Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
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Las neuronas primarias del hipocampo de rata fueron suministradas por el Dr. George Lykotrafitis y Shiju Gu del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Connecticut (Storrs, CT, EE. UU.). El instrumento Abberior STED, alojado en la Instalación de Microscopía Óptica Avanzada en el Centro de Recursos y Equipos de Investigación Abierta, fue adquirido con una subvención de los NIH S10OD023618 otorgada a Christopher O'Connell. Esta investigación fue financiada por una subvención de los NIH R01AG065879 otorgada a Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo presenta el uso de la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y y neuronas primarias del hipocampo de rata con el nuevo colorante PKMO dirigido a IMM para la obtención de imágenes de ETS de células vivas. Debido a la novedad de la PKMO, actualmente hay poco material publicado que utilice este colorante para la obtención de imágenes de ETS en vivo. El uso de estos tipos de células para la obtención de imágenes de ETS plantea desafíos, específicamente porque las células neuronales tienen mitocondrias más estrechas. Una limitación de este protocolo es el colorante PKMO utilizado, ya que puede ser tóxico para las células. Las diferentes células y líneas celulares responden de manera diferente al colorante, por lo tanto, es posible que se requieran ajustes en la concentración del colorante y el tiempo de incubación para optimizar los resultados de una señal fuerte sin dañar las células. Una solución sugerida es disminuir la concentración y aumentar el tiempo de tinción63; sin embargo, esto puede dar lugar a una tinción más deficiente sin aumentar la viabilidad celular.
Al igual que el PKMO, el colorante comercial Live Orange mito (Table of Materials) también presenta cierta toxicidad celular. Este colorante se utilizó para una variedad de células cultivadas, pero no pudo exhibir una tinción comparable en células SH-SY5Y diferenciadas por AR con éxito con los mismos parámetros que sus contrapartes indiferenciadas (nuestras observaciones no publicadas). Sin embargo, los protocolos de tinción susceptible pueden optimizarse para esta sonda y los tipos de células elegidos. Con este colorante, se utilizaron tiempos de activación del detector de 1-1,05 a 7-7,05 ns, permaneciendo todos los demás parámetros de la Tabla 1 iguales. En general, la tinción de células con 200-250 nM de mito de naranja vivo durante 45 min produjo resultados comparables a los que mostraron los resultados de PKMO. La tinción de mayor concentración durante menos tiempo o la tinción de menor concentración durante la misma cantidad de tiempo o un poco más puede producir resultados diferentes y puede ser favorable para otros tipos de células o condiciones de crecimiento.
La obtención de imágenes de las neuronas primarias del hipocampo de rata difiere de las células inmortalizadas debido a la naturaleza de las proyecciones de axones y dendritas, así como a la distribución mitocondrial en el momento de la obtención de imágenes. Una dificultad en esta parte del protocolo es que la densidad de siembra determina si los cultivos primarios podrán adherirse y crecer saludablemente, y a densidades más altas, las proyecciones tienden a crecer en exceso en DIV 10. Por lo tanto, es probable que las mitocondrias obtenidas de estas neuronas primarias provengan del cuerpo celular y no de las proyecciones; Sin embargo, el crecimiento exitoso a partir de una densidad celular inicial más baja produce mejores resultados de imagen en tiempos de crecimiento posteriores. La clave es garantizar un fondo bajo y una luz desenfocada para tener el mejor contraste para STED. Para abordar las preocupaciones relacionadas con la población celular, el cultivo de células primarias del hipocampo en medios de crecimiento neuronal suplementados con B27 previene el crecimiento de células gliales, y la fuente informa que el <5% de las células son astrocitos y la ausencia de suplemento de NbActiv1 en el medio de crecimiento reduce el número de astrocitos en cultivos al <2%87. Tanto para las células SH-SY5Y cultivadas como para las neuronas primarias del hipocampo de rata, el recubrimiento PDL utilizado para el crecimiento contribuye a la neblina de fondo en las imágenes. Se logra una relación señal/ruido suficiente con los ajustes indicados en el (Cuadro 1) y la deconvolución elimina la mayor parte del fondo observado.
