Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות סופקו על ידי ד"ר ג'ורג' ליקוטראפיטיס ושיג'ו גו מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קונטיקט (סטורס, קונטיקט, ארה"ב). מכשיר ה-Abberior STED השוכן במתקן המתקדם למיקרוסקופיית אור במרכז למשאבי מחקר וציוד פתוח נרכש במענק NIH S10OD023618 שהוענק לכריסטופר או'קונל. מחקר זה מומן על ידי R01AG065879 המענקים של NIH שהוענקו לנתן נ. אלדר.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מציג את השימוש בקו תאי נוירובלסטומה אנושיים SH-SY5Y ונוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדות עם צבע PKMO חדשני ממוקד IMM עבור דימות STED של תאים חיים. בשל החידוש של PKMO, יש כיום מעט שפורסם באמצעות צבע זה עבור הדמיה STED חי. שימוש בסוגי תאים אלה להדמיית STED מציב אתגרים, במיוחד מכיוון שלתאים עצביים יש מיטוכונדריה צרה יותר. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא צבע PKMO בשימוש, כפי שהוא יכול להיות רעיל לתאים. תאים וקווי תאים שונים מגיבים באופן שונה לצבע, ולכן ייתכן שיידרשו התאמות לריכוז הצבע ולזמן הדגירה כדי למטב את התוצאות לקבלת אות חזק מבלי לפגוע בתאים. פתרון מוצע הוא להוריד את הריכוז ולהגדיל את זמן הצביעה63; עם זאת, זה עלול לגרום לכתמים גרועים יותר מבלי להגדיל את כדאיות התא.
בדומה ל-PKMO, גם הצבע המסחרי Live Orange mito (Table of Materials) מציג רעילות מסוימת של תאים. צבע זה שימש למגוון תאים בתרבית, אך לא הצליח להציג צביעה דומה בתאי SH-SY5Y ממוינים RA בהצלחה עם אותם פרמטרים כמו עמיתיהם הבלתי ממוינים (התצפיות שלנו שלא פורסמו). עם זאת, פרוטוקולי צביעה מקובלים עשויים להיות ממוטבים עבור בדיקה זו וסוגי תאים נבחרים. עם צבע זה נעשה שימוש בזמני גלאי של 1-1.05 עד 7-7.05 ns, כאשר כל שאר הפרמטרים בטבלה 1 נותרו זהים. באופן כללי, צביעת תאים עם מיטו כתום חי של 200-250 ננומטר במשך 45 דקות הניבה תוצאות דומות כפי שהראו תוצאות PKMO. צביעה בריכוז גבוה יותר למשך פחות זמן או צביעה בריכוז נמוך יותר למשך אותה כמות זמן או מעט יותר יכולה להניב תוצאות שונות ועשויה להיות חיובית לסוגי תאים אחרים או לתנאי גדילה אחרים.
הדמיה של תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה שונה מתאים אימורטליים בשל אופי הקרנות האקסון והדנדריט, כמו גם התפלגות המיטוכונדריה בזמן ההדמיה. קושי אחד בחלק זה של הפרוטוקול הוא שצפיפות הזריעה קובעת אם התרבויות הראשוניות יוכלו להיצמד ולגדול בצורה בריאה, ובצפיפות גבוהה יותר, התחזיות נוטות לגדול יתר על המידה על ידי DIV 10. לכן, המיטוכונדריה המצולמים מתאי עצב ראשוניים אלה יגיעו ככל הנראה מגוף התא ולא מההקרנות; עם זאת, צמיחה מוצלחת מצפיפות תאים התחלתית נמוכה יותר מניבה תוצאות הדמיה טובות יותר בזמני גידול מאוחרים יותר. המפתח הוא להבטיח רקע חלש ואור מחוץ למיקוד כדי לקבל את הניגודיות הטובה ביותר עבור STED. כדי לטפל בחששות לגבי אוכלוסיית התאים, תרבית תאי היפוקמפוס ראשוניים במצע גדילה של נוירונים בתוספת B27 מונעת צמיחה של תאי גלייה, והמקור מדווח כי <5% מהתאים הם אסטרוציטים והיעדר תוסף NbActiv1 במצע הגידול מפחית את מספר האסטרוציטים בתרביות ל -<2% 87. הן עבור תאי SH-SY5Y בתרבית והן עבור תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, ציפוי PDL המשמש לגדילה תורם לאובך רקע בתמונות. מספיק אות לרעש מתבצע עם ההגדרות המדווחות ב- (טבלה 1) ודה-קונבולוציה מסירה את רוב הרקע שנצפה.
