Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Primære hippocampale neuroner hos rotter blev leveret af Dr. George Lykotrafitis og Shiju Gu fra Biomedical Engineering Department ved University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet, der ligger i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment, blev erhvervet med NIH-bevilling S10OD023618 tildelt Christopher O'Connell. Denne forskning blev finansieret af NIH-bevilling R01AG065879 tildelt Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne protokol præsenterer brugen af human neuroblastomcellelinje SH-SY5Y og primære hippocampale neuroner hos rotter med det nye IMM-målrettede PKMO-farvestof til levende celle STED-billeddannelse. På grund af nyheden i PKMO er der i øjeblikket lidt offentliggjort ved hjælp af dette farvestof til levende STED-billeddannelse. Brug af disse celletyper til STED-billeddannelse udgør udfordringer, specifikt fordi neuronale celler har smallere mitokondrier. En begrænsning af denne protokol er det anvendte PKMO-farvestof, da det kan være giftigt for celler. Forskellige celler og cellelinjer reagerer forskelligt på farvestoffet, således kan justeringer af farvestofkoncentration og inkubationstid for at optimere resultaterne for stærkt signal uden at skade celler være påkrævet. En foreslået løsning er at sænke koncentrationen og øge farvningstiden63; Dette kan dog resultere i dårligere farvning uden at øge cellelevedygtigheden.
På samme måde som PKMO udviser det kommercielle farvestof Live Orange mito (Table of Materials) også en vis celletoksicitet. Dette farvestof blev brugt til en række dyrkede celler, men var ikke i stand til at udvise sammenlignelig farvning i RA-differentierede SH-SY5Y-celler med succes med de samme parametre som deres udifferentierede modstykker (vores upublicerede observationer). Imidlertid kan modtagelige farvningsprotokoller optimeres til denne sonde og valgte celletyper. Med dette farvestof blev detektorgatingtider på 1-1,05 til 7-7,05 ns anvendt, mens alle andre parametre i tabel 1 forblev de samme. Generelt gav farvning af celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 minutter sammenlignelige resultater som PKMO-resultaterne viste. Farvning med højere koncentration i kortere tid eller farvning med lavere koncentration i samme tid eller lidt længere kan give forskellige resultater og kan være gunstig for andre celletyper eller vækstbetingelser.
Billeddannelse af primære rottehippocampale neuroner adskiller sig fra udødeliggjorte celler på grund af arten af axon- og dendritfremspringene samt mitokondriefordeling på billeddannelsestidspunktet. En vanskelighed i denne del af protokollen er, at såtætheden bestemmer, om de primære kulturer vil være i stand til at klæbe og vokse sundt, og ved højere tætheder har fremskrivningerne tendens til at vokse over DIV 10. Derfor vil mitokondrierne, der er afbildet fra disse primære neuroner, sandsynligvis komme fra cellekroppen og ikke fremskrivningerne; Imidlertid giver vellykket vækst fra en lavere startcelletæthed bedre billeddannelsesresultater ved senere væksttider. Nøglen er at sikre lav baggrund og ude af fokus lys for at få den bedste kontrast til STED. For at imødegå bekymringer vedrørende cellepopulationen forhindrer dyrkning af primære hippocampale celler i B27-suppleret neuronvækstmedier væksten af gliaceller, og kilden rapporterer, at <5% af cellerne er astrocytter, og fraværet af NbActiv1-supplement i vækstmedierne reducerer antallet af astrocytter i kulturer til <2%87. For både dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampale neuroner hos rotter bidrager PDL-belægningen, der anvendes til vækst, til baggrundståge i billeder. Der opnås tilstrækkelig signal-støj-støj med de indstillinger, der er rapporteret i (tabel 1), og dekonvolution fjerner det meste af den observerede baggrund.
