Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
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I neuroni primari dell'ippocampo di ratto sono stati forniti dal Dr. George Lykotrafitis e Shiju Gu del Dipartimento di Ingegneria Biomedica dell'Università del Connecticut (Storrs, CT, USA). Lo strumento Abberior STED ospitato nell'Advanced Light Microscopy Facility del Center for Open Research Resources and Equipment è stato acquisito con la sovvenzione NIH S10OD023618 assegnata a Christopher O'Connell. Questa ricerca è stata finanziata dalla sovvenzione NIH R01AG065879 assegnata a Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta l'uso della linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y e dei neuroni primari dell'ippocampo di ratto con il nuovo colorante PKMO mirato all'IMM per l'imaging di cellule STED vive. A causa della novità del PKMO, attualmente è stato pubblicato poco sull'uso di questo colorante per l'imaging di STED vive. L'uso di questi tipi di cellule per l'imaging delle malattie sessualmente trasmissibili pone delle sfide, in particolare perché le cellule neuronali hanno mitocondri più stretti. Una limitazione di questo protocollo è il colorante PKMO utilizzato, in quanto può essere tossico per le cellule. Diverse cellule e linee cellulari rispondono in modo diverso al colorante, quindi possono essere necessari aggiustamenti della concentrazione del colorante e del tempo di incubazione per ottimizzare i risultati per un segnale forte senza danneggiare le cellule. Una soluzione suggerita è quella di abbassare la concentrazione e aumentare il tempo di colorazione63; Tuttavia, ciò può comportare una colorazione più scadente senza aumentare la vitalità cellulare.
Analogamente al PKMO, anche il colorante commerciale Live Orange mito (Table of Materials) presenta una certa tossicità cellulare. Questo colorante è stato utilizzato per una varietà di cellule in coltura, ma non è stato in grado di mostrare una colorazione comparabile nelle cellule SH-SY5Y differenziate con AR con successo con gli stessi parametri delle loro controparti indifferenziate (nostre osservazioni non pubblicate). Tuttavia, i protocolli di colorazione amabili possono essere ottimizzati per questa sonda e per i tipi di cellule scelti. Con questo colorante, sono stati utilizzati tempi di gating del rivelatore da 1-1,05 a 7-7,05 ns, mentre tutti gli altri parametri nella Tabella 1 sono rimasti invariati. Generalmente, la colorazione delle cellule con 200-250 nM di Live Orange mito per 45 minuti ha prodotto risultati comparabili a quelli mostrati dai risultati di PKMO. La colorazione a concentrazione più elevata per meno tempo o la colorazione a concentrazione più bassa per lo stesso periodo di tempo o leggermente più a lungo possono produrre risultati diversi e possono essere favorevoli ad altri tipi di cellule o condizioni di crescita.
L'imaging dei neuroni primari dell'ippocampo di ratto differisce dalle cellule immortalizzate a causa della natura delle proiezioni dell'assone e del dendrite, nonché della distribuzione mitocondriale al momento dell'imaging. Una difficoltà in questa parte del protocollo è che la densità di semina determina se le colture primarie saranno in grado di aderire e crescere in modo sano e, a densità più elevate, le proiezioni tendono a crescere eccessivamente entro DIV 10. Pertanto, i mitocondri visualizzati da questi neuroni primari proverranno probabilmente dal corpo cellulare e non dalle proiezioni; Tuttavia, una crescita di successo da una densità cellulare iniziale inferiore produce migliori risultati di imaging in tempi di crescita successivi. La chiave è garantire uno sfondo basso e una luce sfocata per avere il miglior contrasto per STED. Per affrontare le preoccupazioni relative alla popolazione cellulare, la coltura di cellule ippocampali primarie in terreni di crescita neuronali integrati con B27 impedisce la crescita delle cellule gliali e la fonte riferisce che il <5% delle cellule sono astrociti e l'assenza di supplemento di NbActiv1 nei mezzi di crescita riduce il numero di astrociti nelle colture al <2%87. Sia per le cellule SH-SY5Y in coltura che per i neuroni primari dell'ippocampo di ratto, il rivestimento PDL utilizzato per la crescita contribuisce alla foschia di fondo nelle immagini. Con le impostazioni riportate nella Tabella 1 si ottiene un rapporto segnale/rumore sufficiente e la deconvoluzione rimuove la maggior parte dello sfondo osservato.