Además de las imágenes que se tratan aquí, también es posible agregar tratamientos o estrés a las células antes o durante la obtención de imágenes. Por ejemplo, la adición de peróxido de hidrógeno terc-butilo (tBHP) induce estrés oxidativo, y es posible monitorear los cambios en las mitocondrias a lo largo del tiempo después de la adición. La adición de amiloide-β (Aβ) con una etiqueta fluorescente permite monitorizar la distribución de este péptido en relación con las mitocondrias, así como con la estructura mitocondrial a lo largo del tiempo. La salud mitocondrial ha sido fuertemente implicada en la EA y está ampliamente respaldada para desempeñar un papel en la toxicidad de Aβ 43,71,72. En particular, el estado de diferenciación de las células SH-SY5Y afecta a la localización del precursor de la proteína Aβ (AβPP)85, y los experimentos que utilizan AβPP deben construirse cuidadosamente.
Como ejemplo de cómo se puede adaptar este protocolo, se muestra que la variante fluorescente Aβ(1-42)-HiLyte 647 se puede añadir a las células teñidas con PKMO 15 minutos antes de la obtención de imágenes (Figura suplementaria 1). Los parámetros de imagen son similares (Tabla suplementaria 2), con la principal diferencia de que se necesita un orificio más pequeño cuando se obtienen imágenes de mitocondrias más estrechas. La obtención de imágenes de Aβ-HiLyte647 con STED requiere menos excitación general (6%-8%) y depleción de STED (10%-12%) de potencia láser y menos acumulaciones (seis). La compuerta del detector también se amplía de 0,1 a 10 ns. Aunque la resolución STED de Aβ no es necesaria, la relación señal-ruido general y el tamaño de partícula Aβ de STED sin procesar fueron mejores que los de las imágenes confocal, y también se puede realizar una deconvolución posterior. La recopilación de imágenes STED y la desconvolucionación de proyecciones STED en bruto de la pila z de Aβ parece particularmente útil cuando se fusionan con imágenes STED en bruto o STED desconvolucionadas de la tinción PKMO (Figura suplementaria 1B,C). Ambos canales se recopilaron en un solo paso de fotograma. Se pueden obtener mediciones de la localización dependiente del tiempo, similares a las enumeradas en la Figura 2 y mostradas en la Figura 5, cuando corresponda, y las diferencias en la arquitectura de las crestas después del tratamiento de estrés u otras adiciones.
Otros métodos posibles para el doble marcaje en células vivas de las mitocondrias de las ETS que no se informan aquí, pero que han sido informados por otros, incluyen el uso de proteínas93 marcadas con SNAP, proteínas marcadas con Halo y el uso de otros colorantes permeables a las células con objetivos genéricos, como el ADNmt63. En particular, la estrategia de marcaje de SNAP y el etiquetado de Halo influye en la intensidad de la señal de fluorescencia resultante y en la longevidad de la obtención de imágenes94. Además, aunque este protocolo presenta varios ejemplos de análisis que se pueden aplicar a mitocondrias segmentadas, hay muchos otros análisis que los paquetes de software pueden realizar en estas imágenes.

Las mitocondrias son orgánulos eucariotas de origen endosimbiótico que se encargan de regular varios procesos celulares clave, como el metabolismo intermediario y la producción de ATP, la homeostasis iónica, la biosíntesis lipídica y la muerte celular programada (apoptosis). Estos orgánulos son topológicamente complejos, conteniendo un sistema de doble membrana que establece múltiples subcompartimentos1 (Figura 1A). La membrana mitocondrial externa (OMM) interactúa con el citosol y establece contactos directos entre orgánulos 2,3. La membrana mitocondrial interna (IMM) es una membrana que conserva la energía y mantiene los gradientes iónicos almacenados principalmente como un potencial de membrana eléctrica (ΔΨm) para impulsar la síntesis de ATP y otros procesos que requieren energía 4,5. El IMM se subdivide a su vez en la membrana límite interna (IBM), que está estrechamente adherida al OMM, y estructuras sobresalientes llamadas crestas que están unidas por la membrana de crestas (CM). Esta membrana delinea el compartimento más interno de la matriz del espacio intracristalino (ICS) y el espacio intermembrana (IMS).