Ud over den billeddannelse, der er dækket her, er det også muligt at tilføje behandlinger eller stress til celler før eller under billeddannelse. For eksempel inducerer tilsætning af tert-butylhydrogenperoxid (tBHP) oxidativ stress, og det er muligt at overvåge ændringer i mitokondrier over tid efter tilsætning. Tilsætningen af amyloid-β (Aβ) med et fluorescerende mærke muliggør overvågning af fordelingen af dette peptid i forhold til mitokondrier såvel som mitokondriestrukturen over tid. Mitokondriel sundhed har været stærkt impliceret i AD og er bredt støttet til at spille en rolle i Aβ toksicitet 43,71,72. Især påvirker differentieringsstatus for SH-SY5Y-celler Aβ-proteinforløber (AβPP) lokalisering85, og eksperimenter med AβPP bør konstrueres omhyggeligt.
Som et eksempel på, hvordan denne protokol kan tilpasses, er det vist, at den fluorescerende variant Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan tilsættes PKMO-farvede celler 15 min før billeddannelse (supplerende figur 1). Billeddannelsesparametrene er ens (supplerende tabel 2), hvor den væsentligste forskel er, at der er behov for et mindre pinhole ved billeddannelse af smallere mitokondrier. Billeddannelse af Aβ-HiLyte647 med STED kræver mindre samlet excitation (6% -8%) og STED-udtømning (10% -12%) lasereffekt og færre akkumuleringer (seks). Detektor gating forlænges også fra 0,1 til 10 ns. Selvom STED-opløsning af Aβ ikke er nødvendig, var det samlede signal-støj-forhold og Aβ-partikelstørrelsen af rå STED bedre end de konfokale billeder, og efterfølgende dekonvolution kan også udføres. Indsamling af STED-billeder og deconvolving af rå STED z-stack-projektioner af Aβ synes især nyttigt, når man fusionerer med rå STED- eller deconvolved STED-billeder af PKMO-pletten (supplerende figur 1B, C). Begge kanaler blev samlet i et enkelt rammetrin. Målinger af tidsafhængig lokalisering, svarende til dem, der er anført i figur 2 og vist i figur 5, hvor det er relevant, og cristae-arkitekturforskelle kan opnås efter stressbehandling eller andre tilføjelser.
Andre mulige metoder til dobbeltmærkning i levende celle STED af mitokondrier, der ikke er rapporteret her, men er blevet rapporteret af andre, omfatter brugen af SNAP-mærkede proteiner93, Halo-mærkede proteiner og brugen af andre cellegennemtrængelige farvestoffer med generiske mål, såsom mtDNA63. Især påvirker mærkningsstrategien for SNAP- og Halo-mærkning den resulterende fluorescenssignalintensitet og levetid ved billeddannelse94. Derudover, mens denne protokol præsenterer flere eksempler på analyser, der kan anvendes på segmenterede mitokondrier, er der mange andre analyser, som softwarepakker kan udføre på disse billeder.

Mitokondrier er eukaryote organeller af endosymbiotisk oprindelse, der er ansvarlige for at regulere flere vigtige cellulære processer, herunder mellemliggende metabolisme og ATP-produktion, ionhomeostase, lipidbiosyntese og programmeret celledød (apoptose). Disse organeller er topologisk komplekse og indeholder et dobbeltmembransystem, der etablerer flere underrum1 (figur 1A). Den ydre mitokondriemembran (OMM) grænseflader med cytosolen og etablerer direkte interorganelkontakter 2,3. Den indre mitokondriemembran (IMM) er en energibesparende membran, der opretholder iongradienter, der primært er lagret som et elektrisk membranpotentiale (ΔΨm) til at drive ATP-syntese og andre energikrævende processer 4,5. IMM er yderligere opdelt i den indre grænsemembran (IBM), som er tæt presset til OMM, og fremspringende strukturer kaldet cristae, der er bundet af cristaemembranen (CM). Denne membran afgrænser det inderste matrixrum fra det intracritale rum (ICS) og intermembranrummet (IMS).