Oltre all'imaging trattato qui, è anche possibile aggiungere trattamenti o stress alle cellule prima o durante l'imaging. Ad esempio, l'aggiunta di perossido di idrogeno terz-butile (tBHP) induce stress ossidativo ed è possibile monitorare i cambiamenti nei mitocondri nel tempo dopo l'aggiunta. L'aggiunta di β amiloide (Aβ) con un tag fluorescente consente di monitorare la distribuzione di questo peptide in relazione ai mitocondri e la struttura mitocondriale nel tempo. La salute mitocondriale è stata fortemente implicata nell'AD ed è ampiamente supportata per svolgere un ruolo nella tossicità dell'Aβ 43,71,72. In particolare, lo stato di differenziazione delle cellule SH-SY5Y influenza la localizzazione del precursore della proteina Aβ (AβPP)85 e gli esperimenti che utilizzano AβPP devono essere costruiti con attenzione.
Come esempio di come questo protocollo possa essere adattato, è stato dimostrato che la variante fluorescente Aβ(1-42)-HiLyte 647 può essere aggiunta alle cellule colorate con PKMO 15 minuti prima dell'imaging (Figura 1 supplementare). I parametri di imaging sono simili (Tabella supplementare 2), con la differenza principale che è necessario un foro stenopeico più piccolo quando si visualizzano mitocondri più stretti. L'imaging di Aβ-HiLyte647 con STED richiede una minore potenza laser di eccitazione complessiva (6%-8%) e deplezione di STED (10%-12%) e meno accumuli (sei). Anche il gating del rivelatore è esteso da 0,1 a 10 ns. Sebbene la risoluzione STED di Aβ non sia necessaria, il rapporto segnale-rumore complessivo e la dimensione delle particelle Aβ di STED grezzo erano migliori di quelli delle immagini confocali, e può anche essere eseguita la successiva deconvoluzione. La raccolta di immagini STED e la deconvoluzione delle proiezioni z-stack STED grezze di Aβ sembrano particolarmente utili quando si fondono con immagini STED grezze o STED deconvolse della colorazione PKMO (Figura supplementare 1B,C). Entrambi i canali sono stati raccolti in un unico frame step. Misure di localizzazione dipendente dal tempo, simili a quelle elencate nella Figura 2 e mostrate nella Figura 5, ove applicabile, e le differenze nell'architettura delle cristae possono essere ottenute dopo il trattamento delle sollecitazioni o altre aggiunte.
Altri possibili metodi per la doppia marcatura in cellule vive STED di mitocondri non riportati qui, ma che sono stati riportati da altri, includono l'uso di proteinemarcate con SNAP 93, proteine con alogeno e l'uso di altri coloranti permeabili alle cellule con bersagli generici, come il mtDNA63. In particolare, la strategia di etichettatura di SNAP e Halo influenza l'intensità e la longevità del segnale di fluorescenza risultanti durante l'imaging94. Inoltre, mentre questo protocollo presenta diversi esempi di analisi che possono essere applicate ai mitocondri segmentati, ci sono molte altre analisi che i pacchetti software possono eseguire su queste immagini.

I mitocondri sono organelli eucariotici di origine endosimbiotica responsabili della regolazione di diversi processi cellulari chiave, tra cui il metabolismo intermedio e la produzione di ATP, l'omeostasi ionica, la biosintesi lipidica e la morte cellulare programmata (apoptosi). Questi organelli sono topologicamente complessi, contengono un sistema a doppia membrana che stabilisce più sottocompartimenti1 (Figura 1A). La membrana mitocondriale esterna (OMM) si interfaccia con il citosol e stabilisce contatti diretti tra gli organelli 2,3. La membrana mitocondriale interna (IMM) è una membrana a risparmio energetico che mantiene i gradienti ionici immagazzinati principalmente come potenziale elettrico di membrana (ΔΨm) per guidare la sintesi di ATP e altri processi che richiedono energia 4,5. L'IMM è ulteriormente suddiviso nella membrana limite interna (IBM), che è strettamente appressata all'OMM, e strutture sporgenti chiamate cristae che sono legate dalla membrana cristae (CM). Questa membrana delinea il compartimento più interno della matrice dallo spazio intracristallino (ICS) e dallo spazio intermembrana (IMS).
