Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

初代ラット海馬ニューロンは、コネチカット大学(米国コネチカット州ストーラーズ)の生物医学工学科のGeorge Lykotrafitis博士とShiju Gu博士によって提供されました。Center for Open Research Resources and EquipmentのAdvanced Light Microscopy Facility(先端光学顕微鏡施設)に収容されているAbberior STED装置は、NIHの助成金を得て取得S10OD023618 Christopher O'Connell氏に授与されました。この研究は、NIHの助成金によって資金提供されR01AG065879 Nathan N. Alderに授与されました。

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

著者は何も開示していません。

このプロトコルは生きているセルSTEDイメージ投射のための新しいIMM目標とするPKMOの染料が付いている人間のneuroblastomaのセルラインSH-SY5Yおよび第一次ラットの海馬ニューロンの使用を示す。PKMOの新規性により、この色素をライブSTEDイメージングに使用した論文は、現在ほとんど発表されていません。これらの細胞タイプをSTEDイメージングに使用すると、特に神経細胞のミトコンドリアが狭いため、課題が生じます。このプロトコルの1つの限定は細胞に有毒である場合もあるので、使用されるPKMOの染料である。細胞や細胞株が異なれば、色素に対する反応も異なるため、細胞を傷つけることなく強いシグナルが得られるように結果を最適化するために、色素濃度とインキュベーション時間を調整する必要がある場合があります。推奨される解決策は、濃度を下げ、染色時間を長くすることです63;しかし、これにより、細胞生存率を高めることなく染色が悪くなる可能性があります。
PKMOと同様に、市販の色素であるLive Orange mito(材料表)も細胞毒性を示します。この色素は様々な培養細胞に使用されましたが、RA分化したSH-SY5Y細胞では、未分化細胞と同じパラメータで同等の染色を示すことができませんでした(未発表の観察結果)。ただし、適切な染色プロトコルは、このプローブおよび選択した細胞タイプに最適化できます。この色素では、1〜1.05〜7.05nsの検出器ゲーティング時間を使用し、 表1 の他のすべてのパラメータは同じままでした。一般に、200-250 nM Live Orange mitoで細胞を45分間染色すると、PKMOの結果と同程度の結果が得られました。より短い時間で高濃度の染色を行ったり、同じ時間またはわずかに長く低濃度の染色を行ったりすると、異なる結果が得られる可能性があり、他の細胞タイプや増殖条件に有利である可能性があります。
ラットの初代海馬ニューロンのイメージングは、軸索と樹状突起の性質、およびイメージング時のミトコンドリア分布により、不死化細胞とは異なります。プロトコルのこの部分の難しさの1つは、播種密度によって、初代培養物が健全に接着して成長できるかどうかが決まり、密度が高くなると、予測がDIV 10で過剰に成長する傾向があることです。したがって、これらの一次ニューロンから画像化されたミトコンドリアは、突起ではなく細胞体に由来する可能性があります。しかし、より低い開始細胞密度からの増殖が成功すると、後の増殖時間でより良いイメージング結果が得られます。重要なのは、STEDに最適なコントラストを得るために、低背景と焦点の合っていない光を確保することです。細胞集団に関する懸念に対処するために、B27を添加したニューロン増殖培地で初代海馬細胞を培養するとグリア細胞の増殖が妨げられ、細胞の<5%がアストロサイトであり、増殖培地にNbActiv1サプリメントが存在しないと、培養中のアストロサイトの数が<2%に減少すると報告されています87。培養SH-SY5Y細胞と初代ラット海馬ニューロンの両方について、増殖に使用されるPDLコーティングは、画像の背景のかすみに寄与します。(表1)で報告した設定で十分なS/N比が得られ、デコンボリューションによって観察されたバックグラウンドのほとんどが除去されます。
ここで取り上げたイメージングに加えて、イメージング前またはイメージング中に細胞に処理やストレスを加えることも可能です。例えば、tert-ブチル過酸化水素(tBHP)を添加すると酸化ストレスが誘発され、添加後のミトコンドリアの経時変化をモニターすることができます。アミロイドβ(Aβ)を蛍光タグで添加することで、ミトコンドリアに関連するこのペプチドの分布やミトコンドリア構造を経時的にモニタリングすることができます。ミトコンドリアの健康はADに深く関与しており、Aβ毒性に関与することが広く支持されている43,71,72。特に、SH-SY5Y細胞の分化状態はAβタンパク質前駆体(AβPP)の局在に影響を及ぼす85ため、AβPPを用いた実験は慎重に構築する必要がある。
このプロトコルをどのように適応させることができるかの一例として、イメージングの15分前に蛍光変異体Aβ(1-42)-HiLyte 647をPKMO染色細胞に添加できることが示されています(補足図1)。イメージングパラメータは類似していますが(補足表2)、主な違いは、狭いミトコンドリアをイメージングする場合、より小さなピンホールが必要になることです。Aβ-HiLyte647をSTEDでイメージングするには、全体的な励起(6%-8%)とSTEDの枯渇(10%-12%)のレーザー出力が少なく、蓄積が少なくて済みます(6)。検出器のゲーティングも0.1nsから10nsに拡張されています。AβのSTED分解能は必須ではありませんが、生STEDの全体的なS/N比とAβ粒子径は共焦点画像よりも優れており、その後のデコンボリューションも実行できます。STED画像を収集し、Aβの生のSTEDzスタック投影をデコンボリューションすることは、PKMO染色の生のSTEDまたはデコンボリューションSTED画像とマージする場合に特に有用であると考えられます(補足図1B、C)。両方のチャンネルを 1 フレーム ステップで収集しました。図 2 にリストされているものと同様の時間依存の局在化の測定値と、該当する場合は 図5に示されているもの、およびクリステ構造の違いは、応力処理またはその他の追加後に取得できます。
ミトコンドリアの生細胞STEDにおける二重標識の他の可能な方法には、SNAPタグ付きタンパク質93、ハロタグ付きタンパク質の使用、およびmtDNA63などの一般的な標的を持つ他の細胞透過性色素の使用が含まれます。特に、SNAPおよびHaloタグ付けの標識戦略は、イメージング時に得られる蛍光シグナル強度および寿命に影響を与える94。さらに、このプロトコルは、セグメント化されたミトコンドリアに適用できる分析の例をいくつか示していますが、ソフトウェアパッケージがこれらの画像に対して実行できる他の多くの分析があります。

