفتاح لفهم كامل ل NDs وأسسها الجزيئية.
كشفت الطرق الشائعة لعرض cristae ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني النافذ ، والتصوير المقطعي الإلكتروني والتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (cryo-ET) ، والتصوير المقطعي بالأشعة السينية ، ولا سيما التصوير المقطعي بالأشعة السينية الناعمة بالتبريد ، عن نتائج مهمة وتعمل مع مجموعة متنوعة من أنواع العينات56،57،58،59،60. على الرغم من التطورات الحديثة نحو مراقبة أفضل للبنية الفائقة للعضيات ، لا تزال هذه الطرق تأتي مع تحذير من طلب تثبيت العينة ، وبالتالي ، لا يمكنها التقاط ديناميكيات cristae في الوقت الفعلي مباشرة. أصبح الفحص المجهري الفلوري فائق الدقة ، لا سيما في أشكال الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM) ، والمجهر التعريفي المنشط ضوئيا (PALM) ، والمجهر التوسعي (ExM) ، والمجهر المستنفد للانبعاث المحفز (STED) ، طرقا شائعة لعرض الهياكل التي تتطلب دقة أقل من حد الحيود الذي يقيد الطرق الكلاسيكية للفحص المجهري الضوئي. عند استخدام ExM جنبا إلى جنب مع تقنية أخرى فائقة الدقة ، تكون النتائج مثيرة للإعجاب ، ولكن يجب تثبيت العينة وتلطيخها في هلام61. بالمقارنة ، تم استخدام كل من SIM و PALM / STORM و STED بنجاح مع العينات الحية ، وتوفر الأصباغ الجديدة والواعدة التي تلطخ IMM بشكل عام نهجا جديدا وسهلا للتصوير المباشر لديناميكيات الميتوكوندريا كريستاي62،63،64،65،66. أدت التطورات الحديثة في الأصباغ الحية للتصوير STED إلى تحسين سطوع الصبغة وثبات الضوء ، وتستهدف هذه الأصباغ IMM بدرجة أعلى من الخصوصية من سابقاتها. تسمح هذه التطورات بجمع تجارب الفاصل الزمني طويل الأجل و z-stack مع التصوير فائق الدقة ، مما يفتح الباب أمام تحليل أفضل للخلايا الحية للبنية الفائقة للميتوكوندريا وديناميكياتها.
هنا ، يتم توفير بروتوكولات لتصوير الخلايا الحية لخلايا SH-SY5Y غير المتمايزة والمتمايزة الملطخة بصبغة PKmito Orange (PKMO) باستخدام STED63. خط خلية SH-SY5Y هو مشتق مستنسخ ثلاث مرات من خط الخلية الأبوية ، SK-N-SH ، تم إنشاؤه من خزعة نخاع العظم للورم الأرومي العصبي النقيلي67،68،69،70. هذا الخط الخلوي شائع الاستخدام في نموذج المختبر في أبحاث ND ، خاصة مع أمراض مثل AD و HD و PD ، حيث يكون خلل الميتوكوندريا متورطا بشكل كبير10،43،71،72،73. أثبتت القدرة على تمييز خلايا SH-SY5Y إلى خلايا ذات نمط ظاهري يشبه الخلايا العصبية من خلال التلاعب بوسائط الثقافة نموذجا مناسبا لأبحاث علم الأعصاب دون الاعتماد على الخلايا العصبية الأولية10,74. في هذا البروتوكول ، تمت إضافة حمض الريتينويك (RA) إلى وسط زراعة الخلايا للحث على تمايز خلايا SH-SY5Y. التهاب المفاصل الروماتويدي هو أحد مشتقات فيتامين أ وقد ثبت أنه ينظم دورة الخلية ويعزز التعبير عن عوامل النسخ التي تنظم التمايز العصبي75. كما يتم توفير بروتوكول لزراعة وتصوير الخلايا الحية للخلايا العصبية المعزولة من قرن آمون الفئران. لقد ثبت أن الحصين يتأثر بانحطاط الميتوكوندريا ، ويلعب ، جنبا إلى جنب مع القشرة ، دورا مهما في الشيخوخة و ND76،77،78،79،80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