I mitocondri hanno una morfologia dinamica basata su processi continui ed equilibrati di fissione e fusione che sono governati da meccanoenzimi della superfamiglia delle dinamine6. La fusione consente una maggiore connettività e formazione di reti reticolari, mentre la fissione porta alla frammentazione mitocondriale e consente la rimozione dei mitocondri danneggiati dalla mitofagia7. La morfologia mitocondriale varia in base al tipo di tessuto8 e allo stadio di sviluppo9 ed è regolata per consentire alle cellule di adattarsi a fattori quali i bisogni energetici 10,11 e i fattori di stress 12. Le caratteristiche morfometriche standard dei mitocondri, come l'estensione della formazione della rete (interconnessa vs. frammentata), il perimetro, l'area, il volume, la lunghezza (rapporto d'aspetto), la rotondità e il grado di ramificazione, possono essere misurate e quantificate dalla microscopia ottica standard perché le dimensioni di queste caratteristiche sono maggiori del limite di diffrazione della luce (~200 nm)13.
L'architettura di Cristae definisce la struttura interna dei mitocondri (Figura 1B). La diversità delle morfologie delle cristae può essere ampiamente classificata come piatta (lamellare o discoidale) o tubolare-vescicolare14. Tutte le cristae si attaccano all'IBM attraverso strutture tubolari o a fessura chiamate giunzioni cristae (CJ) che possono servire a compartimentare l'IMS dall'ICS e l'IBM dal CM15. La morfologia di Cristae è regolata da complessi proteici chiave dell'IMM, tra cui (1) il sito di contatto mitocondriale e il sistema organizzativo delle cristae (MICOS) che risiede a CJs e stabilizza i contatti IMM-OMM 16, (2) l'atrofia ottica 1 (OPA1) GTPasi che regola il rimodellamento delle cristae17,18,19 e (3) F1FO ATP sintasi che forma assemblaggi oligomerici stabilizzanti alle punte delle cristae (CT)20, Ore 21. Inoltre, l'IMM è arricchito con fosfolipidi non a doppio strato fosfatidiletanolammina e cardiolipina che stabilizzano l'IMM22 altamente curvo. I cristae sono anche dinamici, dimostrando cambiamenti morfologici in varie condizioni, come diversi stati metabolici 23,24, con diversi substrati respiratori 25, sotto fame e stress ossidativo 26,27, con apoptosi 28,29 e con invecchiamento 30. Recentemente è stato dimostrato che le cristae potrebbero subire importanti eventi di rimodellamento su una scala temporale di pochi secondi, sottolineando la loro natura dinamica31. Possono essere quantificate diverse caratteristiche delle cristae, tra cui le dimensioni delle strutture all'interno delle singole cristae (ad esempio, larghezza CJ, lunghezza e larghezza delle cristae) e parametri che mettono in relazione le singole crista con altre strutture (ad esempio, la spaziatura intra-cristae e l'angolo incidente delle cristae rispetto all'OMM)32. Questi parametri quantificabili mostrano una correlazione diretta con la funzione. Ad esempio, l'entità della produzione di ATP mitocondriale è positivamente correlata all'abbondanza di cristae, quantificata come densità di cristae o numero di cristae normalizzato a un'altra caratteristica (ad esempio, cristae per area OMM)33,34,35. Poiché la morfologia dell'IMM è definita da caratteristiche su scala nanometrica, comprende l'ultrastruttura mitocondriale, che richiede tecniche di imaging che forniscono una risoluzione superiore al limite di diffrazione della luce. Come descritto di seguito, tali tecniche includono la microscopia elettronica e la microscopia a super-risoluzione (nanoscopia).
