Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Primære rotte hippocampus nevroner ble levert av Dr. George Lykotrafitis og Shiju Gu fra Biomedical Engineering Department ved University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment ble anskaffet med NIH-stipend S10OD023618 tildelt Christopher O'Connell. Denne forskningen ble finansiert av NIH-stipend R01AG065879 tildelt Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen presenterer bruken av human neuroblastomcellelinje SH-SY5Y og primære rotte hippocampus-nevroner med det nye IMM-målrettede PKMO-fargestoffet for levende celle STED-avbildning. På grunn av nyheten av PKMO, er det for tiden lite publisert ved hjelp av dette fargestoffet for live STED bildebehandling. Bruk av disse celletypene for STED-avbildning gir utfordringer, spesielt fordi nevronceller har smalere mitokondrier. En begrensning av denne protokollen er PKMO-fargestoffet som brukes, da det kan være giftig for celler. Ulike celler og cellelinjer reagerer forskjellig på fargestoffet, og det kan derfor være nødvendig med justeringer av fargestoffkonsentrasjon og inkubasjonstid for å optimalisere resultatene for sterkt signal uten å skade celler. En foreslått løsning er å senke konsentrasjonen og øke fargetiden63; Dette kan imidlertid føre til dårligere farging uten å øke cellenes levedyktighet.
På samme måte som PKMO, viser det kommersielle fargestoffet Live Orange mito (Table of Materials) også noe celletoksisitet. Dette fargestoffet ble brukt til en rekke dyrkede celler, men var ikke i stand til å vise sammenlignbar farging i RA-differensierte SH-SY5Y-celler vellykket med de samme parametrene som deres udifferensierte kolleger (våre upubliserte observasjoner). Imidlertid kan amenable fargeprotokoller optimaliseres for denne sonden og valgte celletyper. Med dette fargestoffet ble detektorgatingstider på 1-1,05 til 7-7,05 ns brukt, mens alle andre parametere i tabell 1 forblir de samme. Generelt ga farging av celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 min sammenlignbare resultater som PKMO-resultatene viste. Høyere konsentrasjonsfarging i kortere tid eller lavere konsentrasjonsfarging i samme tid eller litt lenger kan gi forskjellige resultater og kan være gunstig for andre celletyper eller vekstforhold.
Imaging primære rotte hippocampus nevroner skiller seg fra immortaliserte celler på grunn av arten av axon og dendritt fremspring, samt mitokondriell fordeling på tidspunktet for avbildning. En vanskelighet i denne delen av protokollen er at såtettheten avgjør om primærkulturene vil kunne feste seg og vokse sunt, og ved høyere tettheter har projeksjonene en tendens til å gro igjen ved DIV 10. Derfor vil mitokondriene avbildet fra disse primære nevronene sannsynligvis komme fra cellekroppen og ikke fremspringene; Imidlertid gir vellykket vekst fra en lavere startcelletetthet bedre bilderesultater ved senere veksttider. Nøkkelen er å sikre lav bakgrunn og ufokusert lys for å ha den beste kontrasten for STED. For å løse bekymringer angående cellepopulasjon, forhindrer dyrking av primære hippocampusceller i B27-supplerte nevronvekstmedier veksten av gliaceller, og kilden rapporterer at <5% av cellene er astrocytter, og fraværet av NbActiv1-tilskudd i vekstmediet reduserer antall astrocytter i kulturer til <2%87. For både dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampus-nevroner fra rotter bidrar PDL-belegget som brukes til vekst til bakgrunnståke i bilder. Tilstrekkelig signal-til-støy oppnås med innstillingene rapportert i (tabell 1), og dekonvolusjon fjerner det meste av bakgrunnen som er observert.
