Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
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Primäre Hippocampus-Neuronen der Ratte wurden von Dr. George Lykotrafitis und Shiju Gu vom Biomedical Engineering Department der University of Connecticut (Storrs, CT, USA) geliefert. Das Abberior STED-Instrument, das in der Advanced Light Microscopy Facility im Center for Open Research Resources and Equipment untergebracht ist, wurde mit einem NIH-Stipendium erworben S10OD023618 an Christopher O'Connell vergeben. Diese Forschung wurde durch ein NIH-Stipendium finanziert R01AG065879 an Nathan N. Alder vergeben.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll präsentiert die Verwendung der humanen Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y und primärer Hippocampus-Neuronen der Ratte mit dem neuartigen IMM-gerichteten PKMO-Farbstoff für die STED-Bildgebung von lebenden Zellen. Aufgrund der Neuartigkeit von PKMO gibt es derzeit nur wenige Publikationen, die diesen Farbstoff für die Live-STED-Bildgebung verwenden. Die Verwendung dieser Zelltypen für die STED-Bildgebung stellt eine Herausforderung dar, insbesondere weil neuronale Zellen engere Mitochondrien aufweisen. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der verwendete PKMO-Farbstoff, da er für Zellen toxisch sein kann. Verschiedene Zellen und Zelllinien reagieren unterschiedlich auf den Farbstoff, daher können Anpassungen der Farbstoffkonzentration und der Inkubationszeit erforderlich sein, um die Ergebnisse für ein starkes Signal zu optimieren, ohne die Zellen zu schädigen. Eine vorgeschlagene Lösung besteht darin, die Konzentration zu senken und die Färbezeitzu verlängern 63; Dies kann jedoch zu einer schlechteren Färbung führen, ohne die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen.
Ähnlich wie PKMO weist auch der kommerzielle Farbstoff Live Orange mito (Table of Materials) eine gewisse Zelltoxizität auf. Dieser Farbstoff wurde für eine Vielzahl von kultivierten Zellen verwendet, war aber nicht in der Lage, eine vergleichbare Färbung in RA-differenzierten SH-SY5Y-Zellen mit den gleichen Parametern wie ihre undifferenzierten Gegenstücke erfolgreich zu zeigen (unsere unveröffentlichten Beobachtungen). Zugängliche Färbeprotokolle können jedoch für diese Sonde und ausgewählte Zelltypen optimiert werden. Mit diesem Farbstoff wurden Detektor-Gating-Zeiten von 1-1,05 bis 7-7,05 ns verwendet, wobei alle anderen Parameter in Tabelle 1 gleich blieben. Im Allgemeinen lieferte die Färbung von Zellen mit 200-250 nM Live Orange Mito für 45 min vergleichbare Ergebnisse wie die PKMO-Ergebnisse. Eine Färbung mit höherer Konzentration für kürzere Zeit oder eine Färbung mit niedrigerer Konzentration für die gleiche Zeit oder etwas länger kann zu anderen Ergebnissen führen und für andere Zelltypen oder Wachstumsbedingungen günstig sein.
Die Bildgebung primärer Hippocampus-Neuronen der Ratte unterscheidet sich von immortalisierten Zellen durch die Art der Axon- und Dendritenprojektionen sowie durch die mitochondriale Verteilung zum Zeitpunkt der Bildgebung. Eine Schwierigkeit in diesem Teil des Protokolls besteht darin, dass die Aussaatdichte bestimmt, ob die Primärkulturen in der Lage sind, zu haften und gesund zu wachsen, und bei höheren Dichten neigen die Projektionen dazu, um DIV 10 zu wachsen. Daher stammen die Mitochondrien, die von diesen primären Neuronen abgebildet werden, wahrscheinlich aus dem Zellkörper und nicht aus den Projektionen. Erfolgreiches Wachstum aus einer geringeren Ausgangszelldichte führt jedoch zu besseren Bildgebungsergebnissen zu späteren Wachstumszeiten. Der Schlüssel liegt darin, einen niedrigen Hintergrund und unscharfes Licht zu gewährleisten, um den besten Kontrast für STED zu erzielen. Um Bedenken hinsichtlich der Zellpopulation auszuräumen, verhindert die Kultivierung primärer Hippocampuszellen in B27-ergänzten Neuronenwachstumsmedien das Wachstum von Gliazellen, und die Quelle berichtet, dass <5 % der Zellen Astrozyten sind und das Fehlen von NbActiv1-Präparat in den Wachstumsmedien die Anzahl der Astrozyten in Kulturen auf <2 % reduziert87. Sowohl für kultivierte SH-SY5Y-Zellen als auch für primäre Neuronen des Rattenhippocampus trägt die PDL-Beschichtung, die für das Wachstum verwendet wird, zur Hintergrundtrübung in Bildern bei. Mit den in (Tabelle 1) angegebenen Einstellungen wird ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht, und die Dekonvolution entfernt den größten Teil des beobachteten Hintergrunds.
