Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Primära nervceller i hippocampus hos råttor levererades av Dr. George Lykotrafitis och Shiju Gu från avdelningen för biomedicinsk teknik vid University of Connecticut (Storrs, CT, USA). Abberior STED-instrumentet som finns i Advanced Light Microscopy Facility i Center for Open Research Resources and Equipment förvärvades med NIH-anslag S10OD023618 tilldelades Christopher O'Connell. Denna forskning finansierades av NIH-anslag R01AG065879 tilldelades Nathan N. Alder.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Författarna har inget att avslöja.

Detta protokoll presenterar användningen av humana neuroblastomcellinjen SH-SY5Y och primära hippocampusneuroner från råtta med det nya IMM-riktade PKMO-färgämnet för STED-avbildning av levande celler. På grund av nyheten med PKMO finns det för närvarande lite publicerat som använder detta färgämne för levande STED-avbildning. Att använda dessa celltyper för STED-avbildning innebär utmaningar, särskilt eftersom neuronala celler har smalare mitokondrier. En begränsning med detta protokoll är det PKMO-färgämne som används, eftersom det kan vara giftigt för celler. Olika celler och cellinjer reagerar olika på färgämnet, därför kan justeringar av färgämneskoncentration och inkubationstid för att optimera resultaten för stark signal utan att skada cellerna krävas. En föreslagen lösning är att sänka koncentrationen och öka färgningstiden63; Detta kan dock resultera i sämre färgning utan att öka cellviabiliteten.
I likhet med PKMO uppvisar det kommersiella färgämnet Live Orange mito (Table of Materials) också viss celltoxicitet. Detta färgämne användes för en mängd olika odlade celler men kunde inte uppvisa jämförbar färgning i RA-differentierade SH-SY5Y-celler framgångsrikt med samma parametrar som deras odifferentierade motsvarigheter (våra opublicerade observationer). Lämpliga färgningsprotokoll kan dock optimeras för denna sond och valda celltyper. Med detta färgämne användes detektorns regleringstider på 1-1,05 till 7-7,05 ns, med alla andra parametrar i tabell 1 desamma. Generellt sett gav färgning av celler med 200-250 nM Live Orange mito i 45 minuter jämförbara resultat som de PKMO-resultat som visades. Färgning med högre koncentration under kortare tid eller färgning med lägre koncentration under samma tid eller något längre kan ge olika resultat och kan vara gynnsamt för andra celltyper eller tillväxtförhållanden.
Avbildning av primära hippocampusneuroner hos råttor skiljer sig från odödliga celler på grund av arten av axon- och dendritutskotten samt mitokondriell distribution vid tidpunkten för avbildning. En svårighet i denna del av protokollet är att såddtätheten avgör om de primära kulturerna kommer att kunna fästa och växa hälsosamt, och vid högre densiteter tenderar prognoserna att växa över vid DIV 10. Därför kommer mitokondrierna som avbildas från dessa primära neuroner sannolikt att komma från cellkroppen och inte projektionerna; Framgångsrik tillväxt från en lägre celltäthet ger dock bättre avbildningsresultat vid senare tillväxttillfällen. Nyckeln är att säkerställa låg bakgrund och oskarpt ljus för att få bästa kontrast för STED. För att ta itu med farhågor om cellpopulationen förhindrar odling av primära hippocampusceller i B27-kompletterade neurontillväxtmedier tillväxten av gliaceller, och källan rapporterar att <5 % av cellerna är astrocyter och frånvaron av NbActiv1-tillskott i odlingsmediet minskar antalet astrocyter i kulturer till <2 %87. För både odlade SH-SY5Y-celler och primära hippocampusneuroner från råtta bidrar PDL-beläggningen som används för tillväxt till bakgrundsdis i bilder. Tillräcklig signal-till-brus uppnås med de inställningar som rapporteras i (tabell 1) och dekonvolution tar bort det mesta av den observerade bakgrunden.
