Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
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Os neurônios primários do hipocampo de ratos foram fornecidos pelo Dr. George Lykotrafitis e Shiju Gu do Departamento de Engenharia Biomédica da Universidade de Connecticut (Storrs, CT, EUA). O instrumento Abberior STED alojado no Advanced Light Microscopy Facility no Center for Open Research Resources and Equipment foi adquirido com S10OD023618 de concessão do NIH concedida a Christopher O'Connell. Esta pesquisa foi financiada pelo NIH grant R01AG065879 concedido a Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo apresenta o uso da linhagem celular SH-SY5Y do neuroblastoma humano e neurônios primários do hipocampo de ratos com o novo corante PKMO direcionado para IMM para imagens STED de células vivas. Devido à novidade da PKMO, atualmente há pouca publicação usando este corante para imagens STED ao vivo. O uso desses tipos celulares para imagens STED apresenta desafios, especificamente porque as células neuronais têm mitocôndrias mais estreitas. Uma limitação desse protocolo é o corante PKMO utilizado, pois pode ser tóxico para as células. Diferentes células e linhagens celulares respondem diferentemente ao corante, assim, ajustes na concentração do corante e no tempo de incubação para otimizar os resultados para um sinal forte sem prejudicar as células podem ser necessários. Uma solução sugerida é diminuir a concentração e aumentar o tempo de coloração63; no entanto, isso pode resultar em coloração mais pobre sem aumentar a viabilidade celular.
Da mesma forma que o PKMO, o corante comercial Live Orange mito (Tabela de Materiais) também exibe alguma toxicidade celular. Este corante foi usado para uma variedade de células cultivadas, mas foi incapaz de exibir coloração comparável em células SH-SY5Y diferenciadas de AR com sucesso com os mesmos parâmetros que suas contrapartes indiferenciadas (nossas observações não publicadas). No entanto, protocolos de coloração amable podem ser otimizados para esta sonda e tipos celulares escolhidos. Com esse corante, foram utilizados tempos de fechamento do detector de 1-1,05 a 7-7,05 ns, permanecendo os mesmos todos os outros parâmetros da Tabela 1 . Geralmente, a coloração de células com 200-250 nM de Mito de Laranja Viva por 45 min produziu resultados comparáveis como mostraram os resultados de PKMO. Coloração de maior concentração por menos tempo ou coloração de menor concentração pelo mesmo período de tempo ou um pouco mais pode produzir resultados diferentes e pode ser favorável a outros tipos celulares ou condições de crescimento.
A imagem de neurônios primários do hipocampo de ratos difere das células imortalizadas devido à natureza das projeções do axônio e dendrito, bem como à distribuição mitocondrial no momento da imagem. Uma dificuldade nesta parte do protocolo é que a densidade de semeadura determina se as culturas primárias serão capazes de aderir e crescer de forma saudável, e em densidades mais altas, as projeções tendem a crescer demais por DIV 10. Portanto, as mitocôndrias imageadas desses neurônios primários provavelmente virão do corpo celular e não das projeções; no entanto, o crescimento bem-sucedido a partir de uma densidade celular inicial mais baixa produz melhores resultados de imagem em tempos de crescimento posteriores. A chave é garantir fundo baixo e luz fora de foco para ter o melhor contraste para STED. Para abordar as preocupações em relação à população celular, a cultura de células hipocampais primárias em meios de crescimento de neurônios suplementados com B27 impede o crescimento de células gliais, e a fonte relata que <5% das células são astrócitos e a ausência de suplemento de NbActiv1 nos meios de crescimento reduz o número de astrócitos em culturas para <2%87. Tanto para células SH-SY5Y cultivadas quanto para neurônios primários do hipocampo de ratos, o revestimento PDL usado para o crescimento contribui para a névoa de fundo nas imagens. Sinal-ruído suficiente é realizado com as configurações relatadas na (Tabela 1) e a deconvolução remove a maior parte do fundo observado.