Zusätzlich zu der hier behandelten Bildgebung ist es auch möglich, Zellen vor oder während der Bildgebung zu behandeln oder zu belasten. Zum Beispiel induziert die Zugabe von tert-Butylhydrogenperoxid (tBHP) oxidativen Stress, und es ist möglich, Veränderungen in den Mitochondrien im Laufe der Zeit nach der Zugabe zu überwachen. Die Zugabe von Amyloid-β (Aβ) mit einer fluoreszierenden Markierung ermöglicht die Überwachung der Verteilung dieses Peptids in Bezug auf die Mitochondrien sowie die mitochondriale Struktur im Laufe der Zeit. Die Gesundheit der Mitochondrien wurde stark mit Alzheimer in Verbindung gebracht und es wird allgemein angenommen, dass sie eine Rolle bei der Aβ-Toxizität spielt 43,71,72. Insbesondere beeinflusst der Differenzierungsstatus von SH-SY5Y-Zellen die Lokalisierung von Aβ-Proteinvorläufern (AβPP)85, und Experimente mit AβPP sollten sorgfältig konstruiert werden.
Als Beispiel dafür, wie dieses Protokoll angepasst werden kann, wird gezeigt, dass die fluoreszierende Variante Aβ(1-42)-HiLyte 647 15 min vor der Bildgebung zu PKMO-gefärbten Zellen hinzugefügt werden kann (Ergänzende Abbildung 1). Die Bildgebungsparameter sind ähnlich (Ergänzende Tabelle 2), mit dem Hauptunterschied, dass bei der Abbildung schmalerer Mitochondrien eine kleinere Lochblende benötigt wird. Die Bildgebung von Aβ-HiLyte647 mit STED erfordert eine geringere Gesamtanregung (6%-8%) und STED-Verarmung (10%-12%) Laserleistung und weniger Akkumulationen (sechs). Das Detektor-Gating wird ebenfalls von 0,1 auf 10 ns erweitert. Obwohl die STED-Auflösung von Aβ nicht erforderlich ist, waren das gesamte Signal-Rausch-Verhältnis und die Aβ-Partikelgröße von rohem STED besser als die der konfokalen Bilder, und eine anschließende Dekonvolution kann ebenfalls durchgeführt werden. Das Sammeln von STED-Bildern und das Dekonvoltieren von rohen STED-Z-Stack-Projektionen von Aβ erscheint besonders nützlich, wenn es mit rohen STED- oder dekonvolvierten STED-Bildern der PKMO-Färbung zusammengeführt wird (Ergänzende Abbildung 1B,C). Beide Kanäle wurden in einem einzigen Frame-Schritt erfasst. Messungen der zeitabhängigen Lokalisation, ähnlich den in Abbildung 2 aufgeführten und gegebenenfalls in Abbildung 5 dargestellten, und der Unterschiede in der Cristae-Architektur können nach einer Spannungsbehandlung oder anderen Ergänzungen durchgeführt werden.
Andere mögliche Methoden zur dualen Markierung von Mitochondrien in lebenden Zellen, über die hier nicht berichtet wird, die aber von anderen berichtet wurden, umfassen die Verwendung von SNAP-markierten Proteinen93, Halo-markierten Proteinen und die Verwendung anderer zellpermeabler Farbstoffe mit generischen Zielen, wie z. B. mtDNA63. Bemerkenswert ist, dass die Markierungsstrategie von SNAP- und Halo-Tagging die resultierende Fluoreszenzsignalintensität und Langlebigkeit bei der Bildgebungbeeinflusst 94. Während dieses Protokoll mehrere Beispiele für Analysen enthält, die auf segmentierte Mitochondrien angewendet werden können, gibt es viele andere Analysen, die Softwarepakete an diesen Bildern durchführen können.