Mitokondrier har en dynamisk morfologi baseret på kontinuerlige og afbalancerede processer af fission og fusion, der styres af mekanoenzymer af dynamin superfamilien6. Fusion giver mulighed for øget konnektivitet og dannelse af retikulære netværk, mens fission fører til mitokondriel fragmentering og gør det muligt at fjerne beskadigede mitokondrier ved mitofagi7. Mitokondriel morfologi varierer efter vævstype8 og udviklingstrin9 og reguleres for at give cellerne mulighed for at tilpasse sig faktorer, herunder energibehov 10,11 og stressorer12. Standard morfometriske egenskaber ved mitokondrier, såsom omfanget af netværksdannelse (sammenkoblet vs. fragmenteret), omkreds, areal, volumen, længde (billedformat), rundhed og grad af forgrening, kan måles og kvantificeres ved standard optisk mikroskopi, fordi størrelserne af disse funktioner er større end diffraktionsgrænsen for lys (~ 200 nm)13.
Cristae-arkitekturen definerer mitokondriernes indre struktur (figur 1B). Mangfoldigheden af cristae-morfologier kan bredt kategoriseres som flad (lamellær eller discoidal) eller rørformet-vesikulær14. Alle cristae fastgøres på IBM gennem rørformede eller slotlignende strukturer kaldet cristae junctions (CJ'er), der kan tjene til at opdele IMS fra ICS og IBM fra CM15. Cristae-morfologi reguleres af IMM's nøgleproteinkomplekser, herunder (1) mitokondriekontaktstedet og cristae-organisationssystemet (MICOS), der ligger ved CJ'er og stabiliserer IMM-OMM-kontakter 16, (2) den optiske atrofi 1 (OPA1) GTPase, der regulerer cristae-remodellering17,18,19 og (3) F1FO ATP-syntase, der danner stabiliserende oligomere samlinger ved cristae-spidser (CT'er)20, 21. Derudover er IMM beriget med ikke-dobbeltlags fosfolipider phosphatidylethanolamin og cardiolipin, der stabiliserer den stærkt buede IMM22. Cristae er også dynamiske og demonstrerer morfologiske ændringer under forskellige forhold, såsom forskellige metaboliske tilstande 23,24, med forskellige åndedrætssubstrater 25, under sult og oxidativ stress 26,27, med apoptose 28,29 og med aldring 30. For nylig har det vist sig, at cristae kunne gennemgå større ombygningsbegivenheder på en tidsskala på sekunder, hvilket understreger deres dynamiske natur31. Flere træk ved cristae kan kvantificeres, herunder dimensioner af strukturer inden for individuelle cristae (f.eks. CJ-bredde, crista-længde og bredde) og parametre, der relaterer individuel crista til andre strukturer (f.eks. intra-cristae-afstand og cristae-hændelsesvinkel i forhold til OMM)32. Disse kvantificerbare cristae-parametre viser en direkte sammenhæng med funktion. For eksempel er omfanget af mitokondriel ATP-produktion positivt relateret til mængden af cristae, kvantificeret som cristae-densitet eller cristae-tal normaliseret til en anden funktion (f.eks. Cristae pr. OMM-areal)33,34,35. Fordi IMM-morfologi er defineret af nanoskalafunktioner, omfatter den mitokondriel ultrastruktur, som kræver billeddannelsesteknikker, der giver opløsning, der er større end lysdiffraktionsgrænsen. Som beskrevet nedenfor omfatter sådanne teknikker elektronmikroskopi og superopløsningsmikroskopi (nanoskopi).
