Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Первичные нейроны гиппокампа крыс были предоставлены доктором Джорджем Ликотрафитисом и Шиджу Гу из Департамента биомедицинской инженерии Университета Коннектикута (Сторрс, Коннектикут, США). Прибор Abberior STED, размещенный в Центре передовой световой микроскопии в Центре открытых исследовательских ресурсов и оборудования, был приобретен на грант NIH S10OD023618 присужден Кристоферу О'Коннеллу. Это исследование было профинансировано грантом NIH R01AG065879 присуждено Натану Н. Алдеру.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Авторам нечего раскрывать.

В этом протоколе представлено использование клеточной линии нейробластомы человека SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы с новым красителем PKMO, нацеленным на IMM, для визуализации живых клеток ЗППП. Из-за новизны PKMO, в настоящее время мало публикаций об использовании этого красителя для визуализации ЗППП в реальном времени. Использование этих типов клеток для визуализации ЗППП сопряжено с определенными трудностями, в частности, потому, что нейрональные клетки имеют более узкие митохондрии. Одним из ограничений этого протокола является используемый краситель PKMO, так как он может быть токсичен для клеток. Различные клетки и клеточные линии по-разному реагируют на краситель, поэтому может потребоваться корректировка концентрации красителя и времени инкубации для оптимизации результатов для получения сильного сигнала без вреда для клеток. Предлагаемое решение заключается в снижении концентрации и увеличении времени окрашивания63; Однако это может привести к ухудшению окрашивания, не увеличивая жизнеспособность клеток.
Как и PKMO, коммерческий краситель Live Orange mito (Таблица материалов) также проявляет некоторую токсичность для клеток. Этот краситель был использован для различных культивируемых клеток, но не смог успешно продемонстрировать сопоставимое окрашивание в RA-дифференцированных клетках SH-SY5Y с теми же параметрами, что и их недифференцированные аналоги (наши неопубликованные наблюдения). Тем не менее, протоколы окрашивания могут быть оптимизированы для этого зонда и выбранных типов клеток. Для этого красителя использовалось время стробирования детектора от 1-1,05 до 7-7,05 нс, при этом все остальные параметры, указанные в таблице 1 , оставались прежними. Как правило, окрашивание клеток 200-250 нМ живым оранжевым мито в течение 45 мин давало результаты, сопоставимые с результатами ПКМО. Окрашивание с более высокой концентрацией в течение меньшего времени или окрашивание с более низкой концентрацией в течение того же периода времени или немного дольше может дать различные результаты и может быть благоприятным для других типов клеток или условий роста.
Визуализация первичных нейронов гиппокампа крыс отличается от иммортализированных клеток из-за природы проекций аксона и дендритов, а также распределения митохондрий во время визуализации. Одна из сложностей в этой части протокола заключается в том, что плотность посева определяет, смогут ли первичные культуры прижиться и расти здоровыми, а при более высоких плотностях проекции имеют тенденцию зарастать к DIV 10. Таким образом, митохондрии, полученные из этих первичных нейронов, скорее всего, будут поступать из тела клетки, а не из проекций; Тем не менее, успешный рост при более низкой начальной плотности клеток дает лучшие результаты визуализации в более поздние периоды роста. Ключевым моментом является обеспечение низкого фона и расфокусированного света, чтобы получить наилучшую контрастность для STED. Чтобы решить проблемы, связанные с клеточной популяцией, культивирование первичных клеток гиппокампа в питательной среде нейронов с добавлением B27 предотвращает рост глиальных клеток, и источник сообщает, что <5% клеток являются астроцитами, а отсутствие добавки NbActiv1 в питательной среде снижает количество астроцитов в культурах до <2%87. Как для культивируемых клеток SH-SY5Y, так и для первичных нейронов гиппокампа крысы, покрытие PDL, используемое для роста, способствует фоновому помутнению на изображениях. Достаточное соотношение сигнал/шум достигается с помощью настроек, указанных в таблице 1, а деконволюция удаляет большую часть наблюдаемого фона.
В дополнение к визуализации, описанной здесь, также можно добавить лечение или стресс для клеток до или во время визуализации. Например, добавление трет-бутиловой перекиси водорода (tBHP) вызывает окислительный стресс, и можно отслеживать изменения в митохондриях с течением времени после добавления. Добавление амилоид-β (Aβ) с флуоресцентной меткой позволяет отслеживать распределение этого пептида по отношению к митохондриям, а также митохондриальную структуру с течением времени. Здоровье митохондрий в значительной степени связано с болезнью Альцгеймера, и широко доказано, что оно играет роль в токсичности Aβ 43,71,72. Примечательно, что статус дифференцировки клеток SH-SY5Y влияет на локализацию предшественника белка Aβ (AβPP)85, и эксперименты с использованием AβPP должны быть тщательно построены.
В качестве примера того, как этот протокол может быть адаптирован, показано, что флуоресцентный вариант Aβ(1-42)-HiLyte 647 может быть добавлен к клеткам, окрашенным PKMO, за 15 минут до визуализации (дополнительный рисунок 1). Параметры визуализации аналогичны (Дополнительная таблица 2), с основным отличием в том, что при визуализации более узких митохондрий требуется меньшее отверстие. Визуализация Aβ-HiLyte647 с STED требует меньшего общего возбуждения (6%-8%) и истощения STED (10%-12%) мощности лазера и меньшего количества накоплений (шесть). Стробирование детектора также увеличено с 0,1 до 10 нс. Несмотря на то, что разрешение STED Aβ не является обязательным, общее отношение сигнал/шум и размер частиц Aβ в необработанном STED были лучше, чем у конфокальных изображений, и последующая деконволюция также может быть выполнена. Сбор изображений STED и деконволюция необработанных проекций STED z-stack Aβ представляется особенно полезным при объединении с необработанными изображениями STED или деконволюционными изображениями STED пятна PKMO (дополнительный рисунок 1B, C). Оба канала были собраны с шагом одного кадра. Измерения зависящей от времени локализации, аналогичные тем, которые перечислены на рисунке 2 и показаны на рисунке 5, где это применимо, и различия в архитектуре кристаллов могут быть получены после стрессовой обработки или других дополнений.
Другие возможные методы двойного мечения в живых клетках митохондрий, о которых здесь не сообщается, но о которых сообщалось другими, включают использование SNAP-меченых белков93, гало-меченных белков и использование других проницаемых для клеток красителей с генерическими мишенями, такими как мтДНК63. Примечательно, что стратегия мечения SNAP и Halo влияет на результирующую интенсивность и продолжительность флуоресцентного сигнала при визуализации94. Кроме того, несмотря на то, что в этом протоколе представлено несколько примеров анализа, который может быть применен к сегментированным митохондриям, существует множество других анализов, которые программные пакеты могут выполнять с этими изображениями.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Митохондрии играют много важных ролей в клетке, включая производство энергии, регуляцию гомеостазаCa2+ , биосинтез липидов и производство активных форм кислорода (АФК). Эти митохондриальные опосредованные процессы берут на себя специализированные роли в нейронах, координируя аэробный метаболизм для удовлетворения высоких энергетических потребностей этих клеток, модулируя передачу сигналов Ca2+ , обеспечивая липиды для роста и регенерации аксонов и настраивая производство АФК для развития и функционирования нейронов. Таким образом, митохондриальная дисфункция является основным фактором нейродегенеративных заболеваний. Структура и функции митохондрий неразрывно связаны. Морфологически сложная внутренняя мембрана со структурными складками, называемыми кристами, содержит множество молекулярных систем, которые выполняют сигнатурные процессы митохондрии. Архитектурные особенности внутренней мембраны являются ультраструктурными и, следовательно, слишком малы, чтобы их можно было визуализировать с помощью традиционной дифракционно-ограниченной разрешающей микроскопии. Таким образом, большая часть информации о ультраструктуре митохондрий была получена с помощью электронной микроскопии на фиксированных образцах. Тем не менее, новые технологии флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения в настоящее время обеспечивают разрешение до десятков нанометров, что позволяет визуализировать ультраструктурные особенности живых клеток. Таким образом, визуализация со сверхвысоким разрешением предлагает беспрецедентную возможность прямого изображения мельчайших деталей митохондриальной структуры, наноразмерного распределения белков и динамики кристаллов, обеспечивая фундаментальные новые идеи, которые связывают митохондрии со здоровьем и болезнями человека. Этот протокол представляет собой использование микроскопии со сверхвысоким разрешением со стимулированным истощением эмиссии (STED) для визуализации митохондриальной ультраструктуры живых клеток нейробластомы человека и первичных нейронов крыс. Эта процедура состоит из пяти разделов: (1) рост и дифференцировка клеточной линии SH-SY5Y, (2) выделение, покрытие и рост первичных нейронов гиппокампа крысы, (3) процедуры окрашивания клеток для визуализации живых ЗППП, (4) процедуры экспериментов с живыми клетками, ЗППП с использованием микроскопа ЗПТП для справки, и (5) руководство по сегментации и обработке изображений с использованием примеров для измерения и количественной оценки морфологических особенностей внутренней мембраны.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Этот протокол описывает условия роста культивируемых и первичных клеток с акцентом на визуализацию ЗППП живых клеток и последующий анализ митохондриальных крист. Проекции, сделанные с помощью ImageJ митохондрий из недифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3A) и RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (рис. 3B), могут быть собраны в виде z-стеков с традиционными конфокальными и STED, а затем необработанные изображения STED могут быть деконволютированы. Также может быть выполнена таймлапс-визуализация, которая впоследствии деконволюционируется (рис. 3C, D). Используя несколько отличающиеся параметры визуализации для первичных нейронов гиппокампа крысы (Таблица 1), конфокальные и необработанные изображения ЗППП могут быть получены в виде z-стеков, а необработанные изображения ЗППП могут быть деконволютированы (Рисунок 4А). Также возможна таймлапс-визуализация митохондрий первичных нейронов (рис. 4B). В целом, интервальные изображения должны быть способны отображать митохондриальные динамические события.
Когда необработанные и деконволютированные проекции z-стека STED из выборок, используемых для сегментации, кажутся согласованными, выполняются количественные измерения. Плагин TWS использует деконволютированное изображение STED для сегментации для создания вероятностной маски, которая затем используется для создания бинарной маски крист для получения параметров размера и формы (рисунок 5A). Области из этой маски сохраняются в диспетчере ROI и при необходимости могут быть применены к необработанному изображению STED для измерения различий в относительной интенсивности. Деконволютированные проекции STED также могут быть использованы для определения периодичности и плотности кристаллов в заданной области (рис. 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Рисунок 1: Морфология митохондрий. Митохондрии имеют двухмембранную систему, которая определяет различные подкомпартменты (А). Кристы представляют собой складки внутренней мембраны с определенными особенностями (B). Сокращения: ОММ, наружная митохондриальная мембрана; ICS, внутрикристаллическое пространство; IMS, межмембранное пространство; CM, кристальная мембрана; IBM, внутренняя граничная мембрана; МПМ, внутренняя митохондриальная мембрана; CT, кристальный наконечник; CJ, cristae junction. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Рисунок 2: Схема рабочего процесса. Клетки SH-SY5Y или первичные нейроны гиппокампа крысы выращивают на покровном стекле, покрытом PDL. Клетки SH-SY5Y выращиваются параллельно, чтобы оставаться недифференцированными или подвергаться дифференцировке РА в течение шести дней. Первичные нейроны гиппокампа крыс выращивали на покрытом PDL покровном стекле после того, как они были изолированы от срезов гиппокампа в течение семи дней. После того, как клетки были готовы к визуализации, их окрашивали PKMO и визуализировали STED. Затем необработанные изображения STED деконволюционируются, а деконволюционные изображения обрабатываются в FIJI для получения измерений размера и формы, таких как кристальная плотность, площадь, периметр, округлость и соотношение сторон. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Рисунок 3: Визуализация митохондрий в клетках SH-SY5Y. Показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные проекции изображений STED (справа) митохондрий из недифференцированных (A) и RA-дифференцированных (B) клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO. Показан таймлапс с интервалами 30 с и 5 итерациями RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y (C) с расширенными (D) выделенными областями (белыми прямоугольниками) с использованием масштабированных изображений этих областей без интерполяции. Масштабные линейки: A,B, 250 нм; C,D, 1 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Рисунок 4: Визуализация митохондрий в первичных нейронах гиппокампа крысы. На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные STED (в центре) и деконволюционные STED-проекции Гюйгенса (справа) на митохондрии первичных нейронов гиппокампа крыс (A). Показан таймлапс с интервалом 25 с и 5 итерациями митохондрий в этих нейронах (B). Масштабные линейки: А, 250 нм; B , 1 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Рисунок 5: Обработка деконволютированных STED-изображений в ImageJ. Показано репрезентативное использование плагина Trainable Weka Segmentation для измерения размера и формы кристы (A). Слева направо показаны следующие изображения: деконволюрированное изображение STED, карта вероятностей, основанная на сегментации из плагина TWS, маска из порогового значения в FIJI с использованием карты вероятностей в качестве входных данных, маска с очерченными ROI и ROI, наложенные на исходное деконволютированное изображение STED. Результирующие измерения площади, периметра, окружности и соотношения сторон, соответствующие этим объектам, можно найти в Дополнительной таблице 1. На рисунке показан линейный график с использованием деконволютированного изображения STED для измерения расстояний от пика до пика в качестве считывания плотности кристы (B). Масштабные линейки: 0,5 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Размер пикселя (нм)</td>
			<td>Время выдержки (мкс)</td>
			<td>Линейный акк.</td>
			<td>Возбуждение 561 нм при регистрации STED (%)</td>
			<td>775 нм Мощность истощения STED (%)</td>
			<td>Размер шага (нм)</td>
			<td>Точечное отверстие (AU)</td>
			<td>Интервал таймлапса (с)</td>
			<td>Итерации таймлапса</td>
		</tr><tr><td>Недифференциальный SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Дифференциированный SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Первичные нейроны</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пикселя может варьироваться в зависимости от требований к изображению и намерения деконволюции изображений. Для деконволюции требуется надлежащий отбор проб. Размер пикселя для необработанных изображений STED без деконволюции может достигать 30 нм.</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Сводные параметры сбора STED. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации STED для каждого типа клеток: недифференцированного SH-SY5Y, RA-дифференцированного SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы. Для всех таймлапсов было выполнено 5 итераций с различными интервалами в зависимости от размера ROI.