Mitochondrien sind eukaryotische Organellen endosymbiontischen Ursprungs, die für die Regulierung mehrerer zellulärer Schlüsselprozesse verantwortlich sind, darunter der intermediäre Stoffwechsel und die ATP-Produktion, die Ionenhomöostase, die Lipidbiosynthese und der programmierte Zelltod (Apoptose). Diese Organellen sind topologisch komplex und enthalten ein Doppelmembransystem, das mehrere Unterkompartimente1 etabliert (Abbildung 1A). Die äußere mitochondriale Membran (OMM) interagiert mit dem Zytosol und stellt direkte interorganelle Kontakte her 2,3. Die innere mitochondriale Membran (IMM) ist eine energiesparende Membran, die Ionengradienten aufrechterhält, die hauptsächlich als elektrisches Membranpotential (ΔΨm) gespeichert sind, um die ATP-Synthese und andere energieintensive Prozesse anzutreiben 4,5. Die IMM ist weiter unterteilt in die innere Grenzmembran (IBM), die eng an die OMM angrenzt, und hervorstehende Strukturen, die als Cristae bezeichnet werden und von der Cristae-Membran (CM) gebunden werden. Diese Membran grenzt das innerste Matrixkompartiment vom intrakristallalen Raum (ICS) und dem Intermembranraum (IMS) ab.
Mitochondrien haben eine dynamische Morphologie, die auf kontinuierlichen und ausgewogenen Spaltungs- und Fusionsprozessen basiert, die von Mechanoenzymen der Dynamin-Superfamilie gesteuert werden6. Die Fusion ermöglicht eine erhöhte Konnektivität und Bildung von retikulären Netzwerken, während die Spaltung zu einer Fragmentierung der Mitochondrien führt und die Entfernung beschädigter Mitochondrien durch Mitophagie ermöglicht7. Die mitochondriale Morphologie variiert je nach Gewebetyp8 und Entwicklungsstadium9 und wird so reguliert, dass sich die Zellen an Faktoren wie Energiebedarf10,11 und Stressoren12 anpassen können. Morphometrische Standardmerkmale von Mitochondrien, wie z. B. das Ausmaß der Netzwerkbildung (vernetzt vs. fragmentiert), der Umfang, die Fläche, das Volumen, die Länge (Seitenverhältnis), die Rundheit und der Grad der Verzweigung, können durch optische Standardmikroskopie gemessen und quantifiziert werden, da die Größe dieser Merkmale größer ist als die Beugungsgrenze des Lichts (~200 nm)13.
Die Cristae-Architektur definiert die innere Struktur der Mitochondrien (Abbildung 1B). Die Vielfalt der Cristae-Morphologien kann grob in flach (lamellär oder diskoidal) oder tubulär-vesikulär eingeteilt werden14. Alle Cristae sind an der IBM durch röhrenförmige oder schlitzartige Strukturen verbunden, die als Cristae Junctions (CJs) bezeichnet werden und dazu dienen können, das IMS vom ICS und das IBM vom CM15 zu trennen. Die Morphologie der Cristae wird durch Schlüsselproteinkomplexe des IMM reguliert, einschließlich (1) der mitochondrialen Kontaktstelle und des Cristae-Organisationssystems (MICOS), das sich an CJs befindet und die IMM-OMM-Kontakte16 stabilisiert, (2) der GTPase der Optikusatrophie 1 (OPA1), die den Umbau der Cristae 17,18,19 reguliert, und (3) der F1FO ATP-Synthase, die stabilisierende oligomere Anordnungen an den Cristae-Spitzen (CTs) bildet20, 21. Anmelden Darüber hinaus ist das IMM mit den nicht-zweischichtigen Phospholipiden Phosphatidylethanolamin und Cardiolipin angereichert, die das stark gekrümmte IMM22 stabilisieren. Cristae sind auch dynamisch und zeigen morphologische Veränderungen unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. verschiedenen Stoffwechselzuständen 23,24, mit unterschiedlichen respiratorischen Substraten 25, unter Hunger und oxidativem Stress 26,27, mit Apoptose 28,29 und mit Alterung 30. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cristae größere Umbauereignisse auf einer Zeitskala von Sekunden durchlaufen können, was ihre dynamische Natur unterstreicht31. Mehrere Merkmale von Cristae können quantifiziert werden, einschließlich der Abmessungen von Strukturen innerhalb einzelner Cristae (z. B. CJ-Breite, Crista-Länge und -Breite) und Parameter, die einzelne Crista mit anderen Strukturen in Beziehung setzen (z. B. Intra-Cristae-Abstand und Cristae-Einfallswinkel relativ zum OMM)32. Diese quantifizierbaren Cristae-Parameter zeigen eine direkte Korrelation mit der Funktion. Zum Beispiel steht das Ausmaß der mitochondrialen ATP-Produktion in einem positiven Zusammenhang mit der Häufigkeit von Cristae, quantifiziert als Cristae-Dichte oder Cristae-Anzahl, die auf ein anderes Merkmal normiert ist (z. B. Cristae pro OMM-Fläche)33,34,35. Da die IMM-Morphologie durch nanoskalige Merkmale definiert ist, umfasst sie eine mitochondriale Ultrastruktur, die bildgebende Verfahren erfordert, die eine Auflösung bieten, die größer als die Lichtbeugungsgrenze ist. Wie im Folgenden beschrieben, umfassen solche Techniken die Elektronenmikroskopie und die superauflösende Mikroskopie (Nanoskopie).