Förutom den avbildning som behandlas här är det också möjligt att lägga till behandlingar eller stress på celler före eller under avbildning. Till exempel inducerar tillsats av tert-butylväteperoxid (tBHP) oxidativ stress, och det är möjligt att övervaka förändringar i mitokondrier över tid efter tillsats. Tillsatsen av amyloid-β (Aβ) med en fluorescerande tagg möjliggör övervakning av distributionen av denna peptid i förhållande till mitokondrier samt mitokondriestrukturen över tid. Mitokondriell hälsa har varit starkt inblandad i AD och har brett stöd för att spela en roll i Aβ-toxicitet 43,71,72. Differentieringsstatusen för SH-SY5Y-celler påverkar lokaliseringen av Aβ-proteinprekursorn (AβPP)85, och experiment med AβPP bör konstrueras noggrant.
Som ett exempel på hur detta protokoll kan anpassas visas att den fluorescerande varianten Aβ(1-42)-HiLyte 647 kan adderas till PKMO-färgade celler 15 minuter före avbildning (Supplement Figure 1). Avbildningsparametrarna är likartade (tilläggstabell 2), med den största skillnaden att ett mindre hål behövs vid avbildning av smalare mitokondrier. Avbildning av Aβ-HiLyte647 med STED kräver mindre total excitation (6%-8%) och STED-utarmning (10%-12%) lasereffekt och färre ansamlingar (sex). Detektorgrinden har också utökats från 0,1 till 10 ns. Även om STED-upplösning av Aβ inte är nödvändig, var det totala signal-brusförhållandet och Aβ-partikelstorleken för rå STED bättre än för de konfokala bilderna, och efterföljande dekonvolution kan också utföras. Att samla in STED-bilder och dekonvolvera råa STED z-stackprojektioner av Aβ verkar särskilt användbart vid sammanslagning med råa STED- eller dekonvolverade STED-bilder av PKMO-fläcken (tilläggsfigur 1B,C). Båda kanalerna samlades i ett enda bildsteg. Mätningar av tidsberoende lokalisering, liknande de som anges i figur 2 och visas i figur 5, där så är tillämpligt, och skillnader i kritarkitekturen kan erhållas efter stressbehandling eller andra tillägg.
Andra möjliga metoder för dubbelmärkning i levande celler STED av mitokondrier som inte rapporterats här men som har rapporterats av andra inkluderar användning av SNAP-märkta proteiner93, Halo-märkta proteiner och användning av andra cellpermeabla färgämnen med generiska mål, såsom mtDNA63. Noterbart är att märkningsstrategin för SNAP- och Halo-taggning påverkar den resulterande fluorescenssignalens intensitet och livslängd vid avbildning94. Dessutom, även om detta protokoll presenterar flera exempel på analyser som kan tillämpas på segmenterade mitokondrier, finns det många andra analyser som programvarupaket kan utföra på dessa bilder.

Mitokondrier är eukaryota organeller av endosymbiotiskt ursprung som är ansvariga för att reglera flera viktiga cellulära processer, inklusive intermediär metabolism och ATP-produktion, jonhomeostas, lipidbiosyntes och programmerad celldöd (apoptos). Dessa organeller är topologiskt komplexa och innehåller ett dubbelt membransystem som upprättar flera underavdelningar1 (figur 1A). Det yttre mitokondriemembranet (OMM) samverkar med cytosolen och upprättar direkta kontakter mellan organeller 2,3. Det inre mitokondriella membranet (IMM) är ett energibesparande membran som upprätthåller jongradienter lagrade främst som en elektrisk membranpotential (ΔΨm) för att driva ATP-syntes och andra energikrävande processer 4,5. IMM är vidare uppdelad i det inre gränsmembranet (IBM), som är nära sammanpressat med OMM, och utskjutande strukturer som kallas cristae som är bundna av cristae-membranet (CM). Detta membran avgränsar det innersta matrisfacket från det intrakristalla utrymmet (ICS) och det intermembrana utrymmet (IMS).
Mitokondrier har en dynamisk morfologi baserad på kontinuerliga och balanserade processer av fission och fusion som styrs av mekanoenzymer i dynaminsuperfamiljen6. Fusion möjliggör ökad konnektivitet och bildning av retikulära nätverk, medan fission leder till mitokondriell fragmentering och möjliggör avlägsnande av skadade mitokondrier med mitofagi7. Mitokondriernas morfologi varierar beroende på vävnadstyp8 och utvecklingsstadium9 och regleras för att göra det möjligt för celler att anpassa sig till faktorer som energibehov 10,11 och stressorer 12. Standardmorfometriska egenskaper hos mitokondrier, såsom omfattningen av nätverksbildning (sammankopplad kontra fragmenterad), omkrets, area, volym, längd (bildförhållande), rundhet och förgreningsgrad, kan mätas och kvantifieras med standard optisk mikroskopi eftersom storleken på dessa egenskaper är större än diffraktionsgränsen för ljus (~200 nm)13.
Cristae-arkitekturen definierar mitokondriernas inre struktur (figur 1B). Mångfalden av cristae-morfologier kan i stort sett kategoriseras som platt (lamellär eller diskoidal) eller tubulär-vesikulär14. Alla cristae fäster vid IBM genom rörformiga eller slitsliknande strukturer som kallas cristae junctions (CJ) som kan tjäna till att dela upp IMS från ICS och IBM från CM15. Cristae-morfologi regleras av nyckelproteinkomplex i IMM, inklusive (1) mitokondriekontaktstället och cristae-organiseringssystemet (MICOS) som finns vid CJ och stabiliserar IMM-OMM-kontakter 16, (2) den optiska atrofi 1 (OPA1) GTPas som reglerar cristae-remodellering17,18,19, och (3) F1FOo ATP-syntas som bildar stabiliserande oligomera sammansättningar vid cristae-spetsar (CTs)20, 21. veckor Dessutom är IMM berikad med fosfolipiderna fosfatidyletanolamin och kardiolipin som stabiliserar den starkt krökta IMM22. Cristae är också dynamiska och visar morfologiska förändringar under olika förhållanden, såsom olika metaboliska tillstånd 23,24, med olika andningssubstrat 25, under svält och oxidativ stress 26,27, med apoptos 28,29 och med åldrande 30. Nyligen har det visat sig att Cristae kan genomgå stora ombyggnadshändelser på en tidsskala av sekunder, vilket understryker deras dynamiska natur31. Flera egenskaper hos cristae kan kvantifieras, inklusive dimensioner av strukturer inom enskilda cristae (t.ex. CJ-bredd, cristalängd och bredd) och parametrar som relaterar individuella crista till andra strukturer (t.ex. intra-cristae-avstånd och cristae-infallsvinkel i förhållande till OMM)32. Dessa kvantifierbara cristae-parametrar visar en direkt korrelation med funktion. Till exempel är omfattningen av mitokondriell ATP-produktion positivt relaterad till överflödet av cristae, kvantifierat som cristae-densitet eller cristae-antal normaliserat till en annan egenskap (t.ex. cristae per OMM-område)33,34,35. Eftersom IMM-morfologi definieras av egenskaper i nanoskala omfattar den mitokondriell ultrastruktur, vilket kräver avbildningstekniker som ger en upplösning som är större än ljusdiffraktionsgränsen. Som beskrivs nedan inkluderar sådana tekniker elektronmikroskopi och superupplösningsmikroskopi (nanoskopi).