De neurale og gliale celler i centralnervesystemet (CNS) er særligt afhængige af mitokondriefunktionen. I gennemsnit udgør hjernen kun 2% af den samlede kropsvægt, men bruger 25% af den samlede kropsglukose og tegner sig for 20% af kroppens iltforbrug, hvilket gør den sårbar over for forringelser i energimetabolisme36. Progressive neurodegenerative sygdomme (ND'er), herunder Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Huntingtons sygdom (HD), multipel sklerose (MS) og Parkinsons sygdom (PD), er nogle af de mest omfattende undersøgte patologier til dato, med forskningsindsats, der spænder fra at forstå de molekylære grundlag for disse sygdomme til at søge potentiel terapeutisk forebyggelse og interventioner. ND'er er forbundet med øget oxidativt stress, der delvis stammer fra reaktive iltarter (ROS) genereret af mitokondrieelektrontransportkæden (ETC)37, samt ændret mitokondriel calciumhåndtering38 og mitokondriel lipidmetabolisme39. Disse fysiologiske ændringer ledsages af bemærkede defekter i mitokondriel morfologi, der er forbundet med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 og PD 51,52,53. Disse strukturelle og funktionelle defekter kan kobles af komplekse årsagssammenhænge. For eksempel, da cristae-morfologi stabiliserer OXPHOS-enzymer54, genereres mitokondriel ROS ikke kun af ETC, men de virker også til at skade infrastrukturen, hvor ETC befinder sig, og fremmer en feed-forward ROS-cyklus, der forbedrer modtageligheden for oxidativ skade. Desuden har cristae disorganisering vist sig at udløse processer såsom mitokondrie-DNA (mtDNA) frigivelse og inflammatoriske veje forbundet med autoimmune, metaboliske og aldersrelaterede lidelser55. Derfor er analyse af mitokondriestruktur nøglen til en fuld forståelse af ND'er og deres molekylære underlag.
Populære metoder til visning af cristae, herunder transmissionselektronmikroskopi, elektrontomografi og kryo-elektrontomografi (kryo-ET) og røntgentomografi, især kryoblød røntgentomografi, har afsløret vigtige fund og arbejde med en række prøvetyper 56,57,58,59,60. På trods af de seneste fremskridt mod bedre observation af organellær ultrastruktur kommer disse metoder stadig med det forbehold, at de kræver prøvefiksering og kan derfor ikke fange realtidsdynamikken i cristae direkte. Superopløsningsfluorescensmikroskopi, især i form af struktureret belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM), ekspansionsmikroskopi (ExM) og stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi, er blevet populære måder at se strukturer, der kræver opløsning under diffraktionsgrænsen, der begrænser klassiske metoder til optisk mikroskopi. Når ExM bruges sammen med en anden superopløsningsteknik, er resultaterne imponerende, men prøven skal fastgøres og farves i en gel61. Til sammenligning er SIM, PALM / STORM og STED alle blevet brugt med succes med levende prøver, og nye og lovende farvestoffer, der generelt pletter IMM, giver en ny og nem tilgang til live billeddannelse af mitokondrier cristae dynamics 62,63,64,65,66. Nylige fremskridt inden for levende farvestoffer til STED-billeddannelse har forbedret farvestoffets lysstyrke og fotostabilitet, og disse farvestoffer målretter IMM mod en højere grad af specificitet end deres forgængere. Disse udviklinger tillader indsamling af langsigtede timelapse- og z-stack-eksperimenter med superopløsningsbilleddannelse, hvilket åbner døren for bedre levende celleanalyse af mitokondriel ultrastruktur og dynamik.