Las mitocondrias tienen una morfología dinámica basada en procesos continuos y equilibrados de fisión y fusión que están gobernados por mecanoenzimas de la superfamilia de las dinaminas6. La fusión permite aumentar la conectividad y la formación de redes reticulares, mientras que la fisión conduce a la fragmentación mitocondrial y permite la eliminación de las mitocondrias dañadas por la mitofagia7. La morfología mitocondrial varía según el tipo de tejido8 y la etapa de desarrollo9 y está regulada para permitir que las células se adapten a factores que incluyen las necesidades energéticas 10,11 y los factores estresantes 12. Las características morfométricas estándar de las mitocondrias, como la extensión de la formación de la red (interconectada vs. fragmentada), el perímetro, el área, el volumen, la longitud (relación de aspecto), la redondez y el grado de ramificación, pueden medirse y cuantificarse mediante microscopía óptica estándar porque los tamaños de estas características son mayores que el límite de difracción de la luz (~200 nm)13.
La arquitectura de las crestas define la estructura interna de las mitocondrias (Figura 1B). La diversidad de morfologías de las crestas se puede clasificar ampliamente como planas (laminares o discoidales) o tubulares-vesiculares14. Todas las crestas se unen en el IBM a través de estructuras tubulares o en forma de ranura denominadas uniones de crestas (CJ) que pueden servir para compartimentar el IMS del ICS y el IBM del CM15. La morfología de las crestas está regulada por complejos proteicos clave de la IMM, que incluyen (1) el sitio de contacto mitocondrial y el sistema organizador de crestas (MICOS) que reside en los CJ y estabiliza los contactos IMM-OMM 16, (2) la GTPasa de atrofia óptica 1 (OPA1) que regula la remodelación de las crestas17,18,19, y (3) la F1FO ATP sintasa que forma ensamblajes oligoméricos estabilizadores en las puntas de las crestas (CT)20, Artículo 21. Además, el IMM está enriquecido en fosfolípidos no bicapa fosfatidiletanolamina y cardiolipina que estabilizan el IMM22 altamente curvado. Las crestas también son dinámicas, mostrando cambios morfológicos bajo diversas condiciones, como diferentes estados metabólicos 23,24, con diferentes sustratos respiratorios 25, bajo inanición y estrés oxidativo 26,27, con apoptosis 28,29 y con envejecimiento 30. Recientemente se ha demostrado que las crestas podrían sufrir grandes eventos de remodelación en una escala de tiempo de segundos, lo que subraya su naturaleza dinámica31. Se pueden cuantificar varias características de las crestas, incluidas las dimensiones de las estructuras dentro de las crestas individuales (p. ej., el ancho de CJ, la longitud y el ancho de las crestas) y los parámetros que relacionan las crestas individuales con otras estructuras (p. ej., el espaciamiento intra-crestas y el ángulo de incidencia de las crestas en relación con el OMM)32. Estos parámetros de crestas cuantificables muestran una correlación directa con la función. Por ejemplo, el grado de producción de ATP mitocondrial se relaciona positivamente con la abundancia de crestas, cuantificada como densidad de crestas o número de crestas normalizado a otra característica (p. ej., crestas por área OMM)33,34,35. Debido a que la morfología de IMM está definida por características a nanoescala, comprende la ultraestructura mitocondrial, lo que requiere técnicas de imagen que proporcionen una resolución mayor que el límite de difracción de luz. Como se describe a continuación, estas técnicas incluyen la microscopía electrónica y la microscopía de superresolución (nanoscopía).