تلعب الميتوكوندريا العديد من الأدوار الأساسية في الخلية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، وتنظيم توازن الكالسيوم2+ ، والتخليق الحيوي للدهون ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تأخذ هذه العمليات بوساطة الميتوكوندريا أدوارا متخصصة في الخلايا العصبية ، وتنسيق التمثيل الغذائي الهوائي لتلبية متطلبات الطاقة العالية لهذه الخلايا ، وتعديل إشارات Ca2+ ، وتوفير الدهون لنمو المحور العصبي وتجديده ، وضبط إنتاج ROS لتطوير الخلايا العصبية ووظيفتها. وبالتالي فإن ضعف الميتوكوندريا هو المحرك المركزي للأمراض التنكسية العصبية. يرتبط هيكل الميتوكوندريا ووظيفتها ارتباطا وثيقا. يحتوي الغشاء الداخلي المعقد شكليا مع الطيات الهيكلية المسماة cristae على العديد من الأنظمة الجزيئية التي تؤدي عمليات توقيع الميتوكوندريا. السمات المعمارية للغشاء الداخلي هي بنية فائقة ، وبالتالي ، أصغر من أن يتم تصورها بواسطة الفحص المجهري التقليدي المحدود الحيود. وبالتالي ، فإن معظم الأفكار حول البنية الفوقية للميتوكوندريا جاءت من المجهر الإلكتروني على عينات ثابتة. ومع ذلك ، فإن التقنيات الناشئة في الفحص المجهري الفلوري فائق الدقة توفر الآن دقة تصل إلى عشرات النانومتر ، مما يسمح بتصور ميزات البنية التحتية في الخلايا الحية. لذلك يوفر التصوير فائق الدقة قدرة غير مسبوقة على تصوير التفاصيل الدقيقة لبنية الميتوكوندريا وتوزيعات البروتين النانوية وديناميكيات cristae مباشرة ، مما يوفر رؤى أساسية جديدة تربط الميتوكوندريا بصحة الإنسان والمرض. يقدم هذا البروتوكول استخدام الفحص المجهري فائق الدقة لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) لتصور البنية التحتية للميتوكوندريا لخلايا الورم الأرومي العصبي البشري الحي والخلايا العصبية الأولية للفئران. تم تنظيم هذا الإجراء في خمسة أقسام: (1) نمو وتمايز خط خلية SH-SY5Y ، (2) عزل وطلاء ونمو الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران ، (3) إجراءات تلطيخ الخلايا للتصوير الحي للأمراض المنقولة جنسيا ، (4) إجراءات تجارب الخلايا الحية STED باستخدام مجهر STED كمرجع ، و (5) إرشادات للتجزئة ومعالجة الصور باستخدام أمثلة لقياس وقياس السمات المورفولوجية للغشاء الداخلي.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

يصف هذا البروتوكول ظروف نمو الخلايا للخلايا المستزرعة والأولية مع التركيز على تصوير الخلايا الحية STED والتحليلات اللاحقة لكريستال الميتوكوندريا. يمكن جمع الإسقاطات التي تم إجراؤها باستخدام ImageJ للميتوكوندريا من خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة (الشكل 3A) وخلايا SH-SY5Y المتمايزة RA (الشكل 3B) كمداخن z مع البؤر التقليدية والأمراض المنقولة جنسيا ، ويمكن بعد ذلك فك الصور الأولية للأمراض المنقولة جنسيا. يمكن أيضا إجراء التصوير الفاصل الزمني وفك الالتفاف لاحقا (الشكل 3C ، D). باستخدام معلمات تصوير مختلفة قليلا للخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران (الجدول 1) ، يمكن الحصول على صور متحدة البؤر وخام STED كمداخن z ، ويمكن فك الصور الأولية للأمراض المنقولة جنسيا (الشكل 4 أ). التصوير الفاصل الزمني للميتوكوندريا من الخلايا العصبية الأولية ممكن أيضا (الشكل 4B). بشكل عام ، يجب أن تكون صور الفاصل الزمني قادرة على إظهار الأحداث الديناميكية للميتوكوندريا.