Heri leveres protokoller til levende cellebilleddannelse af udifferentierede og differentierede SH-SY5Y-celler farvet med PKmito Orange (PKMO) farvestof ved anvendelse af STED63. SH-SY5Y-cellelinjen er et tre gange subklonet derivat fra forældrecellelinjen, SK-N-SH, genereret fra en knoglemarvsbiopsi af metastatisk neuroblastom67,68,69,70. Denne cellelinje er en almindeligt anvendt in vitro-model i ND-forskning, især med sygdomme som AD, HD og PD, hvor mitokondriel dysfunktion er stærkt impliceret 10,43,71,72,73. Evnen til at differentiere SH-SY5Y-celler til celler med en neuronlignende fænotype gennem manipulering af kulturmedier har vist sig at være en passende model til neurovidenskabelig forskning uden at stole på primære neuronale celler10,74. I denne protokol blev retinsyre (RA) tilsat til cellekulturmediet for at inducere differentieringen af SH-SY5Y-celler. RA er et vitamin A-derivat og har vist sig at regulere cellecyklussen og fremme ekspressionen af transkriptionsfaktorer, der regulerer neuronal differentiering75. En protokol til dyrkning og levende cellebilleddannelse af neuroner isoleret fra rottehippocampus er også tilvejebragt. Hippocampus har vist sig at være påvirket af mitokondriel degeneration og spiller sammen med cortex en vigtig rolle i aldring og ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Mitokondrier spiller mange vigtige roller i cellen, herunder energiproduktion, regulering af Ca2+ homeostase, lipidbiosyntese og produktion af reaktive iltarter (ROS). Disse mitokondrie-medierede processer påtager sig specialiserede roller i neuroner, koordinerer aerob metabolisme for at imødekomme disse cellers høje energibehov, modulerer Ca2+ signalering, tilvejebringer lipider til axonvækst og regenerering og indstiller ROS-produktion til neuronal udvikling og funktion. Mitokondriel dysfunktion er derfor en central drivkraft i neurodegenerative sygdomme. Mitokondriel struktur og funktion er uløseligt forbundet. Den morfologisk komplekse indre membran med strukturelle indfoldninger kaldet cristae har mange molekylære systemer, der udfører mitokondriernes signaturprocesser. De arkitektoniske træk ved den indre membran er ultrastrukturelle og derfor for små til at blive visualiseret ved traditionel diffraktionsbegrænset opløst mikroskopi. Således er de fleste indsigter i mitokondriel ultrastruktur kommet fra elektronmikroskopi på faste prøver. Imidlertid giver nye teknologier inden for superopløsningsfluorescensmikroskopi nu opløsning ned til snesevis af nanometer, hvilket muliggør visualisering af ultrastrukturelle træk i levende celler. Superopløsningsbilleddannelse giver derfor en hidtil uset evne til direkte at afbilde fine detaljer om mitokondriestruktur, proteinfordelinger i nanoskala og cristae-dynamik, hvilket giver grundlæggende ny indsigt, der forbinder mitokondrier med menneskers sundhed og sygdom. Denne protokol præsenterer brugen af stimuleret emissionsudtømning (STED) superopløsningsmikroskopi til at visualisere mitokondriel ultrastruktur af levende humane neuroblastomceller og primære rotteneuroner. Denne procedure er organiseret i fem sektioner: (1) vækst og differentiering af SH-SY5Y-cellelinjen, (2) isolering, plettering og vækst af primære rottehippocampale neuroner, (3) procedurer til farvning af celler til levende STED-billeddannelse, (4) procedurer for levende celle STED-eksperimenter ved hjælp af et STED-mikroskop til reference og (5) vejledning til segmentering og billedbehandling ved hjælp af eksempler til måling og kvantificering af morfologiske egenskaber ved den indre membran.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Denne protokol beskriver cellevækstbetingelser for dyrkede og primære celler med fokus på levende celle STED-billeddannelse og efterfølgende analyser af mitokondriecristae. Fremskrivninger lavet med ImageJ af mitokondrier fra udifferentierede SH-SY5Y (figur 3A) og RA-differentierede SH-SY5Y (figur 3B) celler kan indsamles som z-stakke med traditionelle konfokale og STED, og de rå STED-billeder kan derefter deconvolvedes. Timelapse-billeddannelse kan også udføres og efterfølgende deconvolved (figur 3C, D). Ved hjælp af lidt forskellige billeddannelsesparametre for primære hippocampale neuroner hos rotter (tabel 1) kan konfokale og rå STED-billeder erhverves som z-stakke, og de rå STED-billeder kan deconvolved (figur 4A). Timelapse-billeddannelse af mitokondrier fra primære neuroner er også mulig (figur 4B). Generelt skal time-lapse-billederne kunne vise mitokondriedynamiske hændelser.