I tillegg til avbildningen som dekkes her, er det også mulig å legge til behandlinger eller stress på celler før eller under bildebehandling. For eksempel induserer tilsetning av tert-butylhydrogenperoksid (tBHP) oksidativt stress, og det er mulig å overvåke endringer i mitokondrier over tid etter tilsetning. Tilsetningen av amyloid-β (Aβ) med en fluorescerende tag tillater overvåking av fordelingen av dette peptidet i forhold til mitokondrier samt mitokondriestrukturen over tid. Mitokondriell helse har vært sterkt involvert i AD og er allment støttet for å spille en rolle i Aβ toksisitet 43,71,72. Spesielt påvirker differensieringsstatusen til SH-SY5Y-celler Aβ-proteinforløperen (AβPP) lokalisering85, og eksperimenter med AβPP bør konstrueres nøye.
Som et eksempel på hvordan denne protokollen kan tilpasses, er det vist at den fluorescerende varianten Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan legges til PKMO-fargede celler 15 min før avbildning (tilleggsfigur 1). Bildeparametrene er like (tilleggstabell 2), med hovedforskjellen at et mindre knappenålshull er nødvendig ved avbildning av smalere mitokondrier. Imaging Aβ-HiLyte647 med STED krever mindre generell eksitasjon (6% -8%) og STED-deplesjon (10% -12%) laserkraft og færre akkumuleringer (seks). Detektorgating er også utvidet fra 0,1 til 10 ns. Selv om STED-oppløsning på Aβ ikke er nødvendig, var det totale signal-støy-forholdet og Aβ-partikkelstørrelsen til rå STED bedre enn de konfokale bildene, og etterfølgende dekonvolusjon kan også utføres. Innsamling av STED-bilder og dekonvolving av rå STED z-stack-projeksjoner av Aβ ser ut til å være spesielt nyttig ved sammenslåing med rå STED- eller deconvolved STED-bilder av PKMO-flekken (tilleggsfigur 1B,C). Begge kanalene ble samlet i et enkelt rammetrinn. Målinger av tidsavhengig lokalisering, tilsvarende de som er listet opp i figur 2 og vist i figur 5, der det er aktuelt, og forskjeller i cristae-arkitektur kan oppnås etter stressbehandling eller andre tillegg.
Andre mulige metoder for dobbeltmerking i levende celle STED av mitokondrier som ikke er rapportert her, men har blitt rapportert av andre, inkluderer bruk av SNAP-merkede proteiner93, Halo-merkede proteiner og bruk av andre cellepermeable fargestoffer med generiske mål, for eksempel mtDNA63. Spesielt påvirker merkingsstrategien for SNAP- og Halo-merking den resulterende fluorescenssignalintensiteten og levetiden ved avbildning94. I tillegg, mens denne protokollen presenterer flere eksempler på analyser som kan brukes på segmenterte mitokondrier, er det mange andre analyser som programvarepakker kan utføre på disse bildene.

Mitokondrier er eukaryote organeller av endosymbiotisk opprinnelse som er ansvarlige for å regulere flere viktige cellulære prosesser, inkludert mellomliggende metabolisme og ATP-produksjon, ionhomeostase, lipidbiosyntese og programmert celledød (apoptose). Disse organellene er topologisk komplekse, og inneholder et dobbeltmembransystem som etablerer flere underrom1 (figur 1A). Den ytre mitokondriemembranen (OMM) grensesnitt med cytosolen og etablerer direkte interorganelle kontakter 2,3. Den indre mitokondriemembranen (IMM) er en energibesparende membran som opprettholder iongradienter lagret primært som et elektrisk membranpotensial (ΔΨm) for å drive ATP-syntese og andre energikrevende prosesser 4,5. IMM er videre delt inn i den indre grensemembranen (IBM), som er tett knyttet til OMM, og utstående strukturer kalt cristae som er bundet av cristae-membranen (CM). Denne membranen avgrenser det innerste matriserommet fra det intrakristale rommet (ICS) og intermembranrommet (IMS).