عندما تظهر إسقاطات STED الخام و STED z-stack غير الملتوية من العينات المستخدمة للتجزئة متسقة ، يتم إجراء قياسات كمية. يستخدم المكون الإضافي TWS صورة STED غير المعقدة للتقسيم لإنشاء قناع احتمالية ، والذي يتم استخدامه بعد ذلك لإنشاء قناع ثنائي من cristae للحصول على معلمات الحجم والشكل (الشكل 5A). يتم حفظ المناطق من هذا القناع في مدير عائد الاستثمار ويمكن تطبيقها على صورة STED الأولية إذا رغبت في قياس الاختلافات في الكثافة النسبية. يمكن أيضا استخدام إسقاطات STED غير الملتوية لتحديد دورية cristae وكثافتها في منطقة معينة (الشكل 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> الشكل 1: مورفولوجيا الميتوكوندريا. تحتوي الميتوكوندريا على نظام ثنائي الغشاء يحدد الأجزاء الفرعية المختلفة (A). Cristae هي طيات الغشاء الداخلي مع ميزات محددة (B). الاختصارات: OMM ، غشاء الميتوكوندريا الخارجي. ICS ، الفضاء داخل النص ؛ IMS ، الفضاء بين الأغشية ؛ CM ، غشاء كريستا. IBM ، غشاء الحدود الداخلية ؛ IMM ، غشاء الميتوكوندريا الداخلي. CT ، طرف كريستاي ؛ CJ ، تقاطع كريستاي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> الشكل 2: رسم تخطيطي لسير العمل. تزرع خلايا SH-SY5Y أو الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران على غطاء زجاجي مطلي ب PDL. تزرع خلايا SH-SY5Y بالتوازي لتبقى غير متمايزة أو تخضع لتمايز التهاب المفاصل الروماتويدي على مدار ستة أيام. نمت الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران على غطاء زجاجي مطلي ب PDL بعد عزلها عن أقسام الحصين لمدة سبعة أيام. بمجرد أن تصبح جاهزة للتصوير ، تم تلطيخ الخلايا ب PKMO وتصويرها بالأمراض المنقولة جنسيا. ثم يتم فك التفاف الصور الأولية المنقولة جنسيا ، وتتم معالجة الصور غير الملتوية في فيجي للحصول على قياسات الحجم والشكل ، مثل كثافة cristae والمساحة والمحيط والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> الشكل 3: تصوير الميتوكوندريا في خلايا SH-SY5Y. يتم عرض إسقاطات z-stack لصورة z-stack غير المتمايزة (على اليسار) و STED الخام (في الوسط) و Huygens غير المتمايزة STED (يمين) للميتوكوندريا من خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة (A) و RA-DIFFERENTIATED (B) مع تلطيخ PKMO. يتم عرض فاصل زمني بفواصل زمنية مدتها 30 ثانية و 5 تكرارات لخلايا SH-SY5Y المتمايزة من قبل RA (C) مع توسيع المناطق المحددة (المربعات البيضاء) عند (D) باستخدام صور مقاسة لتلك المناطق دون استيفاء. قضبان المقياس: أ ، ب ، 250 نانومتر ؛ C ، D ، 1 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> الشكل 4: تصوير الميتوكوندريا في الخلايا العصبية الحصينية الأولية للفئران. يتم عرض إسقاطات z-stack التمثيلية البؤرية (يسار) ، و STED الخام (في الوسط) ، و Huygens غير الملتوية STED (يمين) للميتوكوندريا من الخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران (A). يظهر فاصل زمني بفواصل زمنية مقدارها 25 s و5 تكرارات للميتوكوندريا في هذه الخلايا العصبية (ب). قضبان المقياس: A ، 250 نانومتر ؛ ب ، 1 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> الشكل 5: معالجة صور STED غير الملتوية في ImageJ. يظهر الاستخدام التمثيلي للمكون الإضافي Trainable Weka Segmentation لقياس حجم وشكل cristae (A). من اليسار إلى اليمين ، يتم عرض الصور التالية: صورة STED غير الملتوية ، وخريطة الاحتمالات بناء على التجزئة من المكون الإضافي TWS ، والقناع من العتبة في FIJI باستخدام خريطة الاحتمالات كإدخال ، والقناع مع عائد الاستثمار المحدد ، وعائد الاستثمار المتراكب على صورة STED الأصلية غير الملتوية. ويمكن الاطلاع في الجدول التكميلي 1 على قياسات المساحة والمحيط والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع الناتجة المقابلة لهذه الأجسام. يتم عرض مخطط خطي باستخدام صورة STED غير الملتوية لقياس المسافات من الذروة إلى الذروة كقراءة لكثافة cristae (B). قضبان المقياس: 0.5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>حجم بكسل (نانومتر)</td>
			<td>وقت المكوث (μs)</td>
			<td>خط acc.</td>
			<td>إثارة 561 نانومتر أثناء الاستحواذ على STED (٪)</td>
			<td>775 نانومتر قوة استنفاد STED (٪)</td>
			<td>حجم الخطوة (نانومتر)</td>
			<td>الثقب (أستراليا)</td>
			<td>الفاصل الزمني (الفترات الزمنية)</td>
			<td>التكرارات المتتابعة</td>
		</tr><tr><td>غير مختلف إغراء SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-ديفير-نتيتيد SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>الخلايا العصبية الأولية</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">ملاحظة: يمكن أن يختلف حجم البكسل بناء على متطلبات التصوير والغرض من إلغاء التفاف الصور. مطلوب أخذ العينات المناسبة لإزالة الالتفاف. يمكن أن تصل أحجام البكسل لصور STED الخام بدون فك الالتفاف إلى 30 نانومتر.</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: موجز بارامترات اقتناء الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي. يتم عرض الإعدادات المستخدمة لتصوير 2D STED لكل نوع من أنواع الخلايا ، SH-SY5Y غير المتمايزة ، SH-SY5Y المتمايزة RA ، والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران. لجميع الفترات المتتابعة ، تم أخذ 5 تكرارات بفواصل زمنية مختلفة بناء على حجم عائد الاستثمار.