ミトコンドリアは、中間代謝やATP産生、イオンホメオスタシス、脂質生合成、プログラム細胞死(アポトーシス)など、いくつかの重要な細胞プロセスの調節に関与する内部共生起源の真核生物細胞小器官です。これらの細胞小器官はトポロジー的に複雑であり、複数のサブコンパートメント1を確立する二重膜系を含んでいます(図1A)。外側のミトコンドリア膜(OMM)は細胞質と界面し、細胞小器官間の直接的な接触を確立する2,3。ミトコンドリア内膜(IMM)は、主に電気膜電位(ΔΨm)として蓄えられたイオン勾配を維持し、ATP合成やその他のエネルギーを必要とするプロセスを駆動するエネルギー保存膜です4,5。IMMはさらに、OMMに密着した内界膜(IBM)と、クリステ膜(CM)に結合したクリステと呼ばれる突出構造に細分化されます。この膜は、最も内側のマトリックスコンパートメントを、胴体内腔(ICS)と膜間腔(IMS)から区別します。
ミトコンドリアは、ダイナミンスーパーファミリー6のメカノ酵素によって支配される核分裂と融合の連続的かつバランスの取れたプロセスに基づく動的な形態を持っています。融合は接続性の向上と網状ネットワークの形成を可能にするが、核分裂はミトコンドリアの断片化を引き起こし、マイトファジーによる損傷したミトコンドリアの除去を可能にする7。ミトコンドリアの形態は、組織タイプ8および発生段階9によって異なり、細胞がエネルギー的ニーズ10,11およびストレッサー12などの要因に適応できるように制御されている。ミトコンドリアの標準的な形態学的特徴、例えばネットワーク形成の程度(相互接続または断片化)、周囲長、面積、体積、長さ(アスペクト比)、真円度、分岐の程度など)は、これらの特徴のサイズが光の回折限界(~200 nm)よりも大きいため、標準的な光学顕微鏡で測定および定量化できます13。
クリステの構造は、ミトコンドリアの内部構造を定義しています(図1B)。クリステの形態の多様性は、扁平(層状または円盤状)または管状小胞に大別できる14。すべてのクリステは、クリステジャンクション(CJ)と呼ばれる管状またはスロット状の構造を介してIBMに取り付けられ、IMSとICSを、IBMとCM15を区切るのに役立ちます。クリステの形態は、(1)CJに常駐し、IMM-OMM接触を安定化するミトコンドリア接触部位およびクリステ組織化系(MICOS)16、(2)クリステリモデリングを調節する視神経萎縮1(OPA1)GTPアーゼ17,18,19、および(3)クリステ先端(CT)で安定化オリゴマー体集合体を形成するF1FOATP合成酵素を含む、IMMの主要なタンパク質複合体によって調節される20。21。さらに、IMMは、高度に湾曲したIMM22を安定化する非二層リン脂質ホスファチジルエタノールアミンおよびカルジオリピンを豊富に含んでいる。クリステも動的であり、異なる代謝状態23,24、異なる呼吸基質25、飢餓および酸化ストレス26,27、アポトーシス28,29、老化30など、さまざまな条件下で形態学的変化を示します.最近、クリステは数秒のタイムスケールで大きな改造イベントを受ける可能性があることが示され、そのダイナミックな性質が強調されています31。個々のクリスタ内の構造の寸法(例えば、CJ幅、クリスタの長さ、幅)や、個々のクリスタを他の構造と関連付けるパラメータ(例えば、クリステ内の間隔やOMMに対するクリステ入射角)など、クリステのいくつかの特徴を定量化することができる32。これらの定量化可能なクリステパラメータは、関数との直接的な相関関係を示しています。例えば、ミトコンドリアのATP産生の程度は、クリステの存在量と正の相関があり、クリステ密度またはクリステ数として定量化され、別の特徴(例えば、OMM面積あたりのクリステ)に正規化される33,34,35。IMMの形態はナノスケールの特徴によって定義されるため、ミトコンドリアの超微細構造で構成されており、光回折限界を超える分解能を提供するイメージング技術が必要です。後述するように、このような技術には、電子顕微鏡法および超解像顕微鏡法(ナノスコピー)が含まれる。
中枢神経系(CNS)の神経細胞とグリア細胞は、特にミトコンドリア機能に依存しています。平均して、脳は総体重の2%しか構成していませんが、全身のグルコースの25%を利用し、体の酸素消費量の20%を占めているため、エネルギー代謝の障害に対して脆弱です36。アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン病(HD)、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病(PD)などの進行性神経変性疾患(ND)は、これまでで最も広く研究されている病態の一部であり、これらの疾患の分子基盤の理解から潜在的な治療予防と介入の探求まで、さまざまな研究努力が行われています。NDは、ミトコンドリアの電子伝達系(ETC)37によって生成される活性酸素種(ROS)や、ミトコンドリアのカルシウム処理38、ミトコンドリアの脂質代謝の変化39に部分的に起因した酸化ストレスの増加と関連している。これらの生理学的変化は、AD 40、41、42、43、44、ALS 45、46、HD 47、48、49、MS50、およびPD51、52、53に関連するミトコンドリア形態の顕著な欠陥を伴います.これらの構造的および機能的欠陥は、複雑な因果関係によって結合される可能性があります。例えば、クリステの形態がOXPHOS酵素を安定化させる54とすれば、ミトコンドリア活性酸素はETCによって生成されるだけでなく、ETCが存在するインフラにダメージを与える働きをし、酸化的損傷に対する感受性を高めるフィードフォワード活性酸素サイクルを促進する。さらに、クリステの解体は、ミトコンドリアDNA(mtDNA)の放出や、自己免疫疾患、代謝疾患、加齢性疾患に関連する炎症経路などのプロセスを引き起こすことが示されている55。したがって、ミトコンドリア構造の解析は、NDとその分子基盤を完全に理解するための鍵となります。
透過型電子顕微鏡、電子線トモグラフィー、クライオ電子線トモグラフィー(クライオET)、X線トモグラフィー、特にクライオ軟X線トモグラフィーなどの一般的なクリステの観察方法は、重要な発見を明らかにし、さまざまなサンプルタイプで作業しています56,57,58,59,60.近年、オルガネラの超微細構造の観察が進んでいますが、これらの方法にはサンプルの固定が必要であるため、クリステのリアルタイムダイナミクスを直接捉えることができないという注意点があります。超解像蛍光顕微鏡は、特に構造化照明顕微鏡(SIM)、確率光学再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在顕微鏡(PALM)、拡大顕微鏡(ExM)、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の形態で、従来の光学顕微鏡法を制約する回折限界以下の分解能を必要とする構造を観察するための一般的な方法となっています。ExMを別の超解像技術と組み合わせて使用すると、結果は印象的であるが、試料を固定し、ゲル61で染色しなければならない。比較すると、SIM、PALM/STORM、およびSTEDはすべてライブサンプルで成功裏に使用されており、IMMを一般的に染色する新しい有望な色素は、ミトコンドリアクリステダイナミクスのライブイメージングに斬新で簡単なアプローチを提供します62、63、64、65、66。STEDイメージング用のライブ色素の最近の進歩により、色素の輝度と光安定性が向上しており、これらの色素は以前の色素よりも高い特異性でIMMを標的としています。これらの開発により、超解像イメージングによる長期のタイムラプスおよびzスタック実験の収集が可能になり、ミトコンドリアの超微細構造とダイナミクスのより良い生細胞解析への扉が開かれます。
本明細書では、STED63を用いてPKmito Orange(PKMO)色素で染色した未分化および分化SH-SY5Y細胞の生細胞イメージングのためのプロトコルが提供される。SH-SY5Y細胞株は、転移性神経芽腫67,68,69,70の骨髄生検から生成された親細胞株SK-N-SHから3回サブクローニングされた誘導体です。この細胞株は、特にミトコンドリアの機能障害が深く関与するAD、HD、PDなどの疾患において、ND研究において一般的に使用されるin vitroモデルである10,43,71,72,73。培地を操作することでSH-SY5Y細胞をニューロン様表現型の細胞に分化させる能力は、初代神経細胞に頼らずに神経科学研究に適したモデルであることが証明されています10,74。このプロトコルでは、レチノイン酸(RA)を細胞培養培地に添加して、SH-SY5Y細胞の分化を誘導しました。関節リウマチはビタミンA誘導体であり、細胞周期を調節し、ニューロンの分化を調節する転写因子の発現を促進することが示されている75。また、ラット海馬から単離されたニューロンの培養および生細胞イメージングのためのプロトコルも提供されています。海馬はミトコンドリア変性の影響を受けることが示されており、皮質とともに老化とND76,77,78,79,80に重要な役割を果たしています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

ミトコンドリアは、エネルギー産生、Ca2+ ホメオスタシスの調節、脂質生合成、活性酸素種(ROS)の産生など、細胞内で多くの重要な役割を果たしています。これらのミトコンドリアを介したプロセスは、ニューロンにおいて特殊な役割を担い、これらの細胞の高エネルギー需要を満たすために好気性代謝を調整し、Ca2+ シグナル伝達を調節し、軸索の成長と再生のための脂質を供給し、ニューロンの発達と機能のためにROS産生を調整します。したがって、ミトコンドリアの機能不全は神経変性疾患の中心的な要因です。ミトコンドリアの構造と機能は密接に関連しています。形態学的に複雑な内膜は、クリステと呼ばれる構造的な折り目を持ち、ミトコンドリアの特徴的なプロセスを実行する多くの分子システムを持っています。内膜の構造的特徴は超微細構造であるため、従来の回折限界分解顕微鏡では小さすぎて可視化できません。したがって、ミトコンドリアの超微細構造に関するほとんどの洞察は、固定されたサンプルの電子顕微鏡から得られています。しかし、超解像蛍光顕微鏡の新技術により、数十ナノメートルまでの分解能が得られ、生細胞の微細構造の特徴を可視化できるようになりました。したがって、超解像イメージングは、ミトコンドリア構造、ナノスケールのタンパク質分布、およびクリステの動態の細部を直接画像化する前例のない能力を提供し、ミトコンドリアを人間の健康や病気に結び付ける基本的な新しい洞察を提供します。このプロトコルは生きている人間のneuroblastomaのセルおよび第一次ラットのニューロンのミトコンドリアの微細構造を視覚化するのに刺激された放出の枯渇(STED)の超解像の顕微鏡検査の使用を示す。この手順は、(1)SH-SY5Y細胞株の増殖と分化、(2)初代ラット海馬ニューロンの単離、プレーティング、および増殖、(3)ライブSTEDイメージングのための細胞の染色手順、(4)参照用のSTED顕微鏡を使用した生細胞STED実験の手順、および(5)内膜の形態学的特徴を測定および定量するための例を使用したセグメンテーションと画像処理のガイダンスの5つのセクションで構成されています。