Når rå STED og deconvolved STED z-stack fremskrivninger fra de prøver, der anvendes til segmentering, synes konsistente, udføres kvantitative målinger. TWS-pluginet bruger det dekonvolverede STED-billede til at segmentere for at lave en sandsynlighedsmaske, som derefter bruges til at oprette en binær maske af cristae for at opnå størrelses- og formparametre (figur 5A). Regionerne fra denne maske gemmes i ROI-styringen og kan anvendes på det rå STED-billede, hvis det ønskes for at måle forskelle i relativ intensitet. De deconvolved STED-fremskrivninger kan også bruges til at bestemme cristae-periodiciteten og densiteten i et givet område (figur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figur 1: Mitokondriel morfologi. Mitokondrier har et to-membran system, der definerer forskellige underrum (A). Cristae er indfoldninger af den indre membran med definerede funktioner (B). Forkortelser: OMM, ydre mitokondriemembran; ICS, intracristal rum; IMS, intermembran rum; CM, cristae membran; IBM, indre grænsemembran; IMM, indre mitokondriemembran; CT, cristae spids; CJ, cristae kryds. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk arbejdsgang. SH-SY5Y-celler eller primære rottehippocampale neuroner dyrkes på et PDL-belagt dækglas. SH-SY5Y-celler dyrkes parallelt for at forblive udifferentierede eller udsættes for RA-differentiering i løbet af seks dage. Primære hippocampale neuroner hos rotter blev dyrket på et PDL-belagt dækglas efter at have været isoleret fra hippocampale sektioner i syv dage. Når de var klar til at blive afbildet, blev cellerne farvet med PKMO og afbildet med STED. Rå STED-billeder dekonvoleres derefter, og de dekonvolverede billeder behandles i FIJI for at opnå størrelses- og formmålinger, såsom cristae-tæthed, areal, omkreds, cirkularitet og billedformat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figur 3: Billeddannelse af mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED billede z-stack fremskrivninger (højre) af mitokondrier fra ikke-differentierede (A) og RA-differentierede (B) SH-SY5Y-celler med PKMO-farvning vises. En timelapse med 30 s intervaller og 5 iterationer af RA-differentierede SH-SY5Y-celler vises (C) med udvalgte regioner (hvide bokse) udvidet på (D) ved hjælp af skalerede billeder af disse regioner uden interpolation. Skalastænger: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figur 4: Billeddannelse af mitokondrier i primære hippocampale neuroner hos rotter. Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED (højre) billede z-stack fremskrivninger af mitokondrier fra primære rottehippocampale neuroner er vist (A). En timelapse med 25 s intervaller og 5 iterationer af mitokondrier i disse neuroner er vist (B). Skalastænger: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figur 5: Behandling af deconvolved STED-billeder i ImageJ. Repræsentativ brug af Trainable Weka Segmentation-pluginet til måling af cristae-størrelse og -form vises (A). Fra venstre mod højre vises følgende billeder: det deconvolved STED-billede, sandsynlighedskortet baseret på segmentering fra TWS-pluginet, masken fra tærskelværdi i FIJI ved hjælp af sandsynlighedskortet som input, masken med ROI'erne skitseret og ROI'erne overlejret på det originale deconvolved STED-billede. De resulterende målinger af areal, perimeter, cirkularitet og størrelsesforhold, der svarer til disse objekter, findes i supplerende tabel 1. Et linjeplot, der bruger det dekonvolverede STED-billede til at måle afstande fra top til top som aflæsning for cristae-tæthed, vises (B). Skalabjælker: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Pixelstørrelse (nm)</td>
			<td>Opholdstid (μs)</td>
			<td>Linje iflg.</td>
			<td>561 nm excitation under STED-erhvervelse (%)</td>
			<td>775 nm STED-udtømningseffekt (%)</td>
			<td>Trinstørrelse (nm)</td>
			<td>Pinhole (AU)</td>
			<td>Timelapse-interval(mer)</td>
			<td>Timelapse-iterationer</td>
		</tr><tr><td>Ikke-differentieret SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differe-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Primære neuroner</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">BEMÆRK: Pixelstørrelsen kan variere afhængigt af billedkravene og hensigten om at dekonvolere billeder. Korrekt prøveudtagning er nødvendig for dekonvolution. Pixelstørrelser til rå STED-billeder uden dekonvolution kan gå op til 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Oversigt over STED-anskaffelsesparametre. De indstillinger, der bruges til 2D STED-billeddannelse for hver celletype, udifferentieret SH-SY5Y, RA-differentieret SH-SY5Y og primære hippocampale neuroner hos rotter, vises. For alle time-lapses blev der taget 5 iterationer med varierende intervaller baseret på ROI-størrelse.