Las células neurales y gliales del sistema nervioso central (SNC) dependen particularmente de la función mitocondrial. En promedio, el cerebro constituye solo el 2% del peso corporal total, pero utiliza el 25% de la glucosa corporal total y representa el 20% del consumo de oxígeno corporal, lo que lo hace vulnerable a alteraciones en el metabolismo energético36. Las enfermedades neurodegenerativas progresivas (ND), como la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Huntington (EH), la esclerosis múltiple (EM) y la enfermedad de Parkinson (EP), son algunas de las patologías más estudiadas hasta la fecha, con esfuerzos de investigación que van desde la comprensión de los fundamentos moleculares de estas enfermedades hasta la búsqueda de posibles intervenciones y prevención terapéuticas. Los ND se asocian con un aumento del estrés oxidativo originado en parte por las especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC)37, así como con la alteración del manejo del calcio mitocondrial 38 y del metabolismo de los lípidos mitocondriales39. Estas alteraciones fisiológicas se acompañan de defectos observados en la morfología mitocondrial que se asocian con EA 40,41,42,43,44, ELA45,46, EH47,48,49, EM50 y EP 51,52,53. Estos defectos estructurales y funcionales pueden ser acoplados por complejas relaciones causa-efecto. Por ejemplo, dado que la morfología de las crestas estabiliza las enzimas OXPHOS54, las ROS mitocondriales no solo son generadas por el ETC, sino que también actúan para dañar la infraestructura en la que reside el ETC, promoviendo un ciclo de ROS de retroalimentación que mejora la susceptibilidad al daño oxidativo. Además, se ha demostrado que la desorganización de las crestas desencadena procesos como la liberación de ADN mitocondrial (ADNmt) y las vías inflamatorias relacionadas con trastornos autoinmunes, metabólicos y relacionados con la edad55. Por lo tanto, el análisis de la estructura mitocondrial es clave para una comprensión completa de los ND y sus fundamentos moleculares.
Los métodos populares de visualización de crestas, como la microscopía electrónica de transmisión, la tomografía electrónica y la tomografía crioelectrónica (crio-ET), y la tomografía de rayos X, en particular la tomografía crioblanda de rayos X, han revelado importantes hallazgos y trabajan con una variedad de tipos de muestras 56,57,58,59,60 . A pesar de los avances recientes hacia una mejor observación de la ultraestructura de los orgánulos, estos métodos todavía vienen con la advertencia de requerir la fijación de la muestra y, por lo tanto, no pueden capturar directamente la dinámica en tiempo real de las crestas. La microscopía de fluorescencia de superresolución, particularmente en las formas de microscopía de iluminación estructurada (SIM), microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de expansión (ExM) y microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED), se han convertido en formas populares de ver estructuras que requieren una resolución por debajo del límite de difracción que restringe los métodos clásicos de microscopía óptica. Cuando se utiliza ExM junto con otra técnica de superresolución, los resultados son impresionantes, pero la muestra debe fijarse y teñirse en un gel61. En comparación, SIM, PALM/STORM y STED se han utilizado con éxito con muestras vivas, y los colorantes nuevos y prometedores que generalmente tiñen el IMM proporcionan un enfoque novedoso y fácil para obtener imágenes en vivo de la dinámica de las mitocondrias crestas 62,63,64,65,66. Los avances recientes en los tintes vivos para la obtención de imágenes STED han mejorado el brillo y la fotoestabilidad del tinte, y estos tintes se dirigen al IMM con un mayor grado de especificidad que sus predecesores. Estos desarrollos permiten la recopilación de experimentos de lapso de tiempo y pila z a largo plazo con imágenes de superresolución, lo que abre la puerta a un mejor análisis de células vivas de la ultraestructura y la dinámica mitocondrial.
