Name: Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-06-30T14:25:00
Duration: 1 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Primer sıçan hipokampal nöronları, Connecticut Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden Dr. George Lykotrafitis ve Shiju Gu tarafından sağlandı (Storrs, CT, ABD). Açık Araştırma Kaynakları ve Ekipmanları Merkezi'ndeki Gelişmiş Işık Mikroskobu Tesisinde bulunan Abberior STED cihazı, NIH hibesi ile satın alındı S10OD023618 Christopher O'Connell'e verildi. Bu araştırma NIH hibesi tarafından finanse edildi R01AG065879 Nathan N. Alder'a verildi.

Unveiling Mitochondrial Ultrastructure in Neurons Using STED Microscopy

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokol, canlı hücre STED görüntüleme için yeni IMM-hedeflemeli PKMO boyası ile insan nöroblastom hücre hattı SH-SY5Y ve primer sıçan hipokampal nöronlarının kullanımını sunar. PKMO'nun yeniliği nedeniyle, şu anda canlı STED görüntüleme için bu boyayı kullanan çok az yayın var. STED görüntüleme için bu hücre tiplerini kullanmak, özellikle nöronal hücrelerin daha dar mitokondriye sahip olması nedeniyle zorluklar doğurur. Bu protokolün bir sınırlaması, hücreler için toksik olabileceğinden kullanılan PKMO boyasıdır. Farklı hücreler ve hücre hatları boyaya farklı tepki verir, bu nedenle, hücrelere zarar vermeden güçlü sinyal için sonuçları optimize etmek için boya konsantrasyonunda ve inkübasyon süresinde ayarlamalar gerekebilir. Önerilen bir çözüm, konsantrasyonu düşürmek ve boyama süresiniarttırmaktır 63; Bununla birlikte, bu, hücre canlılığını artırmadan daha zayıf boyamaya neden olabilir.
PKMO'ya benzer şekilde, ticari boya Live Orange mito (Malzeme Tablosu) da bir miktar hücre toksisitesi sergiler. Bu boya, çeşitli kültürlenmiş hücreler için kullanıldı, ancak RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde, farklılaşmamış muadilleriyle aynı parametrelerle (yayınlanmamış gözlemlerimiz) başarılı bir şekilde karşılaştırılabilir boyama sergileyemedi. Bununla birlikte, uygun boyama protokolleri bu prob ve seçilen hücre tipleri için optimize edilebilir. Bu boya ile 1-1.05 ila 7-7.05 ns dedektör geçit süreleri kullanılmış ve Tablo 1'deki diğer tüm parametreler aynı kalmıştır. Genel olarak, 45 dakika boyunca 200-250 nM Canlı Turuncu mito ile boyama hücreleri, PKMO sonuçlarının gösterdiği gibi karşılaştırılabilir sonuçlar verdi. Daha az süre için daha yüksek konsantrasyonlu boyama veya aynı süre veya biraz daha uzun süre için daha düşük konsantrasyonlu boyama farklı sonuçlar verebilir ve diğer hücre tipleri veya büyüme koşulları için uygun olabilir.
Primer sıçan hipokampal nöronlarının görüntülenmesi, akson ve dendrit projeksiyonlarının doğası ve görüntüleme sırasındaki mitokondriyal dağılım nedeniyle ölümsüzleştirilmiş hücrelerden farklıdır. Protokolün bu bölümündeki bir zorluk, tohumlama yoğunluğunun, birincil kültürlerin sağlıklı bir şekilde yapışıp büyüyemeyeceğini belirlemesi ve daha yüksek yoğunluklarda, projeksiyonların DIV 10 tarafından aşırı büyüme eğiliminde olmasıdır. Bu nedenle, bu birincil nöronlardan görüntülenen mitokondri muhtemelen çıkıntılardan değil hücre gövdesinden gelecektir; Bununla birlikte, daha düşük bir başlangıç hücre yoğunluğundan başarılı bir büyüme, daha sonraki büyüme zamanlarında daha iyi görüntüleme sonuçları verir. Önemli olan, STED için en iyi kontrasta sahip olmak için düşük arka plan ve odak dışı ışık sağlamaktır. Hücre popülasyonu ile ilgili endişeleri gidermek için, B27 takviyeli nöron büyüme ortamında birincil hipokampal hücrelerin kültürlenmesi, glial hücrelerin büyümesini önler ve kaynak, hücrelerin %<5'inin astrosit olduğunu ve büyüme ortamında NbActiv1 takviyesinin bulunmamasının kültürlerdeki astrosit sayısını %<2'ye düşürdüğünü bildirmektedir87. Hem kültürlenmiş SH-SY5Y hücreleri hem de birincil sıçan hipokampal nöronları için, büyüme için kullanılan PDL kaplaması, görüntülerde arka plan bulanıklığına katkıda bulunur. (Tablo 1)'de bildirilen ayarlarla yeterli sinyal-gürültü gerçekleştirilir ve evrişim giderme, gözlemlenen arka planın çoğunu kaldırır.