Die Nerven- und Gliazellen des zentralen Nervensystems (ZNS) sind in besonderem Maße auf die Funktion der Mitochondrien angewiesen. Im Durchschnitt macht das Gehirn nur 2 % des gesamten Körpergewichts aus, verwertet aber 25 % der gesamten Körperglukose und ist für 20 % des Sauerstoffverbrauchs des Körpers verantwortlich, was es anfällig für Beeinträchtigungen des Energiestoffwechsels macht36. Progressive neurodegenerative Erkrankungen (NDs), einschließlich der Alzheimer-Krankheit (AD), der amyotrophen Lateralsklerose (ALS), der Huntington-Krankheit (HD), der Multiplen Sklerose (MS) und der Parkinson-Krankheit (PD), gehören zu den bisher am besten untersuchten Pathologien, wobei die Forschungsbemühungen vom Verständnis der molekularen Grundlagen dieser Krankheiten bis hin zur Suche nach potenzieller therapeutischer Prävention und Interventionen reichen. NDs sind mit erhöhtem oxidativem Stress verbunden, der zum Teil auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zurückzuführen ist, die von der mitochondrialen Elektronentransportkette (ETC) erzeugt werden37, sowie auf eine veränderte mitochondriale Kalziumverarbeitung38 und den mitochondrialen Lipidstoffwechsel39. Diese physiologischen Veränderungen werden von festgestellten Defekten in der mitochondrialen Morphologie begleitet, die mit AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS 50 und PD 51,52,53 assoziiert sind . Diese strukturellen und funktionellen Defekte können durch komplexe Ursache-Wirkungs-Beziehungen gekoppelt werden. Da beispielsweise die Cristae-Morphologie die OXPHOS-Enzyme54 stabilisiert, werden mitochondriale ROS nicht nur vom ETC erzeugt, sondern schädigen auch die Infrastruktur, in der sich die ETC befindet, und fördern einen Feed-Forward-ROS-Zyklus, der die Anfälligkeit für oxidative Schäden erhöht. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Desorganisation von Cristae Prozesse wie die Freisetzung von mitochondrialer DNA (mtDNA) und Entzündungswege auslöst, die mit Autoimmun-, Stoffwechsel- und altersbedingten Erkrankungen verbunden sind55. Daher ist die Analyse der mitochondrialen Struktur der Schlüssel zu einem vollständigen Verständnis von NDs und ihren molekularen Grundlagen.