Le cellule neurali e gliali del sistema nervoso centrale (SNC) dipendono in particolare dalla funzione mitocondriale. In media, il cervello costituisce solo il 2% del peso corporeo totale, ma utilizza il 25% del glucosio corporeo totale e rappresenta il 20% del consumo di ossigeno corporeo, rendendolo vulnerabile a disturbi del metabolismo energetico36. Le malattie neurodegenerative progressive (ND), tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la malattia di Huntington (HD), la sclerosi multipla (SM) e il morbo di Parkinson (PD), sono alcune delle patologie più studiate fino ad oggi, con sforzi di ricerca che vanno dalla comprensione delle basi molecolari di queste malattie alla ricerca di potenziali prevenzione e interventi terapeutici. I ND sono associati a un aumento dello stress ossidativo originato in parte dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate dalla catena di trasporto degli elettroni mitocondriale (ETC)37, nonché da un'alterata gestione del calcio mitocondriale 38 e dal metabolismo lipidico mitocondriale39. Queste alterazioni fisiologiche sono accompagnate da difetti noti nella morfologia mitocondriale che sono associati a AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS 50 e PD 51,52,53. Questi difetti strutturali e funzionali possono essere accoppiati da complesse relazioni di causa-effetto. Ad esempio, dato che la morfologia delle cristae stabilizza gli enzimi OXPHOS54, i ROS mitocondriali non solo sono generati dall'ETC, ma agiscono anche per danneggiare l'infrastruttura in cui risiede l'ETC, promuovendo un ciclo di ROS feed-forward che aumenta la suscettibilità al danno ossidativo. Inoltre, è stato dimostrato che la disorganizzazione delle cristae innesca processi come il rilascio di DNA mitocondriale (mtDNA) e le vie infiammatorie collegate a disturbi autoimmuni, metabolici e legati all'età55. Pertanto, l'analisi della struttura mitocondriale è la chiave per una piena comprensione delle ND e delle loro basi molecolari.
I metodi più diffusi di visualizzazione delle cristae, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, la tomografia elettronica e la tomografia crioelettronica (cryo-ET) e la tomografia a raggi X, in particolare la tomografia a raggi X crio-molli, hanno rivelato importanti risultati e funzionano con una varietà di tipi di campioni 56,57,58,59,60 . Nonostante i recenti progressi verso una migliore osservazione dell'ultrastruttura organellare, questi metodi hanno ancora l'avvertenza di richiedere la fissazione del campione e, quindi, non possono catturare direttamente le dinamiche in tempo reale delle cristae. La microscopia a fluorescenza a super-risoluzione, in particolare nelle forme di microscopia a illuminazione strutturata (SIM), microscopia a ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM), microscopia ad espansione (ExM) e microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), sono diventati modi popolari di visualizzare strutture che richiedono una risoluzione inferiore al limite di diffrazione che vincola i metodi classici di microscopia ottica. Quando ExM viene utilizzato in combinazione con un'altra tecnica di super-risoluzione, i risultati sono impressionanti, ma il campione deve essere fissato e colorato in un gel61. In confronto, SIM, PALM/STORM e STED sono stati tutti utilizzati con successo con campioni vivi e nuovi e promettenti coloranti che generalmente colorano l'IMM forniscono un approccio nuovo e semplice per l'imaging dal vivo delle dinamiche 62,63,64,65,66 dei mitocondri. I recenti progressi nei coloranti vivi per l'imaging STED hanno migliorato la luminosità e la fotostabilità del colorante e questi coloranti mirano all'IMM con un grado di specificità più elevato rispetto ai loro predecessori. Questi sviluppi consentono la raccolta di esperimenti a lungo termine di timelapse e z-stack con imaging a super-risoluzione, aprendo la porta a una migliore analisi su cellule vive dell'ultrastruttura e della dinamica mitocondriale.