בנוסף לדימות המכוסה כאן, ניתן גם להוסיף טיפולים או מתח לתאים לפני או במהלך ההדמיה. לדוגמה, הוספת טרט-בוטיל מי חמצן (tBHP) גורמת לעקה חמצונית, וניתן לעקוב אחר שינויים במיטוכונדריה לאורך זמן לאחר ההוספה. הוספת β עמילואיד (Aβ) עם תג פלואורסצנטי מאפשרת מעקב אחר התפלגות הפפטיד ביחס למיטוכונדריה וכן אחר המבנה המיטוכונדריאלי לאורך זמן. בריאות המיטוכונדריה מעורבת מאוד באלצהיימר, וקיימת תמיכה נרחבת בכך שהיא ממלאת תפקיד ברעילות Aβ 43,71,72. יש לציין כי מצב ההתמיינות של תאי SH-SY5Y משפיע על לוקליזציה85 של קודמן חלבון Aβ (AβPP), ויש לבנות בזהירות ניסויים באמצעות AβPP.
כדוגמה לאופן שבו פרוטוקול זה יכול להיות מותאם, ניתן לראות כי ניתן להוסיף את הגרסה הפלואורסצנטית Aβ(1-42)-HiLyte 647 לתאים מוכתמים ב-PKMO 15 דקות לפני ההדמיה (איור משלים 1). פרמטרי ההדמיה דומים (טבלה משלימה 2), כאשר ההבדל העיקרי הוא שיש צורך בחור סיכה קטן יותר בעת הדמיה של מיטוכונדריה צרה יותר. הדמיה Aβ-HiLyte647 עם STED דורשת פחות עירור כללי (6%-8%) ודלדול STED (10%-12%) עוצמת לייזר ופחות הצטברות (שש). גלאי gating הוא גם מורחב מ 0.1 ל 10 ns. למרות שרזולוציית STED של Aβ אינה הכרחית, יחס האות לרעש הכולל וגודל חלקיקי Aβ של STED גולמי היו טובים יותר מאלה של התמונות הקונפוקליות, וניתן לבצע גם דה-קונבולוציה לאחר מכן. איסוף תמונות STED והקרנות STED z-stack גולמיות של Aβ נראות שימושיות במיוחד בעת מיזוג עם תמונות STED גולמיות או תמונות STED מפותלות של כתם PKMO (איור משלים 1B,C). שני הערוצים נאספו בשלב פריים אחד. מדידות של לוקליזציה תלוית זמן, בדומה לאלה המפורטות באיור 2 ומוצגות באיור 5, היכן שרלוונטי, והבדלים בארכיטקטורה של cristae ניתן לקבל לאחר טיפול במאמץ או תוספות אחרות.
שיטות אפשריות אחרות לתיוג כפול בתאי STED חיים של מיטוכונדריה שלא דווחו כאן אך דווחו על ידי אחרים כוללות שימוש בחלבונים המתויגים ב- SNAP93, חלבונים המתויגים ב- Halo, ושימוש בצבעים חדירים אחרים לתאים עם מטרות גנריות, כגון mtDNA63. יש לציין כי אסטרטגיית התיוג של תיוג SNAP ו-Halo משפיעה על עוצמת האות הפלואורסצנטי המתקבל ועל תוחלת החיים בעת הדמיה94. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מציג מספר דוגמאות של ניתוחים שניתן ליישם על מיטוכונדריה מקוטעת, ישנם ניתוחים רבים אחרים שחבילות תוכנה יכולות לבצע על תמונות אלה.