En este artículo, se proporcionan protocolos para la obtención de imágenes de células vivas de células SH-SY5Y indiferenciadas y diferenciadas teñidas con el colorante PKmito Orange (PKMO) utilizando STED63. La línea celular SH-SY5Y es un derivado tres veces subclonado de la línea celular parental, SK-N-SH, generada a partir de una biopsia de médula ósea de neuroblastoma metastásico67,68,69,70. Esta línea celular es un modelo in vitro comúnmente utilizado en la investigación de la EN, particularmente con enfermedades como la EA, la EH y la EP, en las que la disfunción mitocondrial está fuertemente implicada 10,43,71,72,73. La capacidad de diferenciar las células SH-SY5Y en células con un fenotipo similar al de las neuronas mediante la manipulación de medios de cultivo ha demostrado ser un modelo adecuado para la investigación en neurociencia sin depender de células neuronales primarias10,74. En este protocolo, se añadió ácido retinoico (AR) al medio de cultivo celular para inducir la diferenciación de las células SH-SY5Y. La AR es un derivado de la vitamina A y se ha demostrado que regula el ciclo celular y promueve la expresión de factores de transcripción que regulan la diferenciación neuronal75. También se proporciona un protocolo para el cultivo y la obtención de imágenes de células vivas de neuronas aisladas del hipocampo de la rata. Se ha demostrado que el hipocampo se ve afectado por la degeneración mitocondrial y, junto con la corteza, juega un papel importante en el envejecimiento y la ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Las mitocondrias desempeñan muchas funciones esenciales en la célula, incluida la producción de energía, la regulación de la homeostasis de Ca2+ , la biosíntesis de lípidos y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estos procesos mediados por mitocondrias asumen funciones especializadas en las neuronas, coordinando el metabolismo aeróbico para satisfacer las altas demandas de energía de estas células, modulando la señalización de Ca2+ , proporcionando lípidos para el crecimiento y la regeneración de axones y ajustando la producción de ROS para el desarrollo y la función neuronal. Por lo tanto, la disfunción mitocondrial es un factor central en las enfermedades neurodegenerativas. La estructura y la función mitocondrial están inextricablemente vinculadas. La membrana interna morfológicamente compleja con pliegues estructurales llamados crestas alberga muchos sistemas moleculares que realizan los procesos característicos de la mitocondria. Las características arquitectónicas de la membrana interna son ultraestructurales y, por lo tanto, demasiado pequeñas para ser visualizadas por la microscopía tradicional resuelta por difracción limitada. Por lo tanto, la mayoría de los conocimientos sobre la ultraestructura mitocondrial provienen de la microscopía electrónica en muestras fijas. Sin embargo, las tecnologías emergentes en microscopía de fluorescencia de superresolución ahora proporcionan una resolución de hasta decenas de nanómetros, lo que permite la visualización de características ultraestructurales en células vivas. Por lo tanto, las imágenes de superresolución ofrecen una capacidad sin precedentes para obtener imágenes directas de detalles finos de la estructura mitocondrial, las distribuciones de proteínas a nanoescala y la dinámica de las crestas, lo que proporciona nuevos conocimientos fundamentales que vinculan las mitocondrias con la salud y la enfermedad humanas. Este protocolo presenta el uso de microscopía de superresolución de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) para visualizar la ultraestructura mitocondrial de células vivas de neuroblastoma humano y neuronas primarias de rata. Este procedimiento está organizado en cinco secciones: (1) crecimiento y diferenciación de la línea celular SH-SY5Y, (2) aislamiento, siembra y crecimiento de neuronas primarias del hipocampo de rata, (3) procedimientos para teñir células para obtener imágenes de STED vivas, (4) procedimientos para experimentos de STED de células vivas utilizando un microscopio de STED como referencia, y (5) orientación para la segmentación y el procesamiento de imágenes utilizando ejemplos para medir y cuantificar las características morfológicas de la membrana interna.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Este protocolo describe las condiciones de crecimiento celular para células cultivadas y primarias, con un enfoque en la obtención de imágenes de células vivas de ETS y análisis posteriores de las crestas mitocondriales. Las proyecciones realizadas con ImageJ de mitocondrias a partir de células SH-SY5Y indiferenciadas (Figura 3A) y SH-SY5Y diferenciadas por AR (Figura 3B) se pueden recolectar como pilas z con confocal y STED tradicionales, y las imágenes STED sin procesar se pueden desconvolucionar. También se pueden realizar imágenes de lapso de tiempo y posteriormente desconvolucionarlas (Figura 3C, D). Utilizando parámetros de imagen ligeramente diferentes para las neuronas primarias del hipocampo de la rata (Tabla 1), las imágenes confocales y sin procesar de STED se pueden adquirir como pilas z, y las imágenes de STED sin procesar se pueden desconvolucionar (Figura 4A). También es posible obtener imágenes de lapso de tiempo de las mitocondrias de las neuronas primarias (Figura 4B). En general, las imágenes de lapso de tiempo deben ser capaces de mostrar eventos dinámicos mitocondriales.