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

このプロトコルはミトコンドリアのcristaeの生きているセルSTEDイメージ投射そしてそれに続く分析に焦点を合わせて培養された、一次セルのためのセル成長の状態を記述する。未分化のSH-SY5Y細胞(図3A)およびRA分化SH-SY5Y(図3B)細胞のミトコンドリアのImageJによる投影は、従来の共焦点およびSTEDでzスタックとして収集し、生のSTED画像をデコンボリューションすることができます。タイムラプスイメージングも実行でき、その後デコンボリューションされます(図3C、D)。初代ラット海馬ニューロン(表1)のわずかに異なるイメージングパラメータを使用して、共焦点画像と生のSTED画像をzスタックとして取得し、生のSTED画像をデコンボリューションすることができます(図4A)。初代ニューロンからのミトコンドリアのタイムラプスイメージングも可能です(図4B)。一般に、タイムラプス画像はミトコンドリアの動的イベントを表示できる必要があります。
セグメンテーションに使用したサンプルからの生の STED とデコンボリューションされた STED の Z スタック投影が一貫しているように見える場合、定量的測定が実行されます。TWSプラグインは、デコンボリューションされたSTED画像を使用してセグメント化して確率マスクを作成し、それを使用してクリステのバイナリマスクを作成し、サイズと形状のパラメータを取得します(図5A)。このマスクの領域は ROI マネージャーに保存され、必要に応じて生の STED イメージに適用して相対強度の差を測定できます。デコンボリューションされたSTED投影法は、特定の領域におけるクリステの周期性と密度を決定するためにも使用できます(図5B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> 図1:ミトコンドリアの形態。 ミトコンドリアには、異なるサブコンパートメント(A)を定義する2つの膜システムがあります。クリステは、定義された特徴(B)を持つ内膜の折り目です。略語:OMM、外側ミトコンドリア膜;ICS、胴腔内空間;IMS、膜間空間;CM、クリステ膜;IBM、内側境界膜;IMM、内ミトコンドリア膜;CT、クリステチップ;CJ、クリステジャンクション。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> 図2:ワークフローの概略図。SH-SY5Y細胞または初代ラット海馬ニューロンは、PDLコーティングされたカバーガラス上で増殖します。SH-SY5Y細胞は、未分化のまま、またはRA分化を6日間にわたって並行して増殖させます。初代ラット海馬ニューロンは、海馬切片から7日間単離された後、PDLコーティングされたカバーガラス上で増殖した。イメージングの準備が整ったら、細胞をPKMOで染色し、STEDでイメージングしました。次に、生のSTED画像をデコンボリューションし、デコンボリューションした画像をフィジーで処理して、クリステ密度、面積、周囲長、真円度、アスペクト比などのサイズと形状の測定値を取得します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> 図3:SH-SY5Y細胞におけるミトコンドリアのイメージング。 PKMO染色を施した未分化(A)およびRA分化(B)SH-SY5Y細胞のミトコンドリアの代表的な共焦点(左)、生のSTED(中央)、およびホイヘンスデコンボリューションSTED画像(右)を示す。30秒間隔でRA分化したSH-SY5Y細胞を5回繰り返したタイムラプス(C)と、選択した領域(白いボックス)を補間せずに拡大した領域(D)を示します。スケールバー:A、 B、250 nm; C、D、1 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> 図4:初代ラット海馬ニューロンにおけるミトコンドリアのイメージング。 代表的な共焦点(左)、生のSTED(中央)、ホイヘンスデコンボリューションSTED(右)の画像は、初代ラット海馬ニューロンからのミトコンドリアのzスタック投影を示しています(A)。これらのニューロンのミトコンドリアを25秒間隔で5回繰り返したタイムラプスが示されています(B)。スケールバー: A、 250 nm; B、 1μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> 図5:ImageJでのデコンボリューションされたSTED画像の処理。 Trainable Weka Segmentationプラグインを使ってクリステのサイズと形状を測定した代表的な使い方を示す(A)。左から右に、デコンボリューションされたSTED画像、TWSプラグインからのセグメンテーションに基づく確率マップ、確率マップを入力として使用したフィジーでのしきい値処理からのマスク、ROIのアウトラインを持つマスク、および元のデコンボリューションされたSTED画像にオーバーレイされたROIが示されています。これらのオブジェクトに対応する結果の面積、周囲長、真円度、およびアスペクト比の測定値は、 補足表1に記載されています。クリステ密度の読み出しとして、デコンボリューションされたSTED画像を使用してピークtoピーク距離を測定した折れ線グラフを示します(B)。スケールバー:0.5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>ピクセルサイズ(nm)</td>
			<td>滞留時間(μs)</td>
			<td>回線接続</td>
			<td>STED取得時の561 nm励起(%)</td>
			<td>775 nm STEDの空乏電力(%)</td>
			<td>ステップサイズ(nm)</td>
			<td>ピンホール(AU)</td>
			<td>タイムラプス間隔(秒)</td>
			<td>タイムラプスの反復</td>
		</tr><tr><td>非異種SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-ディフェール-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>一次ニューロン</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">注:ピクセルサイズは、イメージング要件とイメージのデコンボリューションの意図によって異なる場合があります。デコンボリューションには適切なサンプリングが必要です。デコンボリューションなしの生のSTED画像のピクセルサイズは、最大30nmまで可能です。</td>
		</tr></tbody></table>表1:STED取得パラメータの概要。 細胞種別、未分化SH-SY5Y、RA分化SH-SY5Y、初代ラット海馬ニューロンの2D STEDイメージングに用いた設定値を表示します。すべてのタイムラプスについて、ROIサイズに基づいてさまざまな間隔で5回の反復が行われました。
補足図1:アミロイドβ(Aβ)を添加したSH-SY5Y細胞のイメージング。 PKMO染色を有するRA分化SH-SY5Y細胞(上)およびAβ-HiLyte647(下)の代表的な共焦点画像(左)、生STED(中央)、およびデコンボリューションSTED(右)画像(A)を示します。生のPKMO STED(緑)と生のAβ STED(マゼンタ)(B)またはデコンボリューションされたPKMO STED(緑)とデコンボリューションされたAβ STED(マゼンタ)(C)のマージされたzスタック投影を示します。スケールバー:0.5 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:セグメント化されたクリステのサイズと形状の測定。 セグメント化されたミトコンドリアから図5Aに概説されたオブジェクトに対応する、面積(μm2)、周囲長(μm)、真円度、およびアスペクト比のサイズおよび形状の測定値が示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2:アミロイドβサンプルの取得パラメータの概要。 未分化およびRA分化SH-SY5Y細胞におけるPKMOおよびAβ-HiLyte647の2D STEDイメージングに用いた設定を表示します。Aβ-HiLyte647の共焦点は、分離する特定の構造がないため、単独で使用できます。Aβ-HiLyte647のSTED画像は、粒子径が小さい場合のものです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:アミロイドβ治療プロトコル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