Supplerende figur 1: Billeddannelse af SH-SY5Y-celler med tilsætning af amyloid-β (Aβ). Repræsentative konfokale (venstre), rå STED (midten) og dekonvolverede STED (højre) billeder af RA-differentierede SH-SY5Y-celler med PKMO-plet (øverst) og Aβ-HiLyte647 (nederst) vises (A). Flettede z-stack-projektioner af rå PKMO STED (grøn) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller deconvolved PKMO STED (grøn) med deconvolved Aβ STED (magenta) (C) vises. Skalabjælker: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 1: Størrelses- og formmålinger af segmenteret cristae. Størrelses- og formmålingerne af areal (μm2), omkreds (μm), cirkularitet og billedformat, svarende til objekterne skitseret i figur 5A fra segmenterede mitokondrier, vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende tabel 2: Sammenfatning af anskaffelsesparametre med amyloid-β-prøver. De indstillinger, der bruges til 2D STED-billeddannelse af PKMO og Aβ-HiLyte647 i udifferentierede og RA-differentierede SH-SY5Y-celler, vises. Konfokal af Aβ-HiLyte647 kan anvendes alene, da der ikke er nogen specifik struktur at løse; STED-billeder af Aβ-HiLyte647 vises her for mindre partikelstørrelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 1: Amyloid-β behandlingsprotokol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Denne protokol præsenterer en arbejdsgang til formering, differentiering og farvning af dyrkede SH-SY5Y-celler og primære rottehippocampale neuroner til mitokondriel ultrastrukturvisualisering og analyse ved hjælp af stimuleret emissionsudtømning (STED) mikroskopi.

Brug af Live Cell STED-billeddannelse til at visualisere mitokondriel indre membran ultrastruktur i neuronale cellemodeller

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Vores forskningsprogram fokuserer på strukturelle og funktionelle aspekter af mitokondrier, især da de vedrører aldringsrelateret dysfunktion. Til dette formål bruger vi en bred vifte af biofysiske, biokemiske og strukturelle teknikker til at udforske de grundlæggende mekanismer for mitokondriel aldring og til at udvikle terapeutiske interventioner for at bevare og genoprette mitokondriel sundhed. Mitokondriel funktion og struktur er uløseligt forbundet.Standard lysmikroskopiteknikker er velegnede til måling af mitokondriefunktioner i stor skala som grundlæggende morfologi og netværksstrukturer. Analyse af mitokondriel ultrastruktur eller funktioner, der kræver højere opløsning end ved traditionel optisk mikroskopi, udføres typisk ved hjælp af elektronmikroskopi eller tomografi på faste prøver. Superopløsningsmikroskopi er en fluorescensbaseret billeddannelsesteknik, der måler funktioner ud over diffraktionsgrænsen.For mitokondrier omfatter dette målinger af proteinfordeling i nanoskala og cristae-arkitektur. Den stead imaging protokol, der er beskrevet her, giver forskere mulighed for at måle den detaljerede struktur af den indre membran i levende celler. Live cellebilleddannelse giver os mulighed for at observere og kvantitativt analysere komplekse træk ved cristae under fysiologisk relevante forhold uden behov for prøvefiksering.Dette vil give forskere ny indsigt i de dynamiske ændringer, der forekommer i ultrastrukturelle træk og deres tidsmæssige reaktioner på stressorer og farmakologiske forbindelser.