Cuando las proyecciones de pila z STED sin procesar y STED desconvolucionadas de las muestras utilizadas para la segmentación parecen consistentes, se realizan mediciones cuantitativas. El complemento TWS utiliza la imagen STED desconvolucionada para segmentar y hacer una máscara de probabilidad, que luego se usa para crear una máscara binaria de las crestas para obtener parámetros de tamaño y forma (Figura 5A). Las regiones de esta máscara se guardan en el administrador de ROI y se pueden aplicar a la imagen STED sin procesar si se desea para medir las diferencias en la intensidad relativa. Las proyecciones STED desconvolucionadas también se pueden utilizar para determinar la periodicidad y la densidad de las crestas en un área determinada (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figura 1: Morfología mitocondrial. Las mitocondrias tienen un sistema de dos membranas que define diferentes subcompartimentos (A). Las crestas son pliegues de la membrana interna con características definidas (B). Abreviaturas: OMM, membrana mitocondrial externa; ICS: espacio intracristalino; IMS: espacio intermembrana; CM: membrana crestista; IBM, membrana límite interna; IMM: membrana mitocondrial interna; TC: punta de cresta; CJ, cruce de crestas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Figura 2: Esquema del flujo de trabajo. Las células SH-SY5Y o las neuronas primarias del hipocampo de rata se cultivan en un cubreobjetos recubierto de PDL. Las células SH-SY5Y se cultivan en paralelo para permanecer indiferenciadas o sometidas a diferenciación de AR en el transcurso de seis días. Las neuronas primarias del hipocampo de rata se cultivaron en un cubreobjetos recubierto de PDL después de ser aisladas de secciones del hipocampo durante siete días. Una vez que estaban listas para ser fotografiadas, las células se tiñeron con PKMO y se obtuvieron imágenes con STED. A continuación, las imágenes STED sin procesar se desconvolucionan y las imágenes desconvolucionadas se procesan en FIJI para obtener mediciones de tamaño y forma, como la densidad de crestas, el área, el perímetro, la circularidad y la relación de aspecto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes de mitocondrias en células SH-SY5Y. Se muestran proyecciones representativas de la pila en Z de la imagen de STED confocal (izquierda), STED cruda (centro) y desconvolucionada de Huygens (derecha) de mitocondrias de células SH-SY5Y no diferenciadas (A) y diferenciadas por AR (B) con tinción de PKMO. Se muestra un timelapse con intervalos de 30 s y 5 iteraciones de celdas SH-SY5Y diferenciadas por AR (C) con regiones seleccionadas (cajas blancas) expandidas sobre (D) utilizando imágenes a escala de esas regiones sin interpolación. Barras de escala: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes de las mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo de rata. Se muestran proyecciones representativas de la pila z de la imagen confocal (izquierda), STED cruda (centro) y STED desconvolucionada de Huygens (derecha) de mitocondrias de neuronas primarias del hipocampo de rata (A). Se muestra un timelapse con intervalos de 25 s y 5 iteraciones de mitocondrias en estas neuronas (B). Barras de escala: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figura 5: Procesamiento de imágenes STED desconvolucionadas en ImageJ. Se muestra el uso representativo del complemento Trainable Weka Segmentation para medir el tamaño y la forma de las crestas (A). De izquierda a derecha, se muestran las siguientes imágenes: la imagen STED desconvolucionada, el mapa de probabilidad basado en la segmentación del complemento TWS, la máscara del umbral en FIJI utilizando el mapa de probabilidad como entrada, la máscara con los ROI delineados y los ROI superpuestos en la imagen STED original desconvolucionada. Las mediciones resultantes del área, el perímetro, la circularidad y la relación de aspecto correspondientes a estos objetos se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 1. Se muestra un gráfico lineal que utiliza la imagen STED desconvolucionada para medir las distancias de pico a pico como lectura de la densidad de crestas (B). Barras de escala: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Tamaño de píxel (nm)</td>
			<td>Tiempo de permanencia (μs)</td>
			<td>Línea acc.</td>
			<td>Excitación de 561 nm durante la adquisición de STED (%)</td>
			<td>Potencia de agotamiento de STED de 775 nm (%)</td>
			<td>Tamaño del paso (nm)</td>
			<td>Estenopeico (AU)</td>
			<td>Intervalo (s) de lapso de tiempo</td>
			<td>Iteraciones de timelapse</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y sin diferencias</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SH-SY5Y diferenciado de RA</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Neuronas primarias</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">NOTA: El tamaño de píxel puede variar en función de los requisitos de imagen y de la intención de desconvolucionar las imágenes. Se requiere un muestreo adecuado para la deconvolución. Los tamaños de píxel para imágenes STED sin procesar sin deconvolución pueden llegar hasta 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Resumen de los parámetros de adquisición de STED. Se muestran los ajustes utilizados para la obtención de imágenes STED 2D para cada tipo de célula, SH-SY5Y indiferenciada, SH-SY5Y diferenciada por AR y neuronas primarias del hipocampo de rata. Para todos los time-lapses, se tomaron 5 iteraciones con intervalos variables según el tamaño del ROI.