In questo documento, vengono forniti protocolli per l'imaging di cellule vive di cellule SH-SY5Y indifferenziate e differenziate colorate con il colorante PKmito Orange (PKMO) utilizzando STED63. La linea cellulare SH-SY5Y è un derivato tre volte subclonato della linea cellulare parentale, SK-N-SH, generata da una biopsia del midollo osseo del neuroblastoma metastatico67,68,69,70. Questa linea cellulare è un modello in vitro comunemente usato nella ricerca sulla ND, in particolare con malattie come AD, HD e PD, in cui la disfunzione mitocondriale è fortemente implicata 10,43,71,72,73. La capacità di differenziare le cellule SH-SY5Y in cellule con un fenotipo simile a quello dei neuroni attraverso la manipolazione dei terreni di coltura si è dimostrata un modello adatto per la ricerca neuroscientifica senza fare affidamento sulle cellule neuronali primarie10,74. In questo protocollo, l'acido retinoico (RA) è stato aggiunto al terreno di coltura cellulare per indurre la differenziazione delle cellule SH-SY5Y. L'artrite reumatoide è un derivato della vitamina A ed è stato dimostrato che regola il ciclo cellulare e promuove l'espressione dei fattori di trascrizione che regolano la differenziazione neuronale75. Viene inoltre fornito un protocollo per la coltura e l'imaging di cellule vive di neuroni isolati dall'ippocampo di ratto. È stato dimostrato che l'ippocampo è influenzato dalla degenerazione mitocondriale e, insieme alla corteccia, svolge un ruolo importante nell'invecchiamento e nella ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

I mitocondri svolgono molti ruoli essenziali nella cellula, tra cui la produzione di energia, la regolazione dell'omeostasi di Ca2+ , la biosintesi dei lipidi e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questi processi mediati dai mitocondri assumono ruoli specializzati nei neuroni, coordinando il metabolismo aerobico per soddisfare le elevate richieste energetiche di queste cellule, modulando la segnalazione di Ca2+ , fornendo lipidi per la crescita e la rigenerazione degli assoni e regolando la produzione di ROS per lo sviluppo e la funzione neuronale. La disfunzione mitocondriale è quindi un fattore centrale nelle malattie neurodegenerative. La struttura e la funzione mitocondriale sono indissolubilmente legate. La membrana interna morfologicamente complessa con pieghe strutturali chiamate cristae ospita molti sistemi molecolari che eseguono i processi di firma del mitocondrio. Le caratteristiche architettoniche della membrana interna sono ultrastrutturali e quindi troppo piccole per essere visualizzate dalla microscopia tradizionale a risoluzione limitata alla diffrazione. Pertanto, la maggior parte delle intuizioni sull'ultrastruttura mitocondriale sono venute dalla microscopia elettronica su campioni fissi. Tuttavia, le tecnologie emergenti nella microscopia a fluorescenza a super-risoluzione ora forniscono una risoluzione fino a decine di nanometri, consentendo la visualizzazione delle caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule vive. L'imaging a super-risoluzione offre quindi una capacità senza precedenti di visualizzare direttamente i dettagli fini della struttura mitocondriale, delle distribuzioni proteiche su scala nanometrica e delle dinamiche delle cristae, fornendo nuove intuizioni fondamentali che collegano i mitocondri alla salute e alle malattie umane. Questo protocollo presenta l'uso della microscopia a super-risoluzione a deplezione di emissione stimolata (STED) per visualizzare l'ultrastruttura mitocondriale di cellule vive di neuroblastoma umano e neuroni primari di ratto. Questa procedura è organizzata in cinque sezioni: (1) crescita e differenziazione della linea cellulare SH-SY5Y, (2) isolamento, placcatura e crescita dei neuroni primari dell'ippocampo di ratto, (3) procedure per la colorazione delle cellule per l'imaging di STED vive, (4) procedure per esperimenti STED su cellule vive utilizzando un microscopio STED come riferimento e (5) guida per la segmentazione e l'elaborazione delle immagini utilizzando esempi per misurare e quantificare le caratteristiche morfologiche della membrana interna.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Questo protocollo descrive le condizioni di crescita cellulare per cellule in coltura e primarie con particolare attenzione all'imaging di cellule STED vive e alle successive analisi delle cristae mitocondriali. Le proiezioni effettuate con ImageJ dei mitocondri di cellule SH-SY5Y indifferenziate (Figura 3A) e SH-SY5Y differenziate con RA (Figura 3B) possono essere raccolte come z-stack con confocali e STED tradizionali e le immagini STED grezze possono quindi essere deconvolute. È anche possibile eseguire l'imaging timelapse e successivamente deconvolgerlo (Figura 3C,D). Utilizzando parametri di imaging leggermente diversi per i neuroni primari dell'ippocampo di ratto (Tabella 1), le immagini STED confocali e grezze possono essere acquisite come z-stack e le immagini STED grezze possono essere deconvolse (Figura 4A). È anche possibile l'imaging timelapse dei mitocondri dai neuroni primari (Figura 4B). In generale, le immagini time-lapse dovrebbero essere in grado di mostrare eventi dinamici mitocondriali.