Mitokondrier har en dynamisk morfologi basert på kontinuerlige og balanserte prosesser for fisjon og fusjon som styres av mekanoenzymer av dynamin-superfamilien6. Fusjon muliggjør økt tilkobling og dannelse av retikulære nettverk, mens fisjon fører til mitokondriell fragmentering og muliggjør fjerning av skadede mitokondrier ved mitofagi7. Mitokondriell morfologi varierer etter vevstype8 og utviklingsstadium9 og reguleres for å tillate celler å tilpasse seg faktorer som energiske behov 10,11 og stressorer 12. Standard morfometriske trekk ved mitokondrier, som omfanget av nettverksdannelse (sammenkoblet vs. fragmentert), omkrets, areal, volum, lengde (størrelsesforhold), rundhet og forgreningsgrad, kan måles og kvantifiseres ved standard optisk mikroskopi fordi størrelsene på disse funksjonene er større enn diffraksjonsgrensen for lys (~ 200 nm)13.
Cristae-arkitektur definerer mitokondrienes indre struktur (figur 1B). Mangfoldet av cristae-morfologier kan grovt kategoriseres som flat (lamellar eller diskoidal) eller rørformet-vesikulær14. Alle cristae festes på IBM gjennom rørformede eller sporlignende strukturer kalt cristae junctions (CJs) som kan tjene til å dele IMS fra ICS og IBM fra CM15. Cristae-morfologi reguleres av nøkkelproteinkomplekser i IMM, inkludert (1) mitokondriekontaktstedet og cristae-organiseringssystemet (MICOS) som ligger ved CJs og stabiliserer IMM-OMM-kontakter 16, (2) optisk atrofi 1 (OPA1) GTPase som regulerer cristae-remodellering17,18,19, og (3) F1FO ATP-syntase som danner stabiliserende oligomere samlinger ved cristae-spisser (CTs)20, 21. I tillegg er IMM anriket i ikke-bilags fosfolipider fosfatidyletanolamin og kardiolipin som stabiliserer den høyt buede IMM22. Cristae er også dynamiske, og demonstrerer morfologiske endringer under forskjellige forhold, for eksempel forskjellige metabolske tilstander 23,24, med forskjellige respiratoriske substrater 25, under sult og oksidativt stress 26,27, med apoptose 28,29 og med aldring 30. Nylig har det vist seg at cristae kunne gjennomgå store ombyggingshendelser på en tidsskala på sekunder, noe som understreker deres dynamiske natur31. Flere egenskaper ved cristae kan kvantifiseres, inkludert dimensjoner av strukturer innenfor individuelle cristae (f.eks. CJ-bredde, cristalengde og bredde) og parametere som relaterer individuell crista til andre strukturer (f.eks. intra-cristae-avstand og cristae-hendelsesvinkel i forhold til OMM)32. Disse kvantifiserbare cristae-parametrene viser en direkte sammenheng med funksjon. For eksempel er omfanget av mitokondriell ATP-produksjon positivt relatert til overflod av cristae, kvantifisert som cristae tetthet eller cristae tall normalisert til en annen funksjon (f.eks. cristae per OMM-område) 33,34,35. Fordi IMM-morfologi er definert av nanoskalafunksjoner, består den av mitokondriell ultrastruktur, som krever bildebehandlingsteknikker som gir oppløsning større enn lysdiffraksjonsgrensen. Som beskrevet nedenfor inkluderer slike teknikker elektronmikroskopi og superoppløsningsmikroskopi (nanoskopi).