מיטוכונדריה הם אברונים אאוקריוטים ממקור אנדוסימביוטי האחראים לוויסות מספר תהליכים תאיים מרכזיים, כולל חילוף חומרים מתווך וייצור ATP, הומאוסטזיס יונים, ביוסינתזה של שומנים ומוות תאי מתוכנת (אפופטוזיס). אברונים אלה מורכבים טופולוגית, ומכילים מערכת ממברנות כפולה שיוצרת תת-תאים מרובים1 (איור 1A). הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית (OMM) מתממשקת עם הציטוזול ויוצרת מגעים ישירים בין אברונים 2,3. הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית (IMM) היא קרום חוסך אנרגיה השומר על שיפועי יונים המאוחסנים בעיקר כפוטנציאל קרום חשמלי (ΔΨm) כדי להניע סינתזת ATP ותהליכים אחרים הדורשים אנרגיה 4,5. ה-IMM מחולק גם לקרום הגבול הפנימי (IBM), אשר מדוכא באופן הדוק ל-OMM, ולמבנים בולטים הנקראים cristae הקשורים על ידי קרום ה-cristae (CM). קרום זה תוחם את תא המטריצה הפנימי ביותר מהמרחב התוך-קריסטלי (ICS) ומהמרחב הבין-קרום (IMS).
למיטוכונדריה יש מורפולוגיה דינמית המבוססת על תהליכים מתמשכים ומאוזנים של ביקוע ואיחוי הנשלטים על ידי מכנואנזימים ממשפחת הדינמינים6. היתוך מאפשר קישוריות מוגברת ויצירת רשתות רשתיות, ואילו הביקוע מוביל לפיצול מיטוכונדריה ומאפשר הסרת מיטוכונדריה פגומה על ידי מיטופגיה7. המורפולוגיה של המיטוכונדריה משתנה לפי סוג הרקמה8 והשלב ההתפתחותי9 ומווסתת כדי לאפשר לתאים להסתגל לגורמים הכוללים צרכים אנרגטיים 10,11 וגורמי סטרס 12. תכונות מורפומטריות סטנדרטיות של מיטוכונדריה, כגון מידת היווצרות הרשת (מקושרת לעומת מקוטעת), היקף, שטח, נפח, אורך (יחס גובה-רוחב), מעוגלות ומידת הסתעפות, ניתנות למדידה ולכימות במיקרוסקופ אופטי סטנדרטי מכיוון שהגדלים של תכונות אלה גדולים מגבול העקיפה של האור (~200 ננומטר)13.
ארכיטקטורת Cristae מגדירה את המבנה הפנימי של המיטוכונדריה (איור 1B). ניתן לסווג באופן רחב את מגוון מורפולוגיות הקריסטות כשטוחות (למלריות או דיסקואידיות) או צינוריות-שלפוחיתיות14. כל ה-cristae מתחברים ב-IBM דרך מבנים צינוריים או דמויי חריצים המכונים צמתים cristae (CJs) שיכולים לשמש למידור ה-IMS מה-ICS וה-IBM מה-CM15. המורפולוגיה של Cristae מווסתת על ידי קומפלקסים חלבוניים מרכזיים של IMM, כולל (1) אתר המגע המיטוכונדריאלי ומערכת ארגון cristae (MICOS) השוכנת ב- CJs ומייצבת מגעי IMM-OMM 16, (2) ניוון אופטי 1 (OPA1) GTPase המווסת שיפוץ cristae17,18,19, ו- (3) F1FO ATP סינתאז היוצר מכלולים אוליגומריים מייצבים בקצות cristae (CTs)20, 21. בנוסף, ה- IMM מועשר בפוספוליפידים שאינם דו-שכבתיים, פוספטידיל-אתנולאמין וקרדיוליפין המייצבים את IMM22 המעוקל מאוד. כריסטות הן גם דינמיות, ומדגימות שינויים מורפולוגיים בתנאים שונים, כגון מצבים מטבוליים שונים 23,24, עם מצעי נשימה שונים 25, תחת