Burada ele alınan görüntülemeye ek olarak, görüntüleme öncesinde veya sırasında hücrelere tedaviler veya stres eklemek de mümkündür. Örneğin, tert-bütil hidrojen peroksit (tBHP) eklenmesi oksidatif strese neden olur ve ilaveden sonra zaman içinde mitokondrideki değişiklikleri izlemek mümkündür. Bir floresan etiketli amiloid-β (Aβ) ilavesi, bu peptidin zaman içinde mitokondri ve mitokondriyal yapı ile ilgili dağılımının izlenmesini sağlar. Mitokondriyal sağlık, AD'de yoğun bir şekilde yer almaktadır ve Aβ toksisitesinderol oynadığı yaygın olarak desteklenmektedir 43,71,72. Özellikle, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşma durumu, Aβ protein öncüsü (AβPP) lokalizasyonunuetkiler 85 ve AβPP kullanan deneyler dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
Bu protokolün nasıl uyarlanabileceğine bir örnek olarak, floresan varyantı Aβ (1-42) -HiLyte 647'nin görüntülemeden 15 dakika önce PKMO lekeli hücrelere eklenebileceği gösterilmiştir (Ek Şekil 1). Görüntüleme parametreleri benzerdir (Ek Tablo 2), temel fark, daha dar mitokondriyi görüntülerken daha küçük bir iğne deliğine ihtiyaç duyulmasıdır. Aβ-HiLyte647'nin STED ile görüntülenmesi, daha az genel uyarılma (% 6 -% 8) ve STED tükenmesi (% 10 -% 12) lazer gücü ve daha az birikim gerektirir (altı). Dedektör kapısı da 0,1'den 10 ns'ye uzatılmıştır. Aβ'nın STED çözünürlüğü gerekli olmasa da, ham STED'in genel sinyal-gürültü oranı ve Aβ partikül boyutu, konfokal görüntülerinkinden daha iyiydi ve daha sonra evrişim de gerçekleştirilebilir. STED görüntülerinin toplanması ve Aβ'nın ham STED z-yığını projeksiyonlarının ayrıştırılması, PKMO lekesinin ham STED veya dekonvolved STED görüntüleri ile birleştirilirken özellikle yararlı görünmektedir (Ek Şekil 1B, C). Her iki kanal da tek bir kare adımında toplandı. Şekil 2'de listelenenlere ve Şekil 5'te gösterilenlere benzer zamana bağlı lokalizasyon ölçümleri ve uygun olduğunda cristae mimarisi farklılıkları, stres tedavisi veya diğer eklemelerin ardından elde edilebilir.
Burada bildirilmeyen ancak başkaları tarafından bildirilen mitokondrinin canlı hücre STED'inde çift etiketleme için diğer olası yöntemler arasında SNAP etiketli proteinlerin93, Halo etiketli proteinlerin kullanımı ve mtDNA63 gibi jenerik hedeflere sahip diğer hücre geçirgen boyaların kullanımı yer alır. Özellikle, SNAP ve Halo etiketlemenin etiketleme stratejisi,94'ü görüntülerken ortaya çıkan floresan sinyal yoğunluğunu ve uzun ömürlülüğünü etkiler. Ek olarak, bu protokol, bölümlere ayrılmış mitokondriye uygulanabilecek birkaç analiz örneği sunarken, yazılım paketlerinin bu görüntüler üzerinde gerçekleştirebileceği birçok başka analiz vardır.

Mitokondri, ara metabolizma ve ATP üretimi, iyon homeostazı, lipid biyosentezi ve programlanmış hücre ölümü (apoptoz) dahil olmak üzere birçok önemli hücresel süreci düzenlemekten sorumlu olan endosimbiyotik kökenli ökaryotik organellerdir. Bu organeller topolojik olarak karmaşıktır ve birden fazla alt bölme1 oluşturan bir çift zar sistemi içerir (Şekil 1A). Dış mitokondriyal membran (OMM) sitozol ile arayüz oluşturur ve doğrudan organeller arası temaslar kurar 2,3. İç mitokondriyal membran (IMM), ATP sentezini ve diğer enerji gerektiren süreçleri 4,5 yönlendirmek için esas olarak bir elektrik membran potansiyeli (ΔΨm) olarak depolanan iyon gradyanlarını koruyan enerji tasarrufu sağlayan bir membrandır. IMM ayrıca, OMM'ye yakından bastırılan iç sınır zarına (IBM) ve cristae membranı (CM) tarafından bağlanan cristae adı verilen çıkıntılı yapılara bölünmüştür. Bu zar, en içteki matris bölmesini intrakristal boşluktan (ICS) ve zarlar arası boşluktan (IMS) ayırır.