Nevrale og gliaceller i sentralnervesystemet (CNS) er spesielt avhengige av mitokondriell funksjon. I gjennomsnitt utgjør hjernen bare 2% av den totale kroppsvekten, men bruker 25% av den totale kroppsglukosen og står for 20% av kroppens oksygenforbruk, noe som gjør den sårbar for nedsatt energimetabolisme36. Progressive nevrodegenerative sykdommer (ND), inkludert Alzheimers sykdom (AD), amyotrofisk lateralsklerose (ALS), Huntingtons sykdom (HS), multippel sklerose (MS) og Parkinsons sykdom (PD), er noen av de mest omfattende studerte patologiene til dags dato, med forskningsinnsats som spenner fra å forstå det molekylære grunnlaget for disse sykdommene til å søke potensiell terapeutisk forebygging og intervensjoner. ND er assosiert med økt oksidativt stress som delvis stammer fra reaktive oksygenarter (ROS) generert av mitokondriell elektrontransportkjede (ETC)37, samt endret mitokondriell kalsiumhåndtering 38 og mitokondriell lipidmetabolisme39. Disse fysiologiske endringene er ledsaget av bemerkede defekter i mitokondriell morfologi som er assosiert med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS50 og PD 51,52,53. Disse strukturelle og funksjonelle defekter kan kobles av komplekse årsak-virkning forhold. For eksempel, gitt at cristae-morfologi stabiliserer OXPHOS-enzymer54, genereres mitokondriell ROS ikke bare av ETC, men de virker også for å skade infrastrukturen der ETC ligger, og fremmer en feed-forward ROS-syklus som forbedrer følsomheten for oksidativ skade. Videre har cristae disorganisering vist seg å utløse prosesser som mitokondriell DNA (mtDNA) frigjøring og inflammatoriske veier forbundet med autoimmune, metabolske og aldersrelaterte lidelser55. Derfor er analyse av mitokondriell struktur nøkkelen til en full forståelse av ND og deres molekylære grunnlag.
Populære metoder for visning av cristae, inkludert transmisjonselektronmikroskopi, elektrontomografi og kryo-elektrontomografi (kryo-ET) og røntgentomografi, spesielt kryo-myk røntgentomografi, har avslørt viktige funn og arbeid med en rekke prøvetyper 56,57,58,59,60. Til tross for nylige fremskritt mot bedre observasjon av organellær ultrastruktur, kommer disse metodene fortsatt med forbehold om å kreve prøvefiksering og kan derfor ikke fange sanntidsdynamikken til cristae direkte. Superoppløsning fluorescensmikroskopi, spesielt i form av strukturert belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM), fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM), ekspansjonsmikroskopi (ExM) og stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi, har blitt populære måter å se strukturer som krever oppløsning under diffraksjonsgrensen som begrenser klassiske metoder for optisk mikroskopi. Når ExM brukes sammen med en annen superoppløsningsteknikk, er resultatene imponerende, men prøven må festes og farges i en gel61. Til sammenligning har SIM, PALM / STORM og STED alle blitt brukt med levende prøver, og nye og lovende fargestoffer som generelt flekker IMM gir en ny og enkel tilnærming for live avbildning av mitokondrier cristae dynamikk 62,63,64,65,66. Nylige fremskritt i levende fargestoffer for STED-avbildning har forbedret fargestoffets lysstyrke og fotostabilitet, og disse fargestoffene retter seg mot IMM i en høyere grad av spesifisitet enn sine forgjengere. Denne utviklingen tillater innsamling av langsiktige timelapse- og z-stack-eksperimenter med superoppløsningsavbildning, og åpner døren for bedre levende celleanalyse av mitokondriell ultrastruktur og dynamikk.
Her er protokoller for levende celleavbildning av udifferensierte og differensierte SH-SY5Y-celler farget med PKmito Orange (PKMO) fargestoff ved bruk av STED63 gitt. SH-SY5Y-cellelinjen er et tre ganger subklonet derivat fra foreldrecellelinjen, SK-N-SH, generert fra en benmargsbiopsi av metastatisk neuroblastom67,68,69,70. Denne cellelinjen er en vanlig in vitro-modell i ND-forskning, spesielt med sykdommer som AD, HD og PD, hvor mitokondriell dysfunksjon er sterkt involvert 10,43,71,72,73. Evnen til å differensiere SH-SY5Y-celler til celler med en nevronlignende fenotype gjennom manipulering av kulturmedier har vist seg å være en egnet modell for nevrovitenskapelig forskning uten å stole på primære nevronceller10,74. I denne protokollen ble retinsyre (RA) tilsatt til cellekulturmediet for å indusere differensiering av SH-SY5Y-celler. RA er et vitamin A-derivat og har vist seg å regulere cellesyklusen og fremme ekspresjonen av transkripsjonsfaktorer som regulerer nevrondifferensiering75. En protokoll for dyrking og levende celleavbildning av nevroner isolert fra rottehippocampus er også gitt. Hippocampus har vist seg å være påvirket av mitokondriell degenerasjon og, sammen med cortex, spiller en viktig rolle i aldring og ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Mitokondrier spiller mange viktige roller i cellen, inkludert energiproduksjon, regulering av Ca2+ homeostase, lipidbiosyntese og produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). Disse mitokondriemedierte prosessene tar på seg spesialiserte roller i nevroner, koordinerer aerob metabolisme for å møte de høye energikravene til disse cellene, modulerer Ca2+ -signalering, gir lipider for aksonvekst og regenerering, og justerer ROS-produksjon for nevronutvikling og funksjon. Mitokondriell dysfunksjon er derfor en sentral driver ved nevrodegenerative sykdommer. Mitokondriell struktur og funksjon er uløselig forbundet. Den morfologisk komplekse indre membranen med strukturelle folder kalt cristae har mange molekylære systemer som utfører signaturprosessene til mitokondrionen. De arkitektoniske egenskapene til den indre membranen er ultrastrukturelle og derfor for små til å bli visualisert ved tradisjonell diffraksjonsbegrenset oppløst mikroskopi. Dermed har de fleste innsikter om mitokondriell ultrastruktur kommet fra elektronmikroskopi på faste prøver. Imidlertid gir nye teknologier i superoppløsningsfluorescensmikroskopi nå oppløsning ned til titalls nanometer, noe som tillater visualisering av ultrastrukturelle egenskaper i levende celler. Superoppløsningsavbildning gir derfor en enestående evne til direkte å avbilde fine detaljer om mitokondriell struktur, nanoskalaproteinfordelinger og cristae-dynamikk, noe som gir grunnleggende ny innsikt som knytter mitokondrier til menneskers helse og sykdom. Denne protokollen presenterer bruken av stimulert utslippsuttømming (STED) superoppløsningsmikroskopi for å visualisere mitokondriell ultrastruktur av levende humane neuroblastomceller og primære rotteneuroner. Denne prosedyren er organisert i fem seksjoner: (1) vekst og differensiering av SH-SY5Y-cellelinjen, (2) isolering, plating og vekst av primære hippocampus-nevroner fra rotter, (3) prosedyrer for farging av celler for levende STED-avbildning, (4) prosedyrer for levende celle STED-eksperimenter ved bruk av et STED-mikroskop som referanse, og (5) veiledning for segmentering og bildebehandling ved hjelp av eksempler for å måle og kvantifisere morfologiske egenskaper av den indre membranen.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Denne protokollen beskriver cellevekstbetingelser for dyrkede og primære celler med fokus på levende celle STED-avbildning og påfølgende analyser av mitokondriell cristae. Projeksjoner laget med ImageJ av mitokondrier fra udifferensierte SH-SY5Y (figur 3A) og RA-differensierte SH-SY5Y (figur 3B) celler kan samles som z-stabler med tradisjonell konfokal og STED, og de rå STED-bildene kan deretter dekonvolved. Timelapse-avbildning kan også utføres og deretter deconvolved (figur 3C,D). Ved å bruke litt forskjellige avbildningsparametere for primære hippocampusnevroner hos rotter (tabell 1), kan konfokale og rå STED-bilder anskaffes som z-stabler, og de rå STED-bildene kan dekonvolderes (figur 4A). Timelapse-avbildning av mitokondrier fra primære nevroner er også mulig (figur 4B). Generelt bør time-lapse-bildene kunne vise mitokondrielle dynamiske hendelser.