Nerv- och gliacellerna i centrala nervsystemet (CNS) är särskilt beroende av mitokondriell funktion. I genomsnitt utgör hjärnan endast 2 % av den totala kroppsvikten, men använder 25 % av den totala kroppsglukosen och står för 20 % av kroppens syreförbrukning, vilket gör den sårbar för försämringar i energimetabolismen36. Progressiva neurodegenerativa sjukdomar (ND), inklusive Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateralskleros (ALS), Huntingtons sjukdom (HD), multipel skleros (MS) och Parkinsons sjukdom (PD), är några av de mest studerade patologierna hittills, med forskningsinsatser som sträcker sig från att förstå de molekylära grunderna för dessa sjukdomar till att söka potentiella terapeutiska förebyggande åtgärder och interventioner. ND är förknippade med ökad oxidativ stress som delvis härrör från reaktiva syrearter (ROS) som genereras av mitokondriernas elektrontransportkedja (ETC)37, samt förändrad mitokondriell kalciumhantering 38 och mitokondriell lipidmetabolism39. Dessa fysiologiska förändringar åtföljs av noterade defekter i mitokondriell morfologi som är associerade med AD 40,41,42,43,44, ALS45,46, HD47,48,49, MS 50 och PD 51,52,53. Dessa strukturella och funktionella defekter kan kopplas samman med komplexa orsakssamband. Till exempel, med tanke på att cristae-morfologi stabiliserar OXPHOS-enzymer54, genereras mitokondriella ROS inte bara av ETC, utan de verkar också för att skada infrastrukturen där ETC finns, vilket främjar en feed-forward ROS-cykel som ökar känsligheten för oxidativ skada. Dessutom har kristae-desorganisation visat sig utlösa processer som frisättning av mitokondriellt DNA (mtDNA) och inflammatoriska vägar kopplade till autoimmuna, metaboliska och åldersrelaterade sjukdomar55. Därför är analys av mitokondriell struktur nyckeln till en fullständig förståelse av ND och deras molekylära underbyggnad.
Populära metoder för att se cristae, inklusive transmissionselektronmikroskopi, elektrontomografi och kryoelektrontomografi (kryo-ET), och röntgentomografi, i synnerhet kryo-mjuk röntgentomografi, har avslöjat viktiga fynd och arbete med en mängd olika provtyper 56,57,58,59,60. Trots de senaste framstegen mot bättre observation av organellär ultrastruktur, kommer dessa metoder fortfarande med förbehållet att kräva provfixering och kan därför inte fånga realtidsdynamiken hos cristae direkt. Superupplöst fluorescensmikroskopi, särskilt i form av strukturerad belysningsmikroskopi (SIM), stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), expansionsmikroskopi (ExM) och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi, har blivit populära sätt att se strukturer som kräver upplösning under diffraktionsgränsen som begränsar klassiska metoder för optisk mikroskopi. När ExM används tillsammans med en annan superupplösningsteknik är resultaten imponerande, men provet måste fixeras och färgas i en gel61. Som jämförelse har SIM, PALM/STORM och STED alla framgångsrikt använts med levande prover, och nya och lovande färgämnen som i allmänhet färgar IMM ger ett nytt och enkelt tillvägagångssätt för live-avbildning av mitochondria cristae dynamics 62,63,64,65,66. De senaste framstegen inom levande färgämnen för STED-avbildning har förbättrat färgämnets ljusstyrka och fotostabilitet, och dessa färgämnen riktar sig mot IMM i en högre grad av specificitet än sina föregångare. Denna utveckling gör det möjligt att samla in långsiktiga timelapse- och z-stack-experiment med superupplösningsavbildning, vilket öppnar dörren för bättre livecellanalys av mitokondriell ultrastruktur och dynamik.