Além das imagens abordadas aqui, também é possível adicionar tratamentos ou estresse às células antes ou durante a imagem. Por exemplo, a adição de peróxido de hidrogênio terc-butila (tBHP) induz estresse oxidativo, e é possível monitorar mudanças nas mitocôndrias ao longo do tempo após a adição. A adição de β amiloide (Aβ) com um tag fluorescente permite monitorar a distribuição deste peptídeo em relação às mitocôndrias, bem como a estrutura mitocondrial ao longo do tempo. A saúde mitocondrial tem sido fortemente implicada na DA e é amplamente apoiada por desempenhar um papel na toxicidade da Aβ 43,71,72. Notavelmente, o status de diferenciação das células SH-SY5Y afeta a localização do precursor da proteína Aβ (AβPP)85, e experimentos usando AβPP devem ser cuidadosamente construídos.
Como exemplo de como este protocolo pode ser adaptado, mostra-se que a variante fluorescente Aβ(1-42)-HiLyte 647 pode ser adicionada às células coradas com PKMO 15 minutos antes da aquisição de imagens (Figura 1 Suplementar). Os parâmetros de imagem são semelhantes (Tabela Suplementar 2), com a principal diferença sendo que um orifício menor é necessário na obtenção de imagens de mitocôndrias mais estreitas. A aquisição de imagens Aβ-HiLyte647 com STED requer menos excitação geral (6%-8%) e depleção de STED (10%-12%), potência do laser e menos acúmulos (seis). O fechamento do detector também é estendido de 0,1 para 10 ns. Embora a resolução STED de Aβ não seja necessária, a relação sinal-ruído global e o tamanho das partículas Aβ de STED bruto foram melhores do que os das imagens confocais, e a deconvolução subsequente também pode ser realizada. A coleta de imagens STED e a desconvolvência de projeções brutas STED z-stack de Aβ parecem particularmente úteis quando se fundem com imagens STED brutas ou STED desconvolvidas da coloração PKMO (Figura suplementar 1B,C). Ambos os canais foram coletados em uma única etapa de quadro. Medidas de localização dependente do tempo, semelhantes às listadas na Figura 2 e mostradas na Figura 5, quando aplicável, e diferenças na arquitetura das cristas podem ser obtidas após o tratamento de estresse ou outras adições.
Outros métodos possíveis para marcação dupla em STED de células vivas de mitocôndrias não relatados aqui, mas foram relatados por outros incluem o uso de proteínas marcadas com SNAP93, proteínas marcadas com Halo e o uso de outros corantes permeáveis a células com alvos genéricos, como o mtDNA63. Notavelmente, a estratégia de marcação de SNAP e Halo influencia a intensidade e longevidade do sinal de fluorescência resultante na obtenção de imagens94. Além disso, embora este protocolo apresente vários exemplos de análises que podem ser aplicadas a mitocôndrias segmentadas, existem muitas outras análises que pacotes de software podem realizar nessas imagens.

As mitocôndrias são organelas eucarióticas de origem endossimbiótica responsáveis pela regulação de vários processos celulares chave, incluindo metabolismo intermediário e produção de ATP, homeostase iônica, biossíntese lipídica e morte celular programada (apoptose). Essas organelas são topologicamente complexas, contendo um sistema de membrana dupla que estabelece múltiplos subcompartimentos1 (Figura 1A). A membrana mitocondrial externa (MOO) faz interface com o citosol e estabelece contatos diretos interorganelas 2,3. A membrana mitocondrial interna (MIM) é uma membrana conservadora de energia que mantém gradientes iônicos armazenados principalmente como um potencial de membrana elétrica (ΔΨm) para conduzir a síntese de ATP e outros processos que requerem energia 4,5. O IMM é subdividido em membrana de contorno interno (IBM), que é intimamente aprimida ao OMM, e estruturas salientes chamadas cristas que são ligadas pela membrana de cristas (CM). Esta membrana delineia o compartimento mais interno da matriz a partir do espaço intracristal (ICS) e do espaço intermembrana (IMS).