רעב ועקה חמצונית 26,27, עם אפופטוזיס28,29, ועם הזדקנות 30. לאחרונה הוכח כי cristae יכול לעבור אירועי שיפוץ גדולים על ציר זמן של שניות, מדגיש את הטבע הדינמי שלהם31. ניתן לכמת מספר מאפיינים של cristae, כולל ממדים של מבנים בתוך cristae בודדים (למשל, רוחב CJ, אורך ורוחב cristae) ופרמטרים המקשרים crista בודדים למבנים אחרים (למשל, מרווח intra-cristae וזווית אירוע cristae ביחס ל- OMM)32. פרמטרים אלה של cristae הניתנים לכימות מראים מתאם ישיר עם פונקציה. לדוגמה, היקף ייצור ה-ATP במיטוכונדריה קשור באופן חיובי לשפע של cristae, מכומת כצפיפות cristae או מספר cristae מנורמל לתכונה אחרת (למשל, cristae לכל אזור OMM)33,34,35. מכיוון שמורפולוגיה של IMM מוגדרת על ידי תכונות ננומטריות, היא כוללת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי, הדורש טכניקות הדמיה המספקות רזולוציה גדולה ממגבלת עקיפת האור. כפי שיתואר להלן, טכניקות אלה כוללות מיקרוסקופ אלקטרונים ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה (ננוסקופיה).
התאים העצביים ותאי הגליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מסתמכים במיוחד על תפקוד המיטוכונדריה. בממוצע, המוח מהווה רק 2% ממשקל הגוף הכולל, אך מנצל 25% מכלל הגלוקוז בגוף ומהווה 20% מצריכת החמצן בגוף, מה שהופך אותו לפגיע לליקויים בחילוף החומרים האנרגטי36. מחלות נוירודגנרטיביות מתקדמות (NDs), כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מחלת הנטינגטון (HD), טרשת נפוצה (MS) ומחלת פרקינסון (PD), הן חלק מהפתולוגיות הנחקרות ביותר עד כה, עם מאמצי מחקר החל מהבנת היסודות המולקולריים של מחלות אלה ועד לחיפוש מניעה והתערבויות טיפוליות פוטנציאליות. NDs קשורים לעקה חמצונית מוגברת שמקורה בחלקה במיני חמצן תגובתי (ROS) הנוצרים על-ידי שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה (ETC)37, כמו גם שינוי בטיפול בסידן מיטוכונדריאלי 38 ומטבוליזם שומנים מיטוכונדריאלי39. שינויים פיזיולוגיים אלה מלווים בפגמים בולטים במורפולוגיה של המיטוכונדריה הקשורים ל-AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 ו-PD 51,52,53. פגמים מבניים ותפקודיים אלה יכולים להיות משולבים על ידי יחסי סיבה ותוצאה מורכבים. לדוגמה, בהתחשב בכך שמורפולוגיית הקריסטה מייצבת אנזימי OXPHOS54, ROS מיטוכונדריאלי לא רק נוצר על ידי ETC, אלא הם גם פועלים לפגוע בתשתית שבה שוכן ה-ETC, ומקדמים מחזור ROS מזין קדימה המשפר את הרגישות לנזק חמצוני. יתר על כן, הוכח כי חוסר ארגון של cristae מעורר תהליכים כגון שחרור DNA מיטוכונדריאלי (mtDNA) ומסלולים דלקתיים הקשורים להפרעות אוטואימוניות, מטבוליות והקשורות לגיל55. לכן, ניתוח המבנה המיטוכונדריאלי הוא המפתח להבנה מלאה של NDs והיסודות המולקולריים שלהם.
שיטות פופולריות לצפייה בקריסטה, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, טומוגרפיית אלקטרונים וטומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryo-ET), וטומוגרפיית רנטגן, במיוחד טומוגרפיית רנטגן קריו-רכה, חשפו ממצאים חשובים ועבודה עם מגוון סוגי דגימות 56,57,58,59,60 . למרות ההתקדמות האחרונה לקראת תצפית טובה יותר של אולטרה-מבנה אברוני, שיטות אלה עדיין מגיעות עם האזהרה של דרישת קיבוע דגימה, ולכן אינן יכולות ללכוד דינמיקה בזמן אמת של cristae ישירות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציית על, במיוחד בצורות של מיקרוסקופ תאורה מובנה (SIM), מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי (PALM), מיקרוסקופ הרחבה (ExM) ומיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED), הפכו לדרכים פופולריות לצפייה במבנים הדורשים רזולוציה מתחת למגבלת העקיפה המגבילה שיטות קלאסיות של מיקרוסקופיה אופטית. כאשר ExM משמש בשילוב עם טכניקה אחרת סופר רזולוציה, התוצאות מרשימות, אבל הדגימה חייבת להיות קבועה ומוכתמת בג'ל61. לשם השוואה, SIM, PALM/STORM ו-STED שימשו בהצלחה עם דגימות חיות, וצבעים חדשים ומבטיחים שבדרך כלל מכתימים את ה-IMM מספקים גישה חדשנית וקלה להדמיה חיה של מיטוכונדריה cristae dynamics 62,63,64,65,66. ההתקדמות האחרונה בצבעים חיים עבור הדמיית STED שיפרה את בהירות הצבע ואת יציבות האור, וצבעים אלה מכוונים ל- IMM ברמה גבוהה יותר של ספציפיות מקודמיהם. פיתוחים אלה מאפשרים איסוף של ניסויים ארוכי טווח של timelapse ו-z-stack עם הדמיה ברזולוציית על, ופותחים את הדלת לניתוח טוב יותר של תאים חיים של מבנה ודינמיקה של מיטוכונדריה.
להלן פרוטוקולים להדמיית תאים חיים של תאי SH-SY5Y לא ממוינים ומובחנים המוכתמים בצבע PKmito Orange (PKMO) באמצעות STED63. קו התאים SH-SY5Y הוא נגזרת תת-משובטת שלוש פעמים מקו תאי ההורים, SK-N-SH, שנוצר מביופסיה של מח עצם של נוירובלסטומה גרורתית 67,68,69,70. קו תאים זה הוא מודל מבחנה נפוץ במחקר ND, במיוחד עם מחלות כגון AD, HD ו- PD, שבהן תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מעורב במידה רבה 10,43,71,72,73. היכולת להתמיין תאי SH-SY5Y לתאים עם פנוטיפ דמוי נוירון באמצעות מניפולציה של אמצעי תרבית הוכחה כמודל מתאים למחקר מדעי המוח מבלי להסתמך על תאי עצב ראשוניים10,74. בפרוטוקול זה, חומצה רטינואית (RA) נוספה למדיום תרבית התאים כדי לגרום להתמיינות של תאי SH-SY5Y. RA הוא נגזרת של ויטמין A והוכח כמסדיר את מחזור התא ומקדם את הביטוי של גורמי שעתוק המווסתים התמיינות עצבית75. פרוטוקול לתרבית והדמיית תאים חיים של תאי עצב שבודדו מההיפוקמפוס של החולדה מסופק גם כן. הודגם כי ההיפוקמפוס מושפע מניוון מיטוכונדריאלי, ויחד עם קליפת המוח, הוא ממלא תפקיד חשוב בהזדקנות וב-ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים חיוניים רבים בתא, כולל ייצור אנרגיה, ויסות הומאוסטזיס Ca2+ , ביוסינתזה של שומנים וייצור מיני חמצן תגובתי (ROS). תהליכים אלה בתיווך מיטוכונדריה לוקחים על עצמם תפקידים מיוחדים בנוירונים, תיאום חילוף החומרים האירובי כדי לענות על דרישות האנרגיה הגבוהות של תאים אלה, ויסות איתות Ca2+ , אספקת שומנים לצמיחה והתחדשות של אקסונים, וכוונון ייצור ROS להתפתחות ותפקוד עצביים. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא גורם מרכזי במחלות נוירודגנרטיביות. המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק. הממברנה הפנימית המורכבת מורפולוגית עם קפלים מבניים הנקראים cristae מכילה מערכות מולקולריות רבות המבצעות את תהליכי החתימה של המיטוכונדריה. המאפיינים האדריכליים של הממברנה הפנימית הם אולטרה-סטרוקטורליים ולכן קטנים מכדי שניתן יהיה לדמיין אותם במיקרוסקופ מסורתי מוגבל עקיפה. לפיכך, רוב התובנות על אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי הגיעו ממיקרוסקופ אלקטרונים על דגימות קבועות. עם זאת, טכנולוגיות מתפתחות במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציית על מספקות כיום רזולוציה של עד עשרות ננומטרים, ומאפשרות הדמיה של תכונות אולטרה-מבניות בתאים חיים. הדמיה ברזולוציית על מציעה אפוא יכולת חסרת תקדים לצלם ישירות פרטים קטנים של מבנה המיטוכונדריה, התפלגות חלבונים ננומטרית ודינמיקה של קריסטה, ומספקת תובנות בסיסיות חדשות הקושרות מיטוכונדריה לבריאות האדם ולמחלות. פרוטוקול זה מציג את השימוש במיקרוסקופ ברזולוציית על של דלדול פליטה מגורה (STED) כדי להמחיש את מבנה העל של המיטוכונדריה של תאי נוירובלסטומה אנושיים חיים ונוירונים ראשוניים של חולדות. הליך זה מאורגן בחמישה חלקים: (1) גדילה והתמיינות של קו תאי SH-SY5Y, (2) בידוד, ציפוי וגדילה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, (3) נהלים להכתמת תאים עבור דימות STED חי, (4) הליכים לניסויי STED של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ STED לעיון, ו-(5) הדרכה לסגמנטציה ועיבוד תמונה באמצעות דוגמאות למדידה וכימות של תכונות מורפולוגיות של הממברנה הפנימית.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

פרוטוקול זה מתאר את תנאי צמיחת התאים עבור תאים בתרבית ותאים ראשוניים, תוך התמקדות בהדמיית STED של תאים חיים ובניתוחים עוקבים של קריסטות מיטוכונדריאליות. הקרנות שנעשו עם ImageJ של מיטוכונדריה מתאי SH-SY5Y לא ממוינים (איור 3A) ותאי SH-SY5Y ממוינים RA (איור 3B) יכולות להיאסף כערימות z עם קונפוקל מסורתי ו-STED, ואז ניתן לפרק את תמונות STED הגולמיות. ניתן גם לבצע הדמיית Timelapse ולאחר מכן לפרק אותה (איור 3C,D). באמצעות שימוש בפרמטרי הדמיה מעט שונים עבור תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה (טבלה 1), תמונות קונפוקליות ותמונות STED גולמיות יכולות להתקבל כערימות z, ותמונות STED גולמיות יכולות להיות מפותלות (איור 4A). הדמיה בהילוך מהיר של מיטוכונדריה מתאי עצב ראשוניים אפשרית גם כן (איור 4B). באופן כללי, תמונות קיטועי הזמן אמורות להיות מסוגלות להציג אירועים דינמיים מיטוכונדריאליים.
כאשר תחזיות STED גולמיות ו- STED z-stack מפותלות מהדגימות המשמשות לסגמנטציה נראות עקביות, מבוצעות מדידות כמותיות. תוסף TWS משתמש בתמונת STED מפותלת כדי לפלח כדי ליצור מסיכת הסתברות, אשר לאחר מכן משמשת ליצירת מסיכה בינארית של cristae כדי לקבל פרמטרים של גודל וצורה (איור 5A). האזורים ממסיכה זו נשמרים במנהל החזר ההשקעה וניתן להחיל אותם על תמונת STED גולמית אם רוצים בכך כדי למדוד הבדלים בעוצמה יחסית. תחזיות STED מפותלות יכולות לשמש גם כדי לקבוע את מחזוריות הקריסטאה ואת צפיפותה באזור נתון (איור 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> איור 1: מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. למיטוכונדריה יש מערכת דו-ממברנית המגדירה תת-תאים שונים (A). Cristae הם קפלים של הקרום הפנימי עם תכונות מוגדרות (B). קיצורים: OMM, קרום מיטוכונדריאלי חיצוני; ICS, חלל אינטרקריסטל; IMS, חלל אינטרממברנה; CM, קרום cristae; IBM, קרום גבול פנימי; IMM, קרום מיטוכונדריאלי פנימי; CT, קצה cristae; CJ, צומת קריסטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> איור 2: סכמה של זרימת עבודה. תאי SH-SY5Y או נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה גדלים על זכוכית כיסוי מצופה PDL. תאי SH-SY5Y גדלים במקביל כדי להישאר בלתי ממוינים או נתונים להתמיינות RA במשך שישה ימים. תאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה גדלו על זכוכית כיסוי מצופה PDL לאחר שבודדו מחלקי ההיפוקמפוס במשך שבעה ימים. ברגע שהיו מוכנים לצילום, התאים הוכתמו ב-PKMO וצולמו ב-STED. לאחר מכן, תמונות STED גולמיות מפותלות, והתמונות המפותלות מעובדות בפיג'י כדי לקבל מדידות גודל וצורה, כגון צפיפות cristae, שטח, היקף, מעגליות ויחס גובה-רוחב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> איור 3: הדמיה של מיטוכונדריה בתאי SH-SY5Y. מוצגות הקרנות של תמונת STED מפותלת (משמאל), STED גולמי (במרכז) ו-Huygens deconvolved STED image z-stack (מימין) של מיטוכונדריה מתאי SH-SY5Y לא ממוינים (A) ו-RA-differentiated (B) עם צביעת PKMO. קיטוע זמן עם מרווחים של 30 שניות ו- 5 איטרציות של תאי SH-SY5Y ממוינים RA מוצג (C) עם אזורים נבחרים (תיבות לבנות) המורחבים על (D) באמצעות תמונות בקנה מידה של אזורים אלה ללא אינטרפולציה. פסי קנה מידה: A,B, 250 ננומטר; C,D, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> איור 4: הדמיה של מיטוכונדריה בתאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה. תמונה קונפוקלית מייצגת (משמאל), STED גולמי (במרכז) והויגנס נטרלה STED מפותל (מימין) מוצגות הקרנות z-stack של מיטוכונדריה מנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה (A). מוצג פרק זמן עם מרווחים של 25 שניות ו-5 חזרות של מיטוכונדריה בתאי עצב אלה (B). פסי קנה מידה: A, 250 ננומטר; B, 1 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> איור 5: עיבוד של תמונות STED מפותלות ב-ImageJ. מוצג שימוש מייצג בתוסף Trainable Weka Segmentation למדידת גודל וצורה של cristae (A). משמאל לימין, מוצגות התמונות הבאות: תמונת STED מפותלת, מפת ההסתברות המבוססת על סגמנטציה מתוסף TWS, המסכה מסף בפיג'י באמצעות מפת ההסתברות כקלט, המסכה עם ה- ROI המתואר, וה- ROI שכבת-על על תמונת STED המפותלת המקורית. ניתן למצוא את מדידות השטח, ההיקף, המעגליות ויחס הגובה-רוחב המתקבלות בהתאם לאובייקטים אלה בטבלה משלימה 1. מוצגת התוויית קו המשתמשת בתמונת STED מפותלת למדידת מרחקי שיא לשיא כקריאה לצפיפות cristae (B). פסי קנה מידה: 0.5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>גודל פיקסל (nm)</td>
			<td>זמן שהייה (μs)</td>
			<td>קו acc.</td>
			<td>עירור 561 ננומטר במהלך רכישת STED (%)</td>
			<td>עוצמת דלדול STED של 775 ננומטר (%)</td>
			<td>גודל צעד (nm)</td>
			<td>חור סיכה (AU)</td>
			<td>מרווחי זמן של קיטועי זמן</td>
			<td>איטראציות של קיטועי זמן</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y ללא הבדל</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differe-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>תאי עצב ראשוניים</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">הערה: גודל הפיקסלים עשוי להשתנות בהתאם לדרישות ההדמיה ולכוונה לנטרל תמונות. דגימה מתאימה נדרשת עבור deconvolution. גודלי פיקסלים לתמונות STED גולמיות ללא דה-קונבולוציה יכולים להגיע עד 30 ננומטר.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: סיכום פרמטרים של רכישת STED. ההגדרות המשמשות לדימות STED דו-ממדי עבור כל סוג תא, SH-SY5Y לא ממוין, SH-SY5Y ממוין RA ונוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, מוצגות. עבור כל הפסקות הזמן, 5 חזרות נלקחו עם מרווחי זמן משתנים בהתבסס על גודל החזר ההשקעה.