Häri tillhandahålls protokoll för avbildning av levande celler av odifferentierade och differentierade SH-SY5Y-celler färgade med PKmito Orange (PKMO)-färgämnet med STED63. SH-SY5Y-cellinjen är ett trefaldigt subklonat derivat från modercellinjen, SK-N-SH, genererad från en benmärgsbiopsi av metastaserande neuroblastom67,68,69,70. Denna cellinje är en vanligt förekommande in vitro-modell i ND-forskning, särskilt med sjukdomar som AD, HD och PD, där mitokondriell dysfunktion är starkt inblandad 10,43,71,72,73. Förmågan att differentiera SH-SY5Y-celler till celler med en neuronliknande fenotyp genom att manipulera odlingsmedia har visat sig vara en lämplig modell för neurovetenskaplig forskning utan att förlita sig på primära neuronala celler10,74. I detta protokoll tillsattes retinsyra (RA) till cellodlingsmediet för att inducera differentiering av SH-SY5Y-celler. RA är ett vitamin A-derivat och har visat sig reglera cellcykeln och främja uttrycket av transkriptionsfaktorer som reglerar neuronal differentiering75. Ett protokoll för odling och avbildning av levande celler av nervceller isolerade från råttans hippocampus tillhandahålls också. Hippocampus har visat sig påverkas av mitokondriell degeneration och spelar, tillsammans med cortex, en viktig roll i åldrande och ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Mitokondrier spelar många viktiga roller i cellen, inklusive energiproduktion, reglering av Ca2+ homeostas, lipidbiosyntes och produktion av reaktiva syrearter (ROS). Dessa mitokondrimedierade processer tar på sig specialiserade roller i neuroner, samordnar aerob metabolism för att möta de höga energikraven hos dessa celler, modulerar Ca2+ -signalering, tillhandahåller lipider för axontillväxt och regenerering och justerar ROS-produktionen för neuronal utveckling och funktion. Mitokondriell dysfunktion är därför en central drivkraft vid neurodegenerativa sjukdomar. Mitokondriernas struktur och funktion är oupplösligt sammankopplade. Det morfologiskt komplexa inre membranet med strukturella veck som kallas cristae hyser många molekylära system som utför mitokondriens signaturprocesser. De arkitektoniska egenskaperna hos det inre membranet är ultrastrukturella och därför för små för att visualiseras med traditionell diffraktionsbegränsad upplöst mikroskopi. Således har de flesta insikterna om mitokondriell ultrastruktur kommit från elektronmikroskopi på fasta prover. Men ny teknik inom superupplöst fluorescensmikroskopi ger nu upplösning ner till tiotals nanometer, vilket möjliggör visualisering av ultrastrukturella egenskaper i levande celler. Superupplöst avbildning erbjuder därför en oöverträffad förmåga att direkt avbilda fina detaljer i mitokondriell struktur, proteindistributioner i nanoskala och cristae-dynamik, vilket ger grundläggande nya insikter som kopplar mitokondrier till människors hälsa och sjukdom. Detta protokoll presenterar användningen av stimulated emission depletion (STED) superupplösningsmikroskopi för att visualisera den mitokondriella ultrastrukturen hos levande humana neuroblastomceller och primära råttneuroner. Denna procedur är organiserad i fem sektioner: (1) tillväxt och differentiering av SH-SY5Y-cellinjen, (2) isolering, plätering och tillväxt av primära hippocampusneuroner hos råtta, (3) procedurer för färgning av celler för levande STED-avbildning, (4) procedurer för STED-experiment med levande celler som referens, och (5) vägledning för segmentering och bildbehandling med hjälp av exempel för att mäta och kvantifiera morfologiska egenskaper hos det inre membranet.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Detta protokoll beskriver celltillväxtförhållanden för odlade och primära celler med fokus på STED-avbildning av levande celler och efterföljande analyser av mitokondriella cristae. Projektioner gjorda med ImageJ av mitokondrier från odifferentierade SH-SY5Y (Figur 3A) och RA-differentierade SH-SY5Y (Figur 3B) celler kan samlas in som z-stackar med traditionell konfokal och STED, och de råa STED-bilderna kan sedan dekonvolveras. Timelapse-avbildning kan också utföras och därefter dekonvolveras (Figur 3C,D). Genom att använda något olika avbildningsparametrar för primära hippocampusneuroner hos råtta (tabell 1) kan konfokala och råa STED-bilder erhållas som z-stackar, och de råa STED-bilderna kan dekonvolveras (figur 4A). Timelapse-avbildning av mitokondrier från primära nervceller är också möjlig (Figur 4B). I allmänhet bör time-lapse-bilderna kunna visa mitokondriella dynamiska händelser.