Når rå STED og deconvolved STED z-stack-projeksjoner fra prøvene som brukes til segmentering virker konsistente, utføres kvantitative målinger. TWS-pluginet bruker det deconvolved STED-bildet til å segmentere for å lage en sannsynlighetsmaske, som deretter brukes til å lage en binær maske av cristae for å oppnå størrelses- og formparametere (figur 5A). Områdene fra denne masken lagres i ROI-behandleren og kan brukes på råbildet hvis du ønsker det, for å måle forskjeller i relativ intensitet. De deconvolved STED-projeksjonene kan også brukes til å bestemme cristae-periodisiteten og tettheten i et gitt område (figur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figur 1 Mitokondriell morfologi. Mitokondrier har et tomembransystem som definerer forskjellige underrom (A). Cristae er infolds av den indre membranen med definerte egenskaper (B). Forkortelser: OMM, ytre mitokondriemembran; ICS, intracristal plass; IMS, intermembrane plass; CM, cristae membran; IBM, indre grensemembran; IMM, indre mitokondriemembran; CT, cristae spiss; CJ, cristae kryss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Figur 2: Skjematisk over arbeidsflyten. SH-SY5Y-celler eller primære rotte hippocampus-nevroner dyrkes på et PDL-belagt dekkglass. SH-SY5Y-celler dyrkes parallelt for å forbli udifferensiert eller utsatt for RA-differensiering i løpet av seks dager. Primære hippocampus-nevroner fra rotter ble dyrket på et PDL-belagt dekkglass etter å ha blitt isolert fra hippocampus-seksjoner i syv dager. Når de var klare til å bli avbildet, ble cellene farget med PKMO og avbildet med STED. Raw STED-bilder blir deretter deconvolved, og de deconvolved bildene behandles i FIJI for å oppnå størrelses- og formmålinger, for eksempel cristae-tetthet, areal, omkrets, sirkularitet og størrelsesforhold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figur 3 Avbildning av mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED bilde z-stack projeksjoner (høyre) av mitokondrier fra ikke-differensierte (A) og RA-differensierte (B) SH-SY5Y celler med PKMO-farging er vist. En timelapse med 30 s-intervaller og 5 iterasjoner av RA-differensierte SH-SY5Y-celler vises (C) med utvalgte regioner (hvite bokser) utvidet (D) ved hjelp av skalerte bilder av disse regionene uten interpolering. Skala barer: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figur 4 Avbildning av mitokondrier i primære hippocampusnevroner hos rotter. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og Huygens deconvolved STED (høyre) bilde z-stack projeksjoner av mitokondrier fra primære rotte hippocampus nevroner er vist (A). En timelapse med 25 s intervaller og 5 iterasjoner av mitokondrier i disse nevronene er vist (B). Skala barer: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figur 5: Behandling av deconvolved STED-bilder i ImageJ. Representativ bruk av Trainable Weka Segmentation plugin for å måle cristae størrelse og form er vist (A). Fra venstre til høyre vises følgende bilder: det deconvolved STED-bildet, sannsynlighetskartet basert på segmentering fra TWS-plugin, masken fra terskel i FIJI ved hjelp av sannsynlighetskartet som inngang, masken med ROIene skissert, og avkastningen overlagt på det opprinnelige deconvolved STED-bildet. De resulterende målingene av areal, perimeter, sirkularitet og sideforhold som tilsvarer disse objektene, finnes i tilleggstabell 1. Et linjeplott som bruker det deconvolved STED-bildet til å måle topp-til-toppavstander som en avlesning for cristae-tetthet vises (B). Skala barer: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Pikselstørrelse (nm)</td>
			<td>Oppholdstid (μs)</td>
			<td>Line iht.</td>
			<td>561 nm eksitasjon under STED-oppkjøp (%)</td>
			<td>775 nm STED uttømmingskraft (%)</td>
			<td>Trinnstørrelse (nm)</td>
			<td>Pinhole (AU)</td>
			<td>Intervall(er)</td>
			<td>Timelapse-gjentakelser</td>
		</tr><tr><td>Udifferensiert SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differe-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Primære nevroner</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">MERK: Pikselstørrelsen kan variere basert på bildekrav og intensjon om å deconvolve bilder. Riktig prøvetaking er nødvendig for dekonvolusjon. Pikselstørrelser for rå STED-bilder uten dekonvolusjon kan gå opp til 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sammendrag av STED-anskaffelsesparametere. Innstillingene som brukes for 2D STED-avbildning for hver celletype, udifferensiert SH-SY5Y, RA-differensiert SH-SY5Y og primære hippocampus-nevroner fra rotter, vises. For alle timelapses ble det tatt 5 iterasjoner med varierende intervaller basert på ROI-størrelse.