Gängige Methoden zur Betrachtung von Cristae, darunter die Transmissionselektronenmikroskopie, die Elektronentomographie und die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) sowie die Röntgentomographie, insbesondere die Kryo-Soft-Röntgentomographie, haben wichtige Erkenntnisse zutage gefördert und arbeiten mit einer Vielzahl von Probentypen 56,57,58,59,60. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der besseren Beobachtung der Organellen-Ultrastruktur sind diese Methoden immer noch mit dem Vorbehalt verbunden, dass sie eine Probenfixierung erfordern und daher die Echtzeitdynamik von Cristae nicht direkt erfassen können. Die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere in Form der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM), der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), der photoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie (PALM), der Expansionsmikroskopie (ExM) und der Stimulated Emission Depletion (STED)-Mikroskopie, ist zu einer beliebten Methode geworden, um Strukturen zu betrachten, die eine Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze erfordern, die klassische Methoden der optischen Mikroskopie einschränkt. Wenn ExM in Verbindung mit einer anderen Super-Resolution-Technik verwendet wird, sind die Ergebnisse beeindruckend, aber die Probe muss in einem Gel61 fixiert und gefärbt werden. Im Vergleich dazu wurden SIM, PALM/STORM und STED alle erfolgreich mit lebenden Proben eingesetzt, und neue und vielversprechende Farbstoffe, die das IMM im Allgemeinen färben, bieten einen neuartigen und einfachen Ansatz für die Live-Bildgebung der Dynamik von Mitochondria cristae 62,63,64,65,66. Jüngste Fortschritte bei Lebendfarbstoffen für die STED-Bildgebung haben die Helligkeit und Photostabilität der Farbstoffe verbessert, und diese Farbstoffe zielen mit einem höheren Grad an Spezifität als ihre Vorgänger auf das IMM ab. Diese Entwicklungen ermöglichen die Sammlung von Langzeit-Zeitraffer- und Z-Stack-Experimenten mit hochauflösender Bildgebung und öffnen die Tür zu einer besseren Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur und Dynamik in lebenden Zellen.
In dieser Arbeit werden Protokolle für die Bildgebung von lebenden Zellen von undifferenzierten und differenzierten SH-SY5Y-Zellen bereitgestellt, die mit dem Farbstoff PKmito Orange (PKMO) unter Verwendung von STED63 gefärbt wurden. Die SH-SY5Y-Zelllinie ist ein dreimal subkloniertes Derivat der elterlichen Zelllinie SK-N-SH, das aus einer Knochenmarkbiopsie des metastasierten Neuroblastoms67,68,69,70 gewonnen wurde. Diese Zelllinie ist ein häufig verwendetes In-vitro-Modell in der ND-Forschung, insbesondere bei Krankheiten wie AD, HD und PD, bei denen eine mitochondriale Dysfunktion stark beteiligt ist 10,43,71,72,73. Die Fähigkeit, SH-SY5Y-Zellen durch Manipulation von Kulturmedien in Zellen mit einem neuronenähnlichen Phänotyp zu differenzieren, hat sich als geeignetes Modell für die neurowissenschaftliche Forschung erwiesen, ohne auf primäre neuronale Zellen angewiesen zu sein10,74. In diesem Protokoll wurde dem Zellkulturmedium Retinsäure (RA) zugesetzt, um die Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen zu induzieren. RA ist ein Vitamin-A-Derivat und reguliert nachweislich den Zellzyklus und fördert die Expression von Transkriptionsfaktoren, die die neuronale Differenzierung regulieren75. Ein Protokoll für die Kultivierung und Bildgebung von lebenden Zellen von Neuronen, die aus dem Hippocampus der Ratte isoliert wurden, wird ebenfalls bereitgestellt. Es wurde gezeigt, dass der Hippocampus von der mitochondrialen Degeneration betroffen ist und zusammen mit dem Kortex eine wichtige Rolle beim Altern und ND spielt 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Mitochondrien spielen viele wesentliche Rollen in der Zelle, darunter die Energieproduktion, die Regulierung derCa2+ -Homöostase, die Lipidbiosynthese und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Diese Mitochondrien-vermittelten Prozesse übernehmen spezialisierte Rollen in Neuronen, koordinieren den aeroben Stoffwechsel, um den hohen Energiebedarf dieser Zellen zu decken, modulieren die Ca2+ -Signalgebung, liefern Lipide für das Wachstum und die Regeneration von Axonen und stimmen die ROS-Produktion auf die neuronale Entwicklung und Funktion ab. Die mitochondriale Dysfunktion ist daher ein zentraler Treiber bei neurodegenerativen Erkrankungen. Struktur und Funktion der Mitochondrien sind untrennbar miteinander verbunden. Die morphologisch komplexe innere Membran mit strukturellen Infolds, die Cristae genannt werden, beherbergt viele molekulare Systeme, die die charakteristischen Prozesse des Mitochondriums ausführen. Die architektonischen Merkmale der inneren Membran sind ultrastrukturell und daher zu klein, um mit herkömmlicher beugungsbegrenzter aufgelöster Mikroskopie sichtbar gemacht zu werden. Daher stammen die meisten Erkenntnisse über die mitochondriale Ultrastruktur aus der Elektronenmikroskopie an fixierten Proben. Neue Technologien in der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie bieten jedoch jetzt eine Auflösung von bis zu zehn Nanometern und ermöglichen die Visualisierung ultrastruktureller Merkmale in lebenden Zellen. Die hochauflösende Bildgebung bietet daher eine noch nie dagewesene Möglichkeit, feine Details der mitochondrialen Struktur, der nanoskaligen Proteinverteilungen und der Cristae-Dynamik direkt abzubilden, was grundlegende neue Erkenntnisse liefert, die Mitochondrien mit der menschlichen Gesundheit und Krankheit in Verbindung bringen. Dieses Protokoll stellt die Verwendung von hochauflösender Mikroskopie mit stimulierter Emissionsverarmung (STED) vor, um die mitochondriale Ultrastruktur von lebenden menschlichen Neuroblastomzellen und primären Rattenneuronen zu visualisieren. Dieses Verfahren ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Wachstum und Differenzierung der SH-SY5Y-Zelllinie, (2) Isolierung, Plattierung und Wachstum von primären Hippocampusneuronen der Ratte, (3) Verfahren zur Färbung von Zellen für die lebende STED-Bildgebung, (4) Verfahren für STED-Experimente mit lebenden Zellen unter Verwendung eines STED-Mikroskops als Referenz und (5) Anleitung zur Segmentierung und Bildverarbeitung anhand von Beispielen zur Messung und Quantifizierung morphologischer Merkmale der inneren Membran.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Dieses Protokoll beschreibt die Zellwachstumsbedingungen für kultivierte und primäre Zellen mit Schwerpunkt auf der STED-Bildgebung von lebenden Zellen und der anschließenden Analyse von mitochondrialen Cristae. Projektionen, die mit ImageJ von Mitochondrien aus undifferenzierten SH-SY5Y- (Abbildung 3A) und RA-differenzierten SH-SY5Y-Zellen (Abbildung 3B) erstellt wurden, können als Z-Stapel mit herkömmlichen konfokalen und STED-Zellen gesammelt werden, und die STED-Rohbilder können dann entfaltet werden. Es können auch Zeitrafferaufnahmen durchgeführt und anschließend entfaltet werden (Abbildung 3C,D). Unter Verwendung leicht unterschiedlicher Bildgebungsparameter für primäre Hippocampusneuronen der Ratte (Tabelle 1) können konfokale und rohe STED-Bilder als Z-Stapel aufgenommen und die rohen STED-Bilder entfaltet werden (Abbildung 4A). Zeitraffer-Aufnahmen von Mitochondrien aus primären Neuronen sind ebenfalls möglich (Abbildung 4B). Im Allgemeinen sollten die Zeitrafferbilder in der Lage sein, mitochondriale dynamische Ereignisse zu zeigen.
Wenn rohe STED- und dekonvolvierte STED-Z-Stack-Projektionen aus den für die Segmentierung verwendeten Proben konsistent erscheinen, werden quantitative Messungen durchgeführt. Das TWS-Plugin verwendet das dekonvolvierte STED-Bild, um zu segmentieren, um eine Wahrscheinlichkeitsmaske zu erstellen, die dann verwendet wird, um eine binäre Maske der Cristae zu erstellen, um Größen- und Formparameter zu erhalten (Abbildung 5A). Die Regionen aus dieser Maske werden im ROI-Manager gespeichert und können bei Bedarf auf das STED-Rohbild angewendet werden, um Unterschiede in der relativen Intensität zu messen. Die dekonvolvierten STED-Projektionen können auch verwendet werden, um die Periodizität und Dichte der Kristen in einem bestimmten Gebiet zu bestimmen (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Abbildung 1: Mitochondriale Morphologie. Mitochondrien haben ein Zwei-Membran-System, das verschiedene Subkompartimente definiert (A). Cristae sind Einfaltungen der inneren Membran mit definierten Merkmalen (B). Abkürzungen: OMM, äußere Mitochondrienmembran; ICS, intrakristalliner