Figura complementaria 1: Imágenes de células SH-SY5Y con adición de amiloide-β (Aβ). Se muestran imágenes representativas confocales (izquierda), STED crudas (centro) y STED desconvolucionadas (derecha) de células SH-SY5Y diferenciadas por AR con tinción PKMO (arriba) y Aβ-HiLyte647 (abajo) (A). Se muestran proyecciones combinadas de la pila z de PKMO STED sin procesar (verde) con Aβ STED sin procesar (magenta) (B) o PKMO STED desconvolucionado (verde) con Aβ STED (magenta) (C) sin procesar. Barras de escala: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Medidas de tamaño y forma de las crestas segmentadas. Se muestran las medidas de tamaño y forma del área (μm2), el perímetro (μm), la circularidad y la relación de aspecto, correspondientes a los objetos descritos en la Figura 5A de mitocondrias segmentadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 2: Resumen de los parámetros de adquisición con muestras de β amiloide. Se muestran los ajustes utilizados para la obtención de imágenes STED 2D de PKMO y Aβ-HiLyte647 en células SH-SY5Y indiferenciadas y diferenciadas por AR. El confocal de Aβ-HiLyte647 se puede usar solo, ya que no hay una estructura específica para resolver; Aquí se muestran imágenes STED de Aβ-HiLyte647 para tamaños de partícula más pequeños. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Ficha complementaria 1: Protocolo de tratamiento de β amiloide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la propagación, diferenciación y tinción de células SH-SY5Y cultivadas y neuronas primarias del hipocampo de rata para la visualización y el análisis de la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Nuestro programa de investigación se centra en los aspectos estructurales y funcionales de las mitocondrias, particularmente en lo que se refiere a la disfunción relacionada con el envejecimiento. Con este fin, utilizamos una amplia gama de técnicas biofísicas, bioquímicas y estructurales para explorar los mecanismos básicos del envejecimiento mitocondrial y desarrollar intervenciones terapéuticas para preservar y restaurar la salud mitocondrial. La función y la estructura mitocondrial están inextricablemente relacionadas.Las técnicas estándar de microscopía óptica son adecuadas para medir características mitocondriales a gran escala, como la morfología básica y las estructuras de red. El análisis de la ultraestructura mitocondrial o de las características que requieren una resolución más alta que la que ofrece la microscopía óptica tradicional se realiza normalmente mediante microscopía electrónica o tomografía en muestras fijas. La microscopía de superresolución es una técnica de imagen basada en fluorescencia que mide características más allá del límite de difracción.En el caso de las mitocondrias, esto incluye mediciones de la distribución de proteínas a escala nanométrica y la arquitectura de las crestas. El protocolo de imágenes stead descrito aquí permite a los investigadores medir la estructura detallada de la membrana interna en las células vivas. Las imágenes de células vivas nos permiten observar y analizar cuantitativamente características complejas de las crestas en condiciones fisiológicamente relevantes sin necesidad de fijar la muestra.Esto proporcionará a los investigadores nuevos conocimientos sobre los cambios dinámicos que se producen en las características ultraestructurales y sus respuestas temporales a los factores estresantes y a los compuestos farmacológicos.