När råa STED och deconvolved STED z-stack-projektioner från proverna som används för segmentering verkar konsekventa, utförs kvantitativa mätningar. TWS-pluginet använder den dekonvolverade STED-bilden för att segmentera för att skapa en sannolikhetsmask, som sedan används för att skapa en binär mask av cristae för att få storleks- och formparametrar (figur 5A). Regionerna från den här masken sparas i ROI-hanteraren och kan tillämpas på den råa STED-bilden om så önskas för att mäta skillnader i relativ intensitet. De dekonvolverade STED-prognoserna kan också användas för att bestämma cristae-periodiciteten och densiteten i ett givet område (figur 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Figur 1: Mitokondriell morfologi. Mitokondrier har ett tvåmembransystem som definierar olika underavdelningar (A). Cristae är veck av det inre membranet med definierade egenskaper (B). Förkortningar: OMM, yttre mitokondriellt membran; ICS, intrakristalliserat rum; IMS, intermembranutrymme; CM, cristae membran; IBM, inre gränsmembran; IMM, inre mitokondriellt membran; CT, cristae spets; CJ, cristae korsning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Bild 2: Schematisk bild av arbetsflödet. SH-SY5Y-celler eller primära hippocampusneuroner från råttor odlas på ett PDL-belagt täckglas. SH-SY5Y-celler odlas parallellt för att förbli odifferentierade eller utsättas för RA-differentiering under loppet av sex dagar. Primära hippocampusneuroner från råttor odlades på ett PDL-belagt täckglas efter att ha isolerats från hippocampussektioner i sju dagar. När cellerna var redo att avbildas färgades de med PKMO och avbildades med STED. Råa STED-bilder dekonvolveras sedan och de dekonvolverade bilderna bearbetas i FIJI för att erhålla storleks- och formmått, såsom cristae-densitet, area, omkrets, cirkularitet och bildförhållande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Figur 3: Avbildning av mitokondrier i SH-SY5Y-celler. Representativ konfokal (vänster), rå STED (mitten) och Huygens dekonvolverade STED-bilder z-stackprojektioner (höger) av mitokondrier från icke-differentierade (A) och RA-differentierade (B) SH-SY5Y-celler med PKMO-färgning visas. En timelapse med 30 s intervall och 5 iterationer av RA-differentierade SH-SY5Y-celler visas (C) med valda regioner (vita rutor) expanderade (D) med hjälp av skalade bilder av dessa regioner utan interpolering. Skalstreck: A,B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Figur 4: Avbildning av mitokondrier i primära hippocampusneuroner hos råtta. Representativ konfokal (vänster), rå STED (mitten) och Huygens dekonvolverade STED (höger) bild z-stackprojektioner av mitokondrier från primära hippocampus neuroner från råtta visas (A). En timelapse med 25 s intervall och 5 iterationer av mitokondrier i dessa neuroner visas (B). Skalstreck: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Figur 5: Bearbetning av dekonvolverade STED-bilder i ImageJ. Representativ användning av plugin-programmet Trainable Weka Segmentation för att mäta cristae-storlek och form visas (A). Från vänster till höger visas följande bilder: den dekonvolverade STED-bilden, sannolikhetskartan baserad på segmentering från TWS-plugin-programmet, masken från tröskelvärden i FIJI med sannolikhetskartan som indata, masken med ROI:erna beskrivna och ROI:erna överlagrade på den ursprungliga dekonvolverade STED-bilden. De resulterande mätningarna av area, omkrets, cirkularitet och bildförhållande som motsvarar dessa objekt finns i tilläggstabell 1. Ett linjediagram som använder den dekonvolverade STED-bilden för att mäta topp-till-topp-avstånd som en avläsning för cristae-densitet visas (B). Skalstreck: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Pixelstorlek (nm)</td>
			<td>Uppehållstid (μs)</td>
			<td>Linje enl.</td>
			<td>561 nm excitation under STED-förvärv (%)</td>
			<td>775 nm STED-utarmningseffekt (%)</td>
			<td>Stegstorlek (nm)</td>
			<td>Nålhål (AU)</td>
			<td>Timelapse-intervall (s)</td>
			<td>Timelapse-iterationer</td>
		</tr><tr><td>Odifferentierad SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-differentierad SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Primära neuroner</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">OBS: Pixelstorleken kan variera beroende på bildkrav och avsikt att dekonvolvera bilder. Korrekt sampling krävs för dekonvolution. Pixelstorlekarna för råa STED-bilder utan dekonvolution kan gå upp till 30 nm.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Sammanfattning av STED-förvärvsparametrar. Inställningarna som används för 2D STED-avbildning för varje celltyp, odifferentierad SH-SY5Y, RA-differentierad SH-SY5Y och primära hippocampusneuroner från råtta, visas. För alla time-lapses togs 5 iterationer med varierande intervall baserat på ROI-storlek.
Tilläggsfigur 1: Avbildning av SH-SY5Y-celler med amyloid-β (Aβ) tillsats. Representativa konfokala (vänster), råa STED (mitten) och dekonvolverade STED (höger) bilder av RA-differentierade SH-SY5Y-celler med PKMO-fläck (överst) och Aβ-HiLyte647 (nederst) visas (A). Sammanslagna z-stackprojektioner av rå PKMO STED (grön) med rå Aβ STED (magenta) (B) eller dekonvolverad PKMO STED (grön) med dekonvolverad Aβ STED (magenta) (C) visas. Skalstaplar: 0,5 μm. Klicka här <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggstabell 1: Storleks- och formmätningar av segmenterade cristae. Storleks- och formmätningarna av area (μm2), omkrets (μm), cirkularitet och bildförhållande, motsvarande de objekt som beskrivs i figur 5A från segmenterade mitokondrier, visas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggstabell 2: Sammanfattning av insamlingsparametrar med amyloid-β-prover. Inställningarna som används för 2D STED-avbildning av PKMO och Aβ-HiLyte647 i odifferentierade och RA-differentierade SH-SY5Y-celler visas. Konfokal av Aβ-HiLyte647 kan användas ensamt eftersom det inte finns någon specifik struktur att lösa; STED-bilder av Aβ-HiLyte647 visas här för mindre partikelstorlekar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Tilläggsfil 1: Behandlingsprotokoll för amyloid-β. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för förökning, differentiering och färgning av odlade SH-SY5Y-celler och primära hippocampusneuroner från råttor för visualisering och analys av mitokondriell ultrastruktur med hjälp av stimulated emission depletion (STED) mikroskopi.

Användning av STED-avbildning av levande celler för att visualisera mitokondriell inre membranultrastruktur i neuronala cellmodeller

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Vårt forskningsprogram fokuserar på strukturella och funktionella aspekter av mitokondrier, särskilt när de relaterar till åldersrelaterad dysfunktion. För detta ändamål använder vi ett brett spektrum av biofysiska, biokemiska och strukturella tekniker för att utforska de grundläggande mekanismerna för mitokondriellt åldrande och för att utveckla terapeutiska interventioner för att bevara och återställa mitokondriell hälsa. Mitokondriell funktion och struktur är oupplösligt relaterade.Standardljusmikroskopitekniker är lämpliga för att mäta storskaliga mitokondriella egenskaper som grundläggande morfologi och nätverksstrukturer. Analys av mitokondriell ultrastruktur eller egenskaper som kräver högre upplösning än vad som erbjuds av traditionell optisk mikroskopi görs vanligtvis med hjälp av elektronmikroskopi eller tomografi på fasta prover. Superupplösningsmikroskopi är en fluorescensbaserad avbildningsteknik som mäter egenskaper bortom diffraktionsgränsen.För mitokondrier inkluderar detta mätningar av proteindistribution i nanoskala och cristae-arkitektur. Det här "stead imaging"-protokollet som beskrivs här gör det möjligt för forskare att mäta den detaljerade strukturen hos det inre membranet i levande celler. Avbildning av levande celler gör det möjligt för oss att observera och kvantitativt analysera komplexa egenskaper hos Cristae under fysiologiskt relevanta förhållanden utan behov av provfixering.Detta kommer att ge forskare nya insikter om de dynamiska förändringar som sker i ultrastrukturella egenskaper och deras tidsmässiga svar på stressorer och farmakologiska föreningar.