Raum; IMS, Intermembranraum; CM, Cristae-Membran; IBM, innere Begrenzungsmembran; IMM, innere Mitochondrienmembran; CT, Cristae-Spitze; CJ, Cristae-Kreuzung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs. SH-SY5Y-Zellen oder primäre Hippocampus-Neuronen der Ratte werden auf einem PDL-beschichteten Deckglas gezüchtet. SH-SY5Y-Zellen werden parallel gezüchtet, um über einen Zeitraum von sechs Tagen undifferenziert zu bleiben oder einer RA-Differenzierung unterzogen zu werden. Primäre Hippocampus-Neuronen der Ratte wurden auf einem PDL-beschichteten Deckglas gezüchtet, nachdem sie sieben Tage lang aus Hippocampus-Abschnitten isoliert worden waren. Sobald die Zellen für die Bildgebung bereit waren, wurden sie mit PKMO gefärbt und mit STED abgebildet. Die rohen STED-Bilder werden dann entfaltet, und die entfalteten Bilder werden in Fidschi verarbeitet, um Größen- und Formmessungen wie Cristae-Dichte, Fläche, Umfang, Zirkularität und Seitenverhältnis zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Abbildung 3: Bildgebung von Mitochondrien in SH-SY5Y-Zellen. Repräsentative konfokale (links), rohe STED (Mitte) und Huygens-dekonvolvierte STED-Bild-Z-Stapel-Projektionen (rechts) von Mitochondrien aus nicht-differenzierten (A) und RA-differenzierten (B) SH-SY5Y-Zellen mit PKMO-Färbung sind zu sehen. Ein Zeitraffer mit 30-s-Intervallen und 5 Iterationen von RA-differenzierten SH-SY5Y-Zellen wird gezeigt (C) mit ausgewählten Regionen (weiße Kästchen), die unter Verwendung skalierter Bilder dieser Regionen ohne Interpolation erweitert (D) werden. Maßstabsleisten: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Abbildung 4: Bildgebung von Mitochondrien in primären Hippocampusneuronen der Ratte. Repräsentative konfokale (links), rohe STED (Mitte) und Huygens-dekonvolvierte STED-Bild-Z-Stack-Projektionen von Mitochondrien aus primären Hippocampusneuronen der Ratte sind dargestellt (A). Es wird ein Zeitraffer mit 25-Sekunden-Intervallen und 5 Iterationen von Mitochondrien in diesen Neuronen gezeigt (B). Maßstabsleisten: A, 250 nm; B , 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Abbildung 5: Verarbeitung von dekonvolvierten STED-Bildern in ImageJ. Die repräsentative Verwendung des Trainable Weka Segmentation Plugins zur Messung von Cristae Größe und Form wird gezeigt (A). Von links nach rechts werden die folgenden Bilder gezeigt: das dekonvolvierte STED-Bild, die Wahrscheinlichkeitskarte basierend auf der Segmentierung aus dem TWS-Plugin, die Maske von der Schwellenwertbestimmung in Fidschi unter Verwendung der Wahrscheinlichkeitskarte als Eingabe, die Maske mit den umrissenen ROIs und die ROIs, die über das ursprüngliche dekonvolvierte STED-Bild gelegt sind. Die resultierenden Flächen-, Umfangs-, Kreis- und Aspektverhältnismessungen, die diesen Objekten entsprechen, sind in der Zusatztabelle 1 zu finden. Es wird ein Liniendiagramm gezeigt, das das dekonvolvierte STED-Bild zur Messung von Spitze-zu-Spitze-Entfernungen als Auslesung für die Cristae-Dichte verwendet (B). Maßstabsleisten: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Pixelgröße (nm)</td>
			<td>Verweilzeit (μs)</td>
			<td>Linie gem.</td>
			<td>561 nm Anregung während der STED-Erfassung (%)</td>
			<td>775 nm STED-Verarmungsleistung (%)</td>
			<td>Schrittweite (nm)</td>
			<td>Lochblende (AU)</td>
			<td>Zeitraffer-Intervall(e)</td>
			<td>Zeitraffer-Iterationen</td>
		</tr><tr><td>Undifferenzierter SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differenziert SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Primäre Neuronen</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">HINWEIS: Die Pixelgröße kann je nach Bildgebungsanforderungen und der Absicht, Bilder zu entflechten, variieren. Für die Entfaltung ist eine ordnungsgemäße Probenahme erforderlich. Die Pixelgrößen für STED-Rohbilder ohne Dekonvolution können bis zu 30 nm betragen.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Zusammenfassung der STED-Erfassungsparameter. Die Einstellungen, die für die 2D-STED-Bildgebung für jeden Zelltyp, undifferenziertes SH-SY5Y, RA-differenziertes SH-SY5Y und primäre Hippocampusneuronen der Ratte verwendet werden, werden angezeigt. Für alle Zeitraffer wurden 5 Iterationen mit unterschiedlichen Intervallen basierend auf der ROI-Größe durchgeführt.
Ergänzende Abbildung 1: Bildgebung von SH-SY5Y-Zellen mit Amyloid-β (Aβ)-Addition. Repräsentative konfokale (links), rohe STED- (Mitte) und dekonvolvierte STED-Bilder (rechts) von RA-differenzierten SH-SY5Y-Zellen mit PKMO-Färbung (oben) und Aβ-HiLyte647 (unten) sind zu sehen (A). Gezeigt werden zusammengeführte Z-Stack-Projektionen von rohem PKMO STED (grün) mit rohem Aβ STED (magenta) (B) oder dekonvolviertem PKMO STED (grün) mit dekonvolviertem Aβ STED (magenta) (C). Maßstabsleisten: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Größen- und Formmaße von segmentierten Cristae. Die Größen- und Formmaße der Fläche (μm2), des Umfangs (μm), der Zirkularität und des Seitenverhältnisses, die den in Abbildung 5A skizzierten Objekten aus segmentierten Mitochondrien entsprechen, sind dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Zusammenfassung der Erfassungsparameter mit Amyloid-β-Proben. Die Einstellungen, die für die 2D-STED-Bildgebung von PKMO und Aβ-HiLyte647 in undifferenzierten und RA-differenzierten SH-SY5Y-Zellen verwendet werden, werden angezeigt. Konfokal von Aβ-HiLyte647 kann allein verwendet werden, da es keine spezifische Struktur gibt, die aufgelöst werden muss. STED-Bilder von Aβ-HiLyte647 sind hier für kleinere Partikelgrößen zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Amyloid-β-Behandlungsprotokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Dieses Protokoll stellt einen Arbeitsablauf für die Vermehrung, Differenzierung und Färbung von kultivierten SH-SY5Y-Zellen und primären Hippocampusneuronen der Ratte für die Visualisierung und Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur unter Verwendung der stimulierten Emissionsverarmungsmikroskopie (STED) dar.

Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Unser Forschungsprogramm konzentriert sich auf strukturelle und funktionelle Aspekte der Mitochondrien, insbesondere im Zusammenhang mit altersbedingten Dysfunktionen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein breites Spektrum an biophysikalischen, biochemischen und strukturellen Techniken, um die grundlegenden Mechanismen des mitochondrialen Alterns zu erforschen und therapeutische Interventionen zur Erhaltung und Wiederherstellung der mitochondrialen Gesundheit zu entwickeln. Mitochondriale Funktion und Struktur sind untrennbar miteinander verbunden.Standard-Lichtmikroskopie-Techniken eignen sich für die Messung großräumiger mitochondrialer Merkmale wie grundlegende Morphologie und Netzwerkstrukturen. Die Analyse der mitochondrialen Ultrastruktur oder von Merkmalen, die eine höhere Auflösung als die herkömmliche optische Mikroskopie erfordern, erfolgt in der Regel mit Elektronenmikroskopie oder Tomographie an fixierten Proben. Die hochauflösende Mikroskopie ist ein fluoreszenzbasiertes Bildgebungsverfahren, das Merkmale jenseits der Beugungsgrenze misst.Für Mitochondrien umfasst dies Messungen der nanoskaligen Proteinverteilung und der Cristae-Architektur. Das hier beschriebene Stead-Imaging-Protokoll ermöglicht es den Forschern, die detaillierte Struktur der inneren Membran in lebenden Zellen zu messen. Die Bildgebung lebender Zellen ermöglicht es uns, komplexe Merkmale von Cristae unter physiologisch relevanten Bedingungen zu beobachten und quantitativ zu analysieren, ohne dass eine Probenfixierung erforderlich ist.Dies wird den Forschern neue Einblicke in die dynamischen Veränderungen geben, die in ultrastrukturellen Merkmalen auftreten, und ihre zeitlichen Reaktionen auf Stressoren und pharmakologische Verbindungen.