Дополнительный рисунок 1: Визуализация клеток SH-SY5Y с добавлением амилоид-β (Aβ). На рисунке показаны репрезентативные конфокальные (слева), необработанные (в центре) и деконволюционные изображения STED (справа) RA-дифференцированных клеток SH-SY5Y с окрашиванием PKMO (вверху) и Aβ-HiLyte647 (внизу) (A). Показаны объединенные проекции z-стека необработанного PKMO STED (зеленый) с необработанным Aβ STED (пурпурный) (B) или деконволюционного PKMO STED (зеленый) с деконволюционным Aβ STED (пурпурный) (C). Масштабные линейки: 0,5 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 1: Размеры и форма сегментированных крист. Показаны размеры и формы площади (мкм2), периметра (мкм), округлости и соотношения сторон, соответствующие объектам, изображенным на рисунке 5А из сегментированных митохондрий. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительная таблица 2: Сводные параметры сбора данных с образцами β амилоида. Отображаются настройки, используемые для 2D-визуализации PKMO и Aβ-HiLyte647 в недифференцированных и RA-дифференцированных клетках SH-SY5Y. Конфокальный Aβ-HiLyte647 может быть использован отдельно, так как не существует специфической структуры, которую нужно разрешить; Здесь показаны STED-изображения Aβ-HiLyte647 для частиц меньшего размера. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>
Дополнительный файл 1: Протокол лечения амилоидной β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Этот протокол представляет собой рабочий процесс для размножения, дифференцировки и окрашивания культивируемых клеток SH-SY5Y и первичных нейронов гиппокампа крысы для визуализации и анализа ультраструктуры митохондрий с использованием микроскопии истощения вынужденной эмиссии (STED).

Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Наша исследовательская программа сосредоточена на структурных и функциональных аспектах митохондрий, особенно в том, что касается дисфункции, связанной со старением. С этой целью мы используем широкий спектр биофизических, биохимических и структурных методов для изучения основных механизмов митохондриального старения и разработки терапевтических вмешательств для сохранения и восстановления здоровья митохондрий. Функция и структура митохондрий неразрывно связаны.Стандартные методы световой микроскопии подходят для измерения крупномасштабных митохондриальных особенностей, таких как базовая морфология и сетевые структуры. Анализ ультраструктуры или особенностей митохондрий, требующих более высокого разрешения, чем та, которое обеспечивает традиционная оптическая микроскопия, обычно выполняется с помощью электронной микроскопии или томографии на фиксированных образцах. Микроскопия сверхвысокого разрешения — это метод визуализации, основанный на флуоресценции, который измеряет особенности за пределами дифракционного предела.Для митохондрий это включает в себя измерения распределения белков в наноразмерах и архитектуры кристаллов. Описанный здесь протокол визуализации позволяет исследователям измерить детальную структуру внутренней мембраны в живых клетках. Визуализация живых клеток позволяет нам наблюдать и количественно анализировать сложные особенности крист в физиологически значимых условиях без необходимости фиксации образца.Это даст исследователям новое представление о динамических изменениях, которые происходят в ультраструктурных элементах и их временных реакциях на стрессоры и фармакологические соединения.