Tilleggsfigur 1: Avbildning av SH-SY5Y-celler med amyloid-β (Aβ) addisjon. Representative konfokale (venstre), rå STED (midten) og deconvolved STED (høyre) bilder av RA-differensierte SH-SY5Y-celler med PKMO-flekk (øverst) og Aβ-HiLyte647 (nederst) vises (A). Sammenslåtte z-stack-projeksjoner av rå PKMO STED (grønn) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller deconvolved PKMO STED (grønn) med deconvolved Aβ STED (magenta) (C) vises. Skala barer: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggstabell 1: Størrelses- og formmålinger av segmentert cristae. Størrelses- og formmålene for areal (μm2), omkrets (μm), sirkularitet og størrelsesforhold, tilsvarende objektene skissert i figur 5A fra segmenterte mitokondrier, vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggstabell 2: Sammendrag av innsamlingsparametere med amyloid-β prøver. Innstillingene som brukes for 2D STED-avbildning av PKMO og Aβ-HiLyte647 i udifferensierte og RA-differensierte SH-SY5Y-celler, vises. Konfokal av Aβ-HiLyte647 kan brukes alene da det ikke er noen spesifikk struktur å løse; STED-bilder av Aβ-HiLyte647 vises her for mindre partikkelstørrelser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 1: Amyloid-β behandlingsprotokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Denne protokollen presenterer en arbeidsflyt for forplantning, differensiering og farging av dyrkede SH-SY5Y-celler og primære hippocampus-nevroner fra rotter for mitokondriell ultrastrukturvisualisering og analyse ved bruk av stimulert utslippsuttømming (STED) mikroskopi.

Bruke levende celle STED-avbildning for å visualisere mitokondriell indre membran ultrastruktur i nevrale cellemodeller

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Vårt forskningsprogram fokuserer på strukturelle og funksjonelle aspekter av mitokondrier, særlig når de relaterer seg til aldringsrelatert dysfunksjon. For dette formål bruker vi et bredt spekter av biofysiske, biokjemiske og strukturelle teknikker for å utforske de grunnleggende mekanismene for mitokondriell aldring og å utvikle terapeutiske inngrep for å bevare og gjenopprette mitokondriell helse. Mitokondriell funksjon og struktur er uløselig relatert.Standard lysmikroskopiteknikker er egnet for måling av storskala mitokondrielle egenskaper som grunnleggende morfologi og nettverksstrukturer. Analyse av mitokondriell ultrastruktur eller funksjoner som krever høyere oppløsning enn tradisjonell optisk mikroskopi gir, gjøres vanligvis ved hjelp av elektronmikroskopi eller tomografi på faste prøver. Superoppløsningsmikroskopi er en fluorescensbasert bildebehandlingsteknikk som måler funksjoner utover diffraksjonsgrensen.For mitokondrier inkluderer dette målinger av nanoskalaproteinfordeling og cristae-arkitektur. Stead imaging-protokollen beskrevet her gjør det mulig for forskere å måle den detaljerte strukturen til den indre membranen i levende celler. Levende celleavbildning lar oss observere og kvantitativt analysere komplekse egenskaper av cristae under fysiologisk relevante forhold uten behov for prøvefiksering.Dette vil gi forskere ny innsikt i de dynamiske endringene som forekommer i ultrastrukturelle egenskaper og deres tidsmessige responser på stressorer og farmakologiske forbindelser.