Mitokondri, dinamin süper ailesinin6 mekanoenzimleri tarafından yönetilen sürekli ve dengeli fisyon ve füzyon süreçlerine dayanan dinamik bir morfolojiye sahiptir. Füzyon, bağlantının artmasına ve retiküler ağların oluşumuna izin verirken, fisyon mitokondriyal parçalanmaya yol açar ve hasarlı mitokondrinin mitofaji ile uzaklaştırılmasını sağlar7. Mitokondriyal morfoloji, doku tipi8 ve gelişim evresi9'a göre değişir ve hücrelerin enerjik ihtiyaçlar10,11 ve stresörler 12 gibi faktörlere uyum sağlamasına izin verecek şekilde düzenlenir. Mitokondrinin ağ oluşumunun kapsamı (birbirine bağlı ve parçalanmış), çevre, alan, hacim, uzunluk (en boy oranı), yuvarlaklık ve dallanma derecesi gibi standart morfometrik özellikleri, standart optik mikroskopi ile ölçülebilir ve ölçülebilir, çünkü bu özelliklerin boyutları ışığın kırınım sınırından (~200 nm) daha büyüktür13.
Cristae mimarisi, mitokondrinin iç yapısını tanımlar (Şekil 1B). Krista morfolojilerinin çeşitliliği genel olarak düz (lameller veya diskoidal) veya tübüler-veziküler14 olarak kategorize edilebilir. Tüm cristae, IMS'yi ICS'den ve IBM'i CM15'ten bölümlere ayırmaya hizmet edebilen cristae bağlantıları (CJ'ler) olarak adlandırılan boru şeklindeki veya yuva benzeri yapılar aracılığıyla IBM'e bağlanır. Cristae morfolojisi, (1) CJ'lerde bulunan ve IMM-OMM kontaklarını stabilize eden mitokondriyal temas bölgesi ve cristae düzenleme sistemi (MICOS) dahil olmak üzere IMM'nin temel protein kompleksleri tarafından düzenlenir 16, (2) optik atrofi 1 (OPA1) CRISTA yeniden şekillenmesini düzenleyen GTPaz 17,18,19 ve (3) cristae uçlarında (CT'ler) stabilize edici oligomerik düzenekler oluşturan F 1FO ATP sentaz20, 21. Ek olarak, IMM, oldukça kavisli IMM22'yi stabilize eden iki tabakalı olmayan fosfolipidler fosfatidiletanolamin ve kardiyolipin bakımından zenginleştirilmiştir. Cristae ayrıca dinamiktir, farklı metabolik durumlar 23,24, farklı solunum substratları25, açlık ve oksidatif stres 26,27, apoptoz 28,29 ve yaşlanma30 gibi çeşitli koşullar altında morfolojik değişiklikler gösterir. Son zamanlarda, cristae'nin saniyeler içinde büyük yeniden şekillenme olaylarına maruz kalabileceği ve dinamik doğalarının altını çizdiği gösterilmiştir31. Bireysel cristae içindeki yapıların boyutları (örneğin, CJ genişliği, crista uzunluğu ve genişliği) ve bireysel crista'yı diğer yapılarla ilişkilendiren parametreler (örneğin, cristae içi boşluk ve OMM'ye göre cristae olay açısı) dahil olmak üzere cristae'nin çeşitli özellikleri ölçülebilir32. Bu ölçülebilir cristae parametreleri, fonksiyon ile doğrudan bir korelasyon gösterir. Örneğin, mitokondriyal ATP üretiminin kapsamı, cristae yoğunluğu veya başka bir özelliğe normalleştirilmiş cristae sayısı olarak ölçülen cristae bolluğu ile pozitif ilişkilidir (örneğin, OMM alanı başına cristae)33,34,35. IMM morfolojisi nano ölçekli özelliklerle tanımlandığından, ışık kırınım sınırından daha yüksek çözünürlük sağlayan görüntüleme teknikleri gerektiren mitokondriyal üst yapıyı içerir. Aşağıda tarif edildiği gibