Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
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प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की आपूर्ति कनेक्टिकट विश्वविद्यालय (स्टॉर्स, सीटी, यूएसए) में बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग के डॉ जॉर्ज लाइकोट्राफिटिस और शिजू गु द्वारा की गई थी। सेंटर फॉर ओपन रिसर्च रिसोर्सेज एंड इक्विपमेंट में एडवांस्ड लाइट माइक्रोस्कोपी सुविधा में स्थित एब्बेरियर एसटीईडी उपकरण को एनआईएच अनुदान S10OD023618 क्रिस्टोफर ओ'कॉनेल को सम्मानित करने के साथ अधिग्रहित किया गया था। इस शोध को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था R01AG065879 नाथन एन एल्डर को सम्मानित किया गया था।

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

यह प्रोटोकॉल लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग के लिए नए आईएमएम-टारगेटिंग पीकेएमओ डाई के साथ मानव न्यूरोब्लास्टोमा सेल लाइन एसएच-एसवाई 5 वाई और प्राथमिक चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के उपयोग को प्रस्तुत करता है। पीकेएमओ की नवीनता के कारण, वर्तमान में लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए इस डाई का उपयोग करके बहुत कम प्रकाशित किया गया है। एसटीईडी इमेजिंग के लिए इन सेल प्रकारों का उपयोग करना चुनौतियां पैदा करता है, विशेष रूप से क्योंकि न्यूरोनल कोशिकाओं में संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा पीकेएमओ डाई का उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है। विभिन्न कोशिकाएं और सेल लाइनें डाई के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देती हैं, इस प्रकार, डाई एकाग्रता में समायोजन और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना मजबूत संकेत के लिए परिणामों को अनुकूलित करने के लिए इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता हो सकती है। एक सुझाया गया समाधान एकाग्रता को कम करना और धुंधला समय63 को बढ़ाना है; हालांकि, इसके परिणामस्वरूप सेल व्यवहार्यता में वृद्धि के बिना खराब धुंधलापन हो सकता है।
पीकेएमओ के समान, वाणिज्यिक डाई लाइव ऑरेंज माइटो (सामग्री की तालिका) भी कुछ सेल विषाक्तता प्रदर्शित करता है। इस डाई का उपयोग विभिन्न प्रकार की सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए किया गया था, लेकिन आरए-विभेदित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं में उनके अविभाजित समकक्षों (हमारे अप्रकाशित अवलोकनों) के समान मापदंडों के साथ सफलतापूर्वक तुलनीय धुंधलापन प्रदर्शित करने में असमर्थ था। हालांकि, इस जांच और चुने हुए सेल प्रकारों के लिए उत्तरदायी धुंधला प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है। इस डाई के साथ, 1-1.05 से 7-7.05 एनएस के डिटेक्टर गेटिंग समय का उपयोग किया गया था, जिसमें तालिका 1 में अन्य सभी पैरामीटर समान थे। आम तौर पर, 45 मिनट के लिए 200-250 एनएम लाइव ऑरेंज माइटो के साथ कोशिकाओं को धुंधला करने से पीकेएमओ परिणामों के समान परिणाम मिले। कम समय के लिए उच्च सांद्रता धुंधला होना या समान समय या थोड़े लंबे समय तक कम एकाग्रता धुंधला होना अलग-अलग परिणाम दे सकता है और अन्य सेल प्रकारों या विकास स्थितियों के अनुकूल हो सकता है।
इमेजिंग के समय अक्षतंतु और डेंड्राइट अनुमानों की प्रकृति के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रियल वितरण के कारण इमेजिंग प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स अमर कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक कठिनाई यह है कि सीडिंग घनत्व यह निर्धारित करता है कि क्या प्राथमिक संस्कृतियां स्वस्थ रूप से पालन करने और बढ़ने में सक्षम होंगी, और उच्च घनत्व पर, अनुमान डीआईवी 10 से अधिक हो जाते हैं। इसलिए, इन प्राथमिक न्यूरॉन्स से चित्रित माइटोकॉन्ड्रिया संभवतः कोशिका शरीर से आएंगे और अनुमानों से नहीं; हालांकि, कम शुरुआती सेल घनत्व से सफल विकास बाद के विकास समय में बेहतर इमेजिंग परिणाम देता है। एसटीईडी के लिए सबसे अच्छा कंट्रास्ट होने के लिए कम पृष्ठभूमि और आउट-ऑफ-फोकस लाइट सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। सेल आबादी के बारे में चिंताओं को दूर करने के लिए, बी 27-पूरक न्यूरॉन विकास मीडिया में प्राथमिक हिप्पोकैम्पल कोशिकाओं का संवर्धन ग्लियल कोशिकाओं के विकास को रोकता है, और स्रोत की रिपोर्ट है कि <5% कोशिकाएं एस्ट्रोसाइट्स हैं और विकास मीडिया में एनबीएक्टिव 1 पूरक की अनुपस्थिति संस्कृतियों में एस्ट्रोसाइट्स की संख्या <2% 87 तक कम हो जाती है। सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स दोनों के लिए, विकास के लिए उपयोग की जाने वाली पीडीएल कोटिंग छवियों में पृष्ठभूमि धुंध में योगदान देती है। (तालिका 1) में रिपोर्ट की गई सेटिंग्स के साथ पर्याप्त सिग्नल-टू-शोर पूरा किया जाता है और डीकन्वोल्यूशन देखी गई अधिकांश पृष्ठभूमि को हटा देता है।
यहां कवर की गई इमेजिंग के अलावा, इमेजिंग से पहले या दौरान कोशिकाओं में उपचार या तनाव जोड़ना भी संभव है। उदाहरण के लिए, टर्ट-ब्यूटाइल हाइड्रोजन पेरोक्साइड (टीबीएचपी) जोड़ना ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है, और इसके बाद समय के साथ माइटोकॉन्ड्रिया में परिवर्तन की निगरानी करना संभव है। फ्लोरोसेंट टैग के साथ एमिलॉयड-β (ए) के अलावा माइटोकॉन्ड्रिया के साथ-साथ समय के साथ माइटोकॉन्ड्रियल संरचना के संबंध में इस पेप्टाइड के वितरण की निगरानी की अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को एडी में भारी फंसाया गया है और व्यापक रूप से ए विषाक्तता 43,71,72 में भूमिका निभाने के लिए समर्थित है। विशेष रूप से, SH-SY5Y कोशिकाओं की विभेदन स्थिति A3 प्रोटीन अग्रदूत (A3PP) स्थानीयकरण85 को प्रभावित करती है, और A3PP का उपयोग करने वाले प्रयोगों का सावधानीपूर्वक निर्माण किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल को कैसे अनुकूलित किया जा सकता है, इसके एक उदाहरण के रूप में, यह दिखाया गया है कि फ्लोरोसेंट संस्करण ए (1-42) -हाइलाइट 647 को इमेजिंग से 15 मिनट पहले पीकेएमओ-दाग वाली कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है (पूरक चित्रा 1)। इमेजिंग पैरामीटर समान हैं (पूरक तालिका 2), मुख्य अंतर यह है कि संकीर्ण माइटोकॉन्ड्रिया की इमेजिंग करते समय एक छोटे पिनहोल की आवश्यकता होती है। एसटीईडी के साथ इमेजिंग ए-हाइलाइट 647 को कम समग्र उत्तेजना (6% -8%) और एसटीईडी की कमी (10% -12%) लेजर शक्ति और कम संचय (छह) की आवश्यकता होती है। डिटेक्टर गेटिंग को भी 0.1 से 10 एनएस तक बढ़ाया जाता है। यद्यपि ए का एसटीईडी रिज़ॉल्यूशन आवश्यक नहीं है, कच्चे एसटीईडी का समग्र सिग्नल-टू-शोर अनुपात और ए कण आकार कॉन्फोकल छवियों की तुलना में बेहतर था, और बाद में डीकॉन्वोल्यूशन भी किया जा सकता है। एसटीईडी छवियों को एकत्र करना और एके कच्चे एसटीईडी जेड-स्टैक अनुमानों को अलग करना विशेष रूप से उपयोगी प्रतीत होता है जब पीकेएमओ दाग (पूरक चित्रा 1 बी, सी) के कच्चे एसटीईडी या डिकोनवोल्ड एसटीईडी छवियों के साथ विलय किया जाता है। दोनों चैनलों को एक ही फ्रेम चरण में एकत्र किया गया था। समय-निर्भर स्थानीयकरण के माप, चित्र 2 में सूचीबद्ध और चित्रा 5 में दिखाए गए लोगों के समान, जहां लागू होते हैं, और क्रिस्टे आर्किटेक्चर अंतर तनाव उपचार या अन्य परिवर्धन के बाद प्राप्त किए जा सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव सेल एसटीईडी में दोहरी-लेबलिंग के लिए अन्य संभावित तरीकों की रिपोर्ट यहां नहीं की गई है, लेकिन दूसरों द्वारा रिपोर्ट की गई है जिसमें एसएनएपी-टैग किए गए प्रोटीन93, हेलो-टैग ्ड प्रोटीन का उपयोग और सामान्य लक्ष्यों के साथ अन्य सेल-पारगम्य रंगों का उपयोग शामिल है, जैसे कि एमटीडीएनए63। विशेष रूप से, एसएनएपी और हेलो टैगिंग की लेबलिंग रणनीति इमेजिंग94 के दौरान परिणामी प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता और दीर्घायु को प्रभावित करती है। इसके अतिरिक्त, जबकि यह प्रोटोकॉल विश्लेषण के कई उदाहरण प्रस्तुत करता है जिन्हें खंडित माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू किया जा सकता है, ऐसे कई अन्य विश्लेषण हैं जो सॉफ्टवेयर पैकेज इन छवियों पर कर सकते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में कई आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसमें ऊर्जा उत्पादन, सीए2 + होमियोस्टैसिस का विनियमन, लिपिड जैवसंश्लेषण और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन शामिल है। ये माइटोकॉन्ड्रिया-मध्यस्थता प्रक्रियाएं न्यूरॉन्स में विशेष भूमिका निभाती हैं, इन कोशिकाओं की उच्च ऊर्जा मांगों को पूरा करने के लिए एरोबिक चयापचय का समन्वय करती हैं, सीए2 + सिग्नलिंग को संशोधित करती हैं, अक्षतंतु विकास और पुनर्जनन के लिए लिपिड प्रदान करती हैं, और न्यूरोनल विकास और कार्य के लिए आरओएस उत्पादन को ट्यून करती हैं। इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में एक केंद्रीय चालक है। माइटोकॉन्ड्रियल संरचना और कार्य अटूट रूप से जुड़े हुए हैं। क्रिस्टे नामक संरचनात्मक परतों के साथ रूपात्मक रूप से जटिल आंतरिक झिल्ली कई आणविक प्रणालियों को आश्रय देती है जो माइटोकॉन्ड्रियन की हस्ताक्षर प्रक्रियाओं को निष्पादित करती हैं। आंतरिक झिल्ली की वास्तुशिल्प विशेषताएं अल्ट्रास्ट्रक्चरल हैं और इसलिए, पारंपरिक विवर्तन-सीमित हल माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना करने के लिए बहुत छोटी हैं। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर पर अधिकांश अंतर्दृष्टि निश्चित नमूनों पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से आई है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी में उभरती प्रौद्योगिकियां अब दसियों नैनोमीटर तक रिज़ॉल्यूशन प्रदान करती हैं, जिससे लाइव कोशिकाओं में अल्ट्रास्ट्रक्चरल सुविधाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग इसलिए माइटोकॉन्ड्रियल संरचना, नैनोस्केल प्रोटीन वितरण और क्रिस्टे गतिशीलता के ठीक विवरण ों को सीधे चित्रित करने की एक अभूतपूर्व क्षमता प्रदान करता है, जो मौलिक नई अंतर्दृष्टि प्रदान करता है जो माइटोकॉन्ड्रिया को मानव स्वास्थ्य और बीमारी से जोड़ता है। यह प्रोटोकॉल जीवित मानव न्यूरोब्लास्टोमा कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे न्यूरॉन्स के माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के उपयोग को प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया को पांच वर्गों में व्यवस्थित किया जाता है: (1) एसएच-एसवाई 5 वाई सेल लाइन का विकास और भेदभाव, (2) प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का अलगाव, चढ़ाना और विकास, (3) लाइव एसटीईडी इमेजिंग के लिए कोशिकाओं को धुंधला करने की प्रक्रियाएं, (4) संदर्भ के लिए एसटीईडी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाइव सेल एसटीईडी प्रयोगों के लिए प्रक्रियाएं, और (5) आंतरिक झिल्ली की रूपात्मक विशेषताओं को मापने और मापने के लिए उदाहरणों का उपयोग करके विभाजन और छवि प्रसंस्करण के लिए मार्गदर्शन।

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

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Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

यह प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रास्ट्रक्चर विज़ुअलाइज़ेशन और उत्तेजित उत्सर्जन रिक्तीकरण (एसटीईडी) माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विश्लेषण के लिए सुसंस्कृत एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं और प्राथमिक चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के प्रसार, भेदभाव और धुंधलापन के लिए एक वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है।

न्यूरोनल सेल मॉडल में माइटोकॉन्ड्रियल इनर मेम्ब्रेन अल्ट्रास्ट्रक्चर की कल्पना करने के लिए लाइव सेल एसटीईडी इमेजिंग का उपयोग करना

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

हमारा शोध कार्यक्रम माइटोकॉन्ड्रिया के संरचनात्मक और कार्यात्मक पहलुओं पर केंद्रित है, खासकर क्योंकि वे उम्र बढ़ने से संबंधित शिथिलता से संबंधित हैं। इसके लिए, हम माइटोकॉन्ड्रियल उम्र बढ़ने के बुनियादी तंत्र का पता लगाने और माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य को संरक्षित और बहाल करने के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप विकसित करने के लिए बायोफिज़िकल, जैव रासायनिक और संरचनात्मक तकनीकों की एक विस्तृत सरणी का उपयोग करते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और संरचना अटूट रूप से संबंधित हैं।मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक बुनियादी आकृति विज्ञान और नेटवर्क संरचनाओं जैसे बड़े पैमाने पर माइटोकॉन्ड्रियल सुविधाओं को मापने के लिए उपयुक्त हैं। माइटोकॉन्ड्रियल अल्ट्रा संरचना या सुविधाओं का विश्लेषण करना जिन्हें पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की जाने वाली तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, आमतौर पर निश्चित नमूनों पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या टोमोग्राफी का उपयोग करके किया जाता है। सुपर रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी एक प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग तकनीक है जो विवर्तन सीमा से परे सुविधाओं को मापती है।माइटोकॉन्ड्रिया के लिए, इसमें नैनो स्केल प्रोटीन वितरण और क्रिस्टे आर्किटेक्चर के माप शामिल हैं। यहां वर्णित स्टीड इमेजिंग प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को जीवित कोशिकाओं में आंतरिक झिल्ली की विस्तृत संरचना को मापने की अनुमति देता है। लाइव सेल इमेजिंग हमें नमूना निर्धारण की आवश्यकता के बिना शारीरिक रूप से प्रासंगिक परिस्थितियों में क्रिस्टे की जटिल विशेषताओं का निरीक्षण और मात्रात्मक विश्लेषण करने की अनुमति देता है।यह शोधकर्ताओं को अल्ट्रा स्ट्रक्चरल विशेषताओं में होने वाले गतिशील परिवर्तनों और तनाव और औषधीय यौगिकों के लिए उनकी अस्थायी प्रतिक्रियाओं में नई अंतर्दृष्टि देगा।