الشكل التكميلي 1: تصوير خلايا SH-SY5Y بإضافة β الأميلويد (Aβ). يتم عرض صور تمثيلية متحدة البؤر (يسار) و STED خام (وسط) و STED غير ملتف (يمين) لخلايا SH-SY5Y المتمايزة مع صبغة PKMO (أعلى) و Aβ-HiLyte647 (أسفل) (A). يتم عرض إسقاطات z-stack المدمجة ل PKMO STED الخام (الأخضر) مع Aβ STED الخام (أرجواني) (B) أو PKMO STED غير الملتوي (الأخضر) مع Aβ STED غير الملتوي (أرجواني) (C). قضبان المقياس: 0.5 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الجدول التكميلي 1: قياسات الحجم والشكل للكريستا المجزأة. يتم عرض قياسات الحجم والشكل للمساحة (μm2) والمحيط (μm) والدائرية ونسبة العرض إلى الارتفاع ، المقابلة للكائنات الموضحة في الشكل 5A من الميتوكوندريا المجزأة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الجدول التكميلي 2: ملخص بارامترات الاكتساب مع عينات β الأميلويد. يتم عرض الإعدادات المستخدمة لتصوير 2D STED ل PKMO و Aβ-HiLyte647 في خلايا SH-SY5Y غير المتمايزة والمتمايزة RA. يمكن استخدام بؤر Aβ-HiLyte647 بمفرده حيث لا يوجد هيكل محدد لحله ؛ يتم عرض صور STED ل Aβ-HiLyte647 هنا لأحجام الجسيمات الأصغر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الملف التكميلي 1: بروتوكول علاج الأميلويد β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

يقدم هذا البروتوكول سير عمل لنشر وتمايز وتلطيخ خلايا SH-SY5Y المستزرعة والخلايا العصبية الحصين الأولية للفئران لتصور وتحليل البنية الفوقية للميتوكوندريا باستخدام الفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED).

استخدام تصوير الخلايا الحية المنقولة جنسيا لتصور البنية التحتية للغشاء الداخلي للميتوكوندريا في نماذج الخلايا العصبية

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

يركز برنامجنا البحثي على الجوانب الهيكلية والوظيفية للميتوكوندريا ، لا سيما فيما يتعلق بالخلل الوظيفي المرتبط بالشيخوخة. تحقيقا لهذه الغاية ، نستخدم مجموعة واسعة من التقنيات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والهيكلية لاستكشاف الآليات الأساسية لشيخوخة الميتوكوندريا وتطوير التدخلات العلاجية للحفاظ على صحة الميتوكوندريا واستعادتها. ترتبط وظيفة الميتوكوندريا وهيكلها ارتباطا وثيقا.تقنيات الفحص المجهري الضوئي القياسية مناسبة لقياس ميزات الميتوكوندريا على نطاق واسع مثل التشكل الأساسي وهياكل الشبكة. عادة ما يتم تحليل بنية الميتوكوندريا الفائقة أو الميزات التي تتطلب دقة أعلى مما يوفره الفحص المجهري الضوئي التقليدي باستخدام المجهر الإلكتروني أو التصوير المقطعي على عينات ثابتة. الفحص المجهري فائق الدقة هو تقنية تصوير قائمة على التألق تقيس الميزات التي تتجاوز حد الحيود.بالنسبة للميتوكوندريا ، يتضمن ذلك قياسات توزيع البروتين على نطاق النانو وبنية cristae. يسمح بروتوكول التصوير المفصل هنا للباحثين بقياس البنية التفصيلية للغشاء الداخلي في الخلايا الحية. يسمح لنا التصوير الخلوي الحي بمراقبة وتحليل السمات المعقدة للكريستا كميا في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية دون الحاجة إلى تثبيت العينة.سيعطي هذا الباحثين رؤى جديدة حول التغيرات الديناميكية التي تحدث في السمات الهيكلية الفائقة واستجاباتها الزمنية للضغوط والمركبات الدوائية.