このプロトコルは刺激された放出枯渇(STED)の顕微鏡検査を使用してミトコンドリアの微細構造の視覚化および分析のための培養されたSH-SY5Yのセルそして第一次ラットの海馬ニューロンの伝播、微分および汚損のためのワークフローを示す。

生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

私たちの研究プログラムは、ミトコンドリアの構造的および機能的側面、特に加齢に関連する機能障害に関連しています。そのために、ミトコンドリア老化の基本的なメカニズムを探り、ミトコンドリアの健康を維持・回復するための治療的介入を開発するために、幅広い生物物理学的、生化学的、構造的手法を用いています。ミトコンドリアの機能と構造は表裏一体の関係にあります。標準的な光学顕微鏡法は、基本的な形態やネットワーク構造などの大規模なミトコンドリアの特徴を測定するのに適しています。ミトコンドリアの超微細構造や特徴の分析は、従来の光学顕微鏡よりも高い分解能を必要とするが、通常、固定されたサンプルに対して電子顕微鏡またはトモグラフィーを用いて行われる。超解像顕微鏡は、回折限界を超える特徴を測定する蛍光ベースのイメージング技術です。ミトコンドリアの場合、これにはナノスケールのタンパク質分布とクリステ構造の測定が含まれます。ここで説明するステッドイメージングプロトコルにより、研究者は生細胞の内膜の詳細な構造を測定することができます。ライブセルイメージングにより、サンプルを固定することなく、生理学的に適切な条件下でクリステの複雑な特徴を観察し、定量的に分析することができます。これにより、研究者は、超微細構造の特徴に起こるダイナミックな変化と、ストレッサーや薬理学的化合物に対するそれらの時間的応答に関する新しい洞察を得ることができます。