As mitocôndrias possuem uma morfologia dinâmica baseada em processos contínuos e equilibrados de fissão e fusão que são governados por mecanoenzimas da superfamília dasdinaminas6. A fusão permite maior conectividade e formação de redes reticulares, enquanto a fissão leva à fragmentação mitocondrial e possibilita a remoção de mitocôndrias danificadas pela mitofagia7. A morfologia mitocondrial varia de acordo com o tipode tecido 8 e o estágio de desenvolvimento9 e é regulada para permitir que as células se adaptem a fatores como necessidades energéticas 10,11 e estressores 12. Características morfométricas padrão das mitocôndrias, como a extensão da formação da rede (interconectada vs. fragmentada), perímetro, área, volume, comprimento (relação de aspecto), arredondamento e grau de ramificação, podem ser medidas e quantificadas por microscopia óptica padrão, pois os tamanhos dessas características são maiores que o limite de difração da luz (~200 nm)13.
A arquitetura das cristas define a estrutura interna das mitocôndrias (Figura 1B). A diversidade de morfologias das cristas pode ser amplamente categorizada em plana (lamelar ou discoidal) ou tubular-vesicular14. Todas as cristas se fixam na IBM através de estruturas tubulares ou semelhantes a slots, denominadas cristae junctions (CJs) que podem servir para compartimentar o IMS do ICS e o IBM do CM15. A morfologia das cristas é regulada por complexos proteicos chave do IMM, incluindo (1) o sítio de contato mitocondrial e o sistema organizador de cristas (MICOS) que reside nas CJs e estabiliza os contatos IMM-OMM 16, (2) a GTPase da atrofia óptica 1 (OPA1) que regula o remodelamento das cristas17,18,19 e (3) a F1FO ATP sintase que forma conjuntos oligoméricos estabilizadores nas pontas das cristas (CTs)20, 21º. Além disso, o IMM é enriquecido em fosfolipídios não bicamadas, fosfatidiletanolamina e cardiolipina, que estabilizam o IMM altamente curvo22. As cristas também são dinâmicas, demonstrando alterações morfológicas sob diversas condições, como diferentes estados metabólicos 23,24, com diferentes substratos respiratórios 25, sob inanição e estresse oxidativo 26,27, com apoptose 28,29 e com o envelhecimento 30. Recentemente, foi demonstrado que as cristas poderiam sofrer grandes eventos de remodelação em uma escala de tempo de segundos, ressaltando sua natureza dinâmica31. Várias características das cristas podem ser quantificadas, incluindo dimensões das estruturas dentro das cristas individuais (por exemplo, largura da CJ, comprimento e largura da crista) e parâmetros que relacionam cristas individuais com outras estruturas (por exemplo, espaçamento intra-cristas e ângulo incidente das cristas em relação à OMM)32. Estes parâmetros quantificáveis das cristas mostram uma correlação direta com a função. Por exemplo, a extensão da produção de ATP mitocondrial está positivamente relacionada com a abundância de cristas, quantificada como densidade de cristas ou número de cristas normalizado para outra característica (por exemplo, cristas por área de OMM)33,34,35. Como a morfologia do IMM é definida por características nanométricas, compreende a ultraestrutura mitocondrial, que requer técnicas de imagem que forneçam resolução maior que o limite de difração da luz. Como descrito a seguir, tais técnicas incluem microscopia eletrônica e microscopia de super-resolução (nanoscopia).
As células neurais e gliais do sistema nervoso central (SNC) são particularmente dependentes da função mitocondrial. Em média, o cérebro constitui apenas 2% do peso corporal total, mas utiliza 25% da glicose corporal total e é responsável por 20% do consumo de oxigênio corporal, tornando-o vulnerável a prejuízos no metabolismo energético36. As doenças neurodegenerativas progressivas (DNs), incluindo a doença de Alzheimer (DA), a esclerose lateral amiotrófica (ELA), a doença de Huntington (DH), a esclerose múltipla (EM) e a doença de Parkinson (DP), são algumas das patologias mais extensamente estudadas até o momento, com esforços de pesquisa que vão desde a compreensão dos fundamentos moleculares dessas doenças até a busca de potenciais intervenções e prevenção terapêutica. Os DEs estão associados ao aumento do estresse oxidativo originado, em parte, por espécies reativas de oxigênio (EROs) geradas pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC)37, bem como a alterações no manuseio do cálcio mitocondrial 38 e no metabolismo lipídico mitocondrial39. Essas alterações fisiológicas são acompanhadas por defeitos observados na morfologia mitocondrial que estão associados com DA 40,41,42,43,44, ELA 45,46, HD47,48,49, EM 50 e DP 51,52,53. Esses defeitos estruturais e funcionais podem ser acoplados por complexas relações de causa e efeito. Por exemplo, dado que a morfologia das cristas estabiliza as enzimas OXPHOS54, as ROS mitocondriais não são geradas apenas pela ETC, mas também atuam para danificar a infraestrutura na qual a ETC reside, promovendo um ciclo de ROS feed-forward que aumenta a suscetibilidade a danos oxidativos. Além disso, foi demonstrado que a desorganização das cristas desencadeia processos como a liberação de DNA mitocondrial (mtDNA) e vias inflamatórias ligadas a distúrbios autoimunes, metabólicos e relacionados à idade55. Portanto, a análise da estrutura mitocondrial é a chave para uma compreensão completa dos DEs e seus fundamentos moleculares.
Métodos populares de visualização de cristas, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, tomografia eletrônica e tomografia crioeletrônica (crio-TE), e tomografia de raios-X, em particular a tomografia de raios X criomole, têm revelado achados importantes e trabalhos com uma variedade de tipos de amostras56,57,58,59,60. Apesar dos recentes avanços em direção à melhor observação da ultraestrutura organelar, esses métodos ainda vêm com a ressalva de exigir a fixação da amostra e, portanto, não podem capturar diretamente a dinâmica em tempo real das cristas. A microscopia de fluorescência de super-resolução, particularmente nas formas de microscopia de iluminação estruturada (SIM), microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM), microscopia de localização fotoativada (PALM), microscopia de expansão (ExM) e microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), tornaram-se formas populares de visualização de estruturas que requerem resolução abaixo do limite de difração que restringe os métodos clássicos de microscopia óptica. Quando a ExM é usada em conjunto com outra técnica de super-resolução, os resultados são impressionantes, mas a amostra deve ser fixada e corada em gel61. Em comparação, SIM, PALM/STORM e STED foram usados com sucesso com amostras vivas, e novos e promissores corantes que geralmente coram o IMM fornecem uma abordagem nova e fácil para imagens ao vivo da dinâmica das mitocôndrias cristas 62,63,64,65,66. Avanços recentes em corantes vivos para imagens STED melhoraram o brilho e a fotoestabilidade do corante, e esses corantes têm como alvo o IMM em um grau mais alto de especificidade do que seus antecessores. Esses desenvolvimentos permitem a coleta de experimentos de longo prazo em timelapse e z-stack com imagens de super-resolução, abrindo as portas para uma melhor análise de células vivas da ultraestrutura e dinâmica mitocondrial.
Neste estudo, são apresentados protocolos para obtenção de imagens de células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas coradas com o corante PKmito Orange (PKMO) usando STED63. A linhagem celular SH-SY5Y é um derivado subclonado três vezes da linhagem celular parental, SK-N-SH, gerada a partir de biópsia de medula óssea de neuroblastoma metastático67,68,69,70. Essa linhagem celular é um modelo in vitro comumente utilizado na pesquisa de DN, particularmente em doenças como DA, DH e DP, nas quais a disfunção mitocondrial está fortemente implicada10,43,71,72,73. A capacidade de diferenciar células SH-SY5Y em células com fenótipo semelhante a um neurônio por meio da manipulação de meios de cultura tem se mostrado um modelo adequado para pesquisas em neurociência sem depender de células neuronais primárias10,74. Nesse protocolo, ácido retinóico (AR) foi adicionado ao meio de cultura celular para induzir a diferenciação de células SH-SY5Y. A AR é um derivado da vitamina A e demonstrou regular o ciclo celular e promover a expressão de fatores de transcrição que regulam a diferenciação neuronal75. Um protocolo para cultivo e imagem de células vivas de neurônios isolados do hipocampo de ratos também é fornecido. Demonstrou-se que o hipocampo é afetado pela degeneração mitocondrial e, juntamente com o córtex, desempenha um papel importante no envelhecimento e na DN76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

As mitocôndrias desempenham muitos papéis essenciais na célula, incluindo produção de energia, regulação da homeostase de Ca2+ , biossíntese lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Esses processos mediados por mitocôndrias assumem papéis especializados nos neurônios, coordenando o metabolismo aeróbico para atender às altas demandas energéticas dessas células, modulando a sinalização de Ca2+ , fornecendo lipídios para o crescimento e regeneração do axônio e ajustando a produção de ROS para o desenvolvimento e a função neuronal. A disfunção mitocondrial é, portanto, um fator central nas doenças neurodegenerativas. A estrutura e a função mitocondrial estão inextricavelmente ligadas. A membrana interna morfologicamente complexa com dobras estruturais chamadas cristas abriga muitos sistemas moleculares que realizam os processos de assinatura da mitocôndria. As características arquitetônicas da membrana interna são ultraestruturais e, portanto, muito pequenas para serem visualizadas pela microscopia resolvida tradicional limitada por difração. Assim, a maioria dos conhecimentos sobre a ultraestrutura mitocondrial provém da microscopia eletrônica em amostras fixas. No entanto, tecnologias emergentes em microscopia de fluorescência de super-resolução agora fornecem resolução de até dezenas de nanômetros, permitindo a visualização de características ultraestruturais em células vivas. A imagem de super-resolução, portanto, oferece uma capacidade sem precedentes de obter imagens diretas de detalhes finos da estrutura mitocondrial, distribuições de proteínas em nanoescala e dinâmica de cristas, fornecendo novos insights fundamentais que ligam as mitocôndrias à saúde e à doença humanas. Este protocolo apresenta o uso de microscopia de super-resolução de depleção de emissão estimulada (STED) para visualizar a ultraestrutura mitocondrial de células vivas de neuroblastoma humano e neurônios primários de ratos. Este procedimento está organizado em cinco seções: (1) crescimento e diferenciação da linhagem celular SH-SY5Y, (2) isolamento, plaqueamento e crescimento de neurônios primários do hipocampo de ratos, (3) procedimentos para coloração de células para imagens STED vivas, (4) procedimentos para experimentos STED de células vivas usando um microscópio STED para referência, e (5) orientação para segmentação e processamento de imagens usando exemplos para medir e quantificar características morfológicas da membrana interna.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Este protocolo descreve as condições de crescimento celular para células cultivadas e primárias com foco em imagens STED de células vivas e subsequentes análises de cristas mitocondriais. Projeções feitas com ImageJ de mitocôndrias de células SH-SY5Y indiferenciadas (Figura 3A) e SH-SY5Y diferenciadas por AR (Figura 3B) podem ser coletadas como pilhas z com confocal e STED tradicionais, e as imagens STED brutas podem então ser desconenvolvidas. Imagens com timelapse também podem ser realizadas e posteriormente desconvolvidas (Figura 3C,D). Usando parâmetros de imagem ligeiramente diferentes para neurônios primários do hipocampo de ratos (Tabela 1), imagens STED confocais e brutas podem ser adquiridas como pilhas z, e as imagens STED brutas podem ser desconvolvidas (Figura 4A). Imagens em timelapse de mitocôndrias de neurônios primários também são possíveis (Figura 4B). Em geral, as imagens de lapso de tempo devem ser capazes de mostrar eventos dinâmicos mitocondriais.
Quando as projeções STED brutas e STED z-stack desconvolvidas das amostras usadas para segmentação parecem consistentes, medições quantitativas são realizadas. O plugin TWS usa a imagem STED desconvolvida para segmentar para fazer uma máscara de probabilidade, que é então usada para criar uma máscara binária das cristas para obter parâmetros de tamanho e forma (Figura 5A). As regiões dessa máscara são salvas no gerenciador de ROI e podem ser aplicadas à imagem STED bruta se desejado para medir diferenças na intensidade relativa. As projeções STED deconvolved também podem ser usadas para determinar a periodicidade e densidade das cristas em uma determinada área (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figura 1: Morfologia mitocondrial. As mitocôndrias possuem um sistema de duas membranas que define diferentes subcompartimentos (A). Cristae são dobras da membrana interna com características definidas (B). Abreviações: OMM, membrana mitocondrial externa; ICS, espaço intracristal; IMS, espaço intermembrana; MC, membrana das cristas; IBM, membrana de contorno interno; MIM, membrana mitocondrial interna; TC, ponta das cristas; CJ, junção de cristae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Figura 2: Esquema do fluxo de trabalho. As células SH-SY5Y ou neurônios primários do hipocampo de rato são cultivados em uma cobertura revestida de PDL. As células SH-SY5Y são cultivadas em paralelo para permanecerem indiferenciadas ou submetidas à diferenciação da AR ao longo de seis dias. Neurônios primários do hipocampo de ratos foram cultivados em uma cobertura revestida com PDL após serem isolados de seções hipocampais por sete dias. Uma vez prontas para serem imageadas, as células foram coradas com PKMO e imageadas com STED. As imagens STED brutas são então desconvolvidas e as imagens desconvolvidas são processadas em FIJI para obter medidas de tamanho e forma, como densidade de cristas, área, perímetro, circularidade e proporção de cristas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figura 3: Imagem das mitocôndrias em células SH-SY5Y. Projeções representativas de STED confocal (esquerda), STED bruta (centro) e desconvolvida de Huygens (direita) de mitocôndrias de células SH-SY5Y não diferenciadas (A) e diferenciadas por AR (B) com coloração PKMO são mostradas. Um timelapse com intervalos de 30 s e 5 iterações de células SH-SY5Y diferenciadas por AR é mostrado (C) com regiões selecionadas (caixas brancas) expandidas sobre (D) usando imagens dimensionadas dessas regiões sem interpolação. Barras de escala: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figura 4: Imagem das mitocôndrias em neurônios primários do hipocampo de ratos. Projeções representativas de STED (esquerda), STED bruto (centro) e STED desconvolvido de Huygens (direita) de mitocôndrias de neurônios primários do hipocampo de ratos são mostradas (A). Um timelapse com intervalos de 25 s e 5 iterações de mitocôndrias nesses neurônios é mostrado (B). Barras de escala: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figura 5: Processamento de imagens STED desconvolvidas no ImageJ. O uso representativo do plugin Trainable Weka Segmentation para medir o tamanho e a forma das cristas é mostrado (A). Da esquerda para a direita, as seguintes imagens são mostradas: a imagem STED desconvolvida, o mapa de probabilidade baseado na segmentação do plugin TWS, a máscara de limiar em FIJI usando o mapa de probabilidade como entrada, a máscara com as ROIs delineadas e as ROIs sobrepostas à imagem STED desconvolvida original. As medidas resultantes de área, perímetro, circularidade e proporção correspondentes a esses objetos podem ser encontradas na Tabela Suplementar 1. Um gráfico de linhas usando a imagem STED desconvolvida para medir distâncias pico-a-pico como uma leitura para a densidade de cristas é mostrado (B). Barras de escala: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Tamanho do pixel (nm)</td>
			<td>Tempo de permanência (μs)</td>
			<td>Linha acc.</td>
			<td>Excitação de 561 nm durante a aquisição de STED (%)</td>
			<td>Potência de depleção STED de 775 nm (%)</td>
			<td>Tamanho do passo (nm)</td>
			<td>Pinhole (AU)</td>
			<td>Intervalo(s) de timelapse</td>
			<td>Iterações de timelapse</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y indiferenciado</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Differe-ntiated SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Neurônios primários</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">NOTA: O tamanho do pixel pode variar com base nos requisitos de imagem e na intenção de desconvolver imagens. A amostragem adequada é necessária para a deconvolução. Os tamanhos de pixel para imagens STED brutas sem deconvolução podem ir até 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Resumo dos parâmetros de aquisição de STED. As configurações usadas para imagens STED 2D para cada tipo de célula, SH-SY5Y indiferenciado, SH-SY5Y diferenciado por AR e neurônios primários do hipocampo de ratos são exibidos. Para todos os lapsos de tempo, 5 iterações foram tomadas com intervalos variáveis com base no tamanho do ROI.
Figura suplementar 1: Imagem de células SH-SY5Y com adição de β amiloide (Aβ). Imagens representativas confocais (esquerda), STED brutas (centro) e STED desconvolvidas (direita) de células SH-SY5Y diferenciadas por AR com coloração PKMO (superior) e Aβ-HiLyte647 (inferior) são mostradas (A). Projeções z-stack mescladas de PKMO STED bruto (verde) com STED Aβ bruto (magenta) (B) ou PKMO STED desconvolvido (verde) com STED Aβ desconvolvido (magenta) (C) são mostradas. Barras de escala: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Medidas de tamanho e forma das cristas segmentadas. As medidas de tamanho e forma de área (μm2), perímetro (μm), circularidade e proporção, correspondentes aos objetos delineados na Figura 5A a partir de mitocôndrias segmentadas, são mostradas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Resumo dos parâmetros de aquisição com amostras de β amiloide. As configurações usadas para imagens STED 2D de PKMO e Aβ-HiLyte647 em células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas por AR são exibidas. Confocal de Aβ-HiLyte647 pode ser usado sozinho, pois não há estrutura específica para resolver; Imagens STED de Aβ-HiLyte647 são mostradas aqui para tamanhos de partículas menores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 1: Protocolo de tratamento com β amiloide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho para a propagação, diferenciação e coloração de células SH-SY5Y cultivadas e neurônios primários do hipocampo de ratos para visualização e análise da ultraestrutura mitocondrial usando microscopia de depleção de emissão estimulada (STED).

Usando imagens STED de células vivas para visualizar a ultraestrutura da membrana interna mitocondrial em modelos de células neuronais

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Nosso programa de pesquisa se concentra em aspectos estruturais e funcionais das mitocôndrias, particularmente no que se refere à disfunção relacionada ao envelhecimento. Para isso, utilizamos uma ampla gama de técnicas biofísicas, bioquímicas e estruturais para explorar os mecanismos básicos do envelhecimento mitocondrial e desenvolver intervenções terapêuticas para preservar e restaurar a saúde mitocondrial. A função e a estrutura mitocondrial estão inextricavelmente relacionadas.As técnicas padrão de microscopia de luz são adequadas para medir características mitocondriais em larga escala, como morfologia básica e estruturas de rede. A análise da ultraestrutura mitocondrial ou de características que exigem maior resolução do que a proporcionada pela microscopia óptica tradicional é tipicamente feita usando microscopia eletrônica ou tomografia em amostras fixas. A microscopia de superresolução é uma técnica de imagem baseada em fluorescência que mede características além do limite de difração.Para mitocôndrias, isso inclui medidas de distribuição de proteínas em escala nano e arquitetura de cristas. O protocolo de imagem estável descrito aqui permite que os pesquisadores meçam a estrutura detalhada da membrana interna em células vivas. A imagem de células vivas permite observar e analisar quantitativamente características complexas de cristas em condições fisiologicamente relevantes sem a necessidade de fixação da amostra.Isso dará aos pesquisadores novos insights sobre as mudanças dinâmicas que ocorrem em características ultra-estruturais e suas respostas temporais a estressores e compostos farmacológicos.