איור משלים 1: הדמיה של תאי SH-SY5Y עם תוספת עמילואיד-β (Aβ). מוצגות תמונות קונפוקליות מייצגות (משמאל), STED גולמי (במרכז) ו-STED מפותל (מימין) של תאי SH-SY5Y ממוינים RA עם כתם PKMO (למעלה) ו-Aβ-HiLyte647 (למטה). מוצגות תחזיות z-stack ממוזגות של PKMO STED גולמי (ירוק) עם Aβ STED גולמי (מגנטה) (B) או PKMO STED מפותל (ירוק) עם Aβ STED מפותל (מגנטה) (C). פסי קנה מידה: 0.5 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 1: מדידות גודל וצורה של קריסטה מקוטעת. מדידות הגודל והצורה של שטח (μm2), היקף (μm), מעגליות ויחס גובה-רוחב, המתאימות לעצמים המתוארים באיור 5A ממיטוכונדריה מקוטעת, מוצגות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
טבלה משלימה 2: סיכום פרמטרים של רכישה עם דגימות β עמילואיד. ההגדרות המשמשות להדמיית STED דו-ממדית של PKMO ו- Aβ-HiLyte647 בתאי SH-SY5Y לא ממוינים וממוינים RA מוצגות. ניתן להשתמש בקונפוקל של Aβ-HiLyte647 לבד מכיוון שאין מבנה ספציפי לפתור; תמונות STED של Aβ-HiLyte647 מוצגות כאן עבור גדלי חלקיקים קטנים יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: פרוטוקול טיפול בעמילואיד-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

תוכנית המחקר שלנו מתמקדת בהיבטים מבניים ותפקודיים של מיטוכונדריה, במיוחד כאשר הם קשורים לתפקוד לקוי הקשור להזדקנות. לשם כך, אנו משתמשים במגוון רחב של טכניקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבניות כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של הזדקנות מיטוכונדריאלית ולפתח התערבויות טיפוליות לשימור ושיקום בריאות המיטוכונדריה. תפקוד ומבנה המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק.טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופ אור מתאימות למדידת תכונות מיטוכונדריאליות בקנה מידה גדול כמו מורפולוגיה בסיסית ומבני רשת. ניתוח מבנה אולטרה מיטוכונדריאלי או תכונות הדורשות רזולוציה גבוהה יותר מזו הניתנת על ידי מיקרוסקופ אופטי מסורתי נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים או טומוגרפיה על דגימות קבועות. מיקרוסקופ סופר רזולוציה הוא טכניקת הדמיה מבוססת פלואורסצנטיות המודדת תכונות מעבר לגבול העקיפה.עבור מיטוכונדריה, זה כולל מדידות של התפלגות חלבונים בקנה מידה ננומטרי וארכיטקטורת cristae. פרוטוקול ההדמיה המתואר כאן מאפשר לחוקרים למדוד את המבנה המפורט של הממברנה הפנימית בתאים חיים. הדמיה של תאים חיים מאפשרת לנו לצפות ולנתח כמותית תכונות מורכבות של cristae בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ללא צורך בקיבוע דגימה.זה ייתן לחוקרים תובנות חדשות על השינויים הדינמיים המתרחשים בתכונות אולטרה מבניות והתגובות הטמפורליות שלהם לגורמי לחץ ותרכובות פרמקולוגיות.