Quando le proiezioni dello z-stack STED grezzo e STED deconvolse dei campioni utilizzati per la segmentazione appaiono coerenti, vengono eseguite misurazioni quantitative. Il plug-in TWS utilizza l'immagine STED deconvoluta per segmentare per creare una maschera di probabilità, che viene quindi utilizzata per creare una maschera binaria delle cristae per ottenere i parametri di dimensione e forma (Figura 5A). Le regioni di questa maschera vengono salvate in Gestione ROI e, se lo si desidera, possono essere applicate all'immagine STED grezza per misurare le differenze di intensità relativa. Le proiezioni STED deconvolse possono essere utilizzate anche per determinare la periodicità e la densità delle cristae in una data area (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figura 1: Morfologia mitocondriale. I mitocondri hanno un sistema a due membrane che definisce diversi sottocompartimenti (A). Le criste sono pieghe della membrana interna con caratteristiche definite (B). Abbreviazioni: OMM, membrana mitocondriale esterna; ICS, spazio intracristale; IMS, spazio intermembrana; CM, membrana cristae; IBM, membrana perimetrale interna; IMM, membrana mitocondriale interna; CT, punta cristae; CJ, giunzione cristae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Figura 2: Schema del flusso di lavoro. Le cellule SH-SY5Y o i neuroni primari dell'ippocampo di ratto vengono coltivati su un vetro di copertura rivestito in PDL. Le cellule SH-SY5Y vengono coltivate in parallelo per rimanere indifferenziate o sottoposte a differenziamento dell'artrite reumatoide nel corso di sei giorni. I neuroni primari dell'ippocampo di ratto sono stati coltivati su un vetro di copertura rivestito di PDL dopo essere stati isolati da sezioni ippocampali per sette giorni. Una volta pronte per essere sottoposte a imaging, le cellule sono state colorate con PKMO e sottoposte a imaging con STED. Le immagini STED grezze vengono quindi deconvolute e le immagini deconvolute vengono elaborate in FIJI per ottenere misure di dimensioni e forma, come la densità delle cristae, l'area, il perimetro, la circolarità e le proporzioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figura 3: Imaging dei mitocondri nelle cellule SH-SY5Y. Sono mostrate proiezioni rappresentative confocali (a sinistra), STED grezze (al centro) e immagini STED deconvolse di Huygens (a destra) di mitocondri di cellule SH-SY5Y non differenziate (A) e RA-differenziate (B) con colorazione PKMO. Viene mostrato un timelapse con intervalli di 30 secondi e 5 iterazioni di cellule SH-SY5Y differenziate con AR (C) con le regioni selezionate (caselle bianche) espanse (D) utilizzando immagini in scala di quelle regioni senza interpolazione. Barre della scala: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figura 4: Imaging dei mitocondri nei neuroni primari dell'ippocampo di ratto. Vengono mostrate le proiezioni rappresentative confocali (a sinistra), STED grezze (al centro) e STED deconvolse di Huygens (a destra) dei mitocondri dei neuroni ippocampali primari del ratto (A). Viene mostrato un timelapse con intervalli di 25 s e 5 iterazioni di mitocondri in questi neuroni (B). Barre della scala: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figura 5: Elaborazione di immagini STED deconvolse in ImageJ. Viene mostrato l'uso rappresentativo del plug-in Trainable Weka Segmentation per misurare le dimensioni e la forma delle cristae (A). Da sinistra a destra, vengono mostrate le seguenti immagini: l'immagine STED deconvoluta, la mappa di probabilità basata sulla segmentazione dal plug-in TWS, la maschera di soglia in FIJI utilizzando la mappa di probabilità come input, la maschera con le ROI delineate e le ROI sovrapposte all'immagine STED deconvoluta originale. Le misurazioni risultanti di area, perimetro, circolarità e rapporto d'aspetto corrispondenti a questi oggetti sono riportate nella Tabella supplementare 1. Viene mostrato un grafico a linee che utilizza l'immagine STED deconvoluta per misurare le distanze picco-picco come lettura della densità delle cristae (B). Barre della scala: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Dimensione dei pixel (nm)</td>
			<td>Tempo di permanenza (μs)</td>
			<td>Linea acc.</td>
			<td>Eccitazione a 561 nm durante l'acquisizione STED (%)</td>
			<td>775 nm Potere di svuotamento STED (%)</td>
			<td>Dimensione del passo (nm)</td>
			<td>Foro stenopeico (AU)</td>
			<td>Intervallo timelapse (s)</td>
			<td>Iterazioni timelapse</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y indifferenziato</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differenziato SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Neuroni primari</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">NOTA: la dimensione dei pixel può variare in base ai requisiti di imaging e all'intenzione di deconvolgere le immagini. Per la deconvoluzione è necessario un campionamento adeguato. Le dimensioni dei pixel per le immagini STED grezze senza deconvoluzione possono arrivare fino a 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Riepilogo dei parametri di acquisizione STED. Vengono visualizzate le impostazioni utilizzate per l'imaging STED 2D per ciascun tipo di cellula, SH-SY5Y indifferenziato, SH-SY5Y differenziato con AR e neuroni ippocampali primari di ratto. Per tutti i time-lapse, sono state effettuate 5 iterazioni con intervalli variabili in base alle dimensioni del ROI.
Figura 1 supplementare: Imaging di cellule SH-SY5Y con aggiunta di β amiloide (Aβ). Sono mostrate immagini rappresentative confocali (a sinistra), STED grezze (al centro) e STED deconvolse (a destra) di cellule SH-SY5Y differenziate con AR con colorazione PKMO (in alto) e Aβ-HiLyte647 (in basso) (A). Vengono mostrate le proiezioni z-stack unite di STED PKMO grezzo (verde) con STED Aβ grezzo (magenta) (B) o PKMO STED deconvolato (verde) con STED Aβ deconvolato (magenta) (C). Barre graduate: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Misure delle dimensioni e della forma delle cristae segmentate. Vengono mostrate le misure di dimensioni e forma dell'area (μm2), del perimetro (μm), della circolarità e delle proporzioni, corrispondenti agli oggetti delineati nella Figura 5A dai mitocondri segmentati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
Tabella supplementare 2: Riepilogo dei parametri di acquisizione con campioni β amiloide. Vengono visualizzate le impostazioni utilizzate per l'imaging STED 2D di PKMO e Aβ-HiLyte647 in cellule SH-SY5Y indifferenziate e differenziate con AR. Il confocale di Aβ-HiLyte647 può essere utilizzato da solo in quanto non esiste una struttura specifica da risolvere; Le immagini STED di Aβ-HiLyte647 sono mostrate qui per le dimensioni delle particelle più piccole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 1: Protocollo di trattamento β amiloide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

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Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro per la propagazione, la differenziazione e la colorazione di cellule SH-SY5Y in coltura e neuroni ippocampali primari di ratto per la visualizzazione e l'analisi dell'ultrastruttura mitocondriale utilizzando la microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED).

Utilizzo dell'imaging STED su cellule vive per visualizzare l'ultrastruttura della membrana interna mitocondriale in modelli di cellule neuronali

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Il nostro programma di ricerca si concentra sugli aspetti strutturali e funzionali dei mitocondri, in particolare in relazione alle disfunzioni legate all'invecchiamento. A tal fine, utilizziamo una vasta gamma di tecniche biofisiche, biochimiche e strutturali per esplorare i meccanismi di base dell'invecchiamento mitocondriale e per sviluppare interventi terapeutici per preservare e ripristinare la salute mitocondriale. La funzione e la struttura mitocondriale sono indissolubilmente correlate.Le tecniche standard di microscopia ottica sono adatte per misurare le caratteristiche mitocondriali su larga scala come la morfologia di base e le strutture di rete. L'analisi dell'ultrastruttura mitocondriale o delle caratteristiche che richiedono una risoluzione più elevata di quella offerta dalla microscopia ottica tradizionale viene in genere eseguita utilizzando la microscopia elettronica o la tomografia su campioni fissi. La microscopia a super risoluzione è una tecnica di imaging basata sulla fluorescenza che misura le caratteristiche oltre il limite di diffrazione.Per i mitocondri, questo include misurazioni della distribuzione delle proteine su scala nanometrica e dell'architettura delle cristae. Il protocollo di imaging stead qui descritto consente ai ricercatori di misurare la struttura dettagliata della membrana interna nelle cellule viventi. L'imaging di cellule vive ci consente di osservare e analizzare quantitativamente le caratteristiche complesse delle cristae in condizioni fisiologicamente rilevanti senza la necessità di fissare il campione.Ciò fornirà ai ricercatori nuove informazioni sui cambiamenti dinamici che si verificano nelle caratteristiche ultra strutturali e sulle loro risposte temporali ai fattori di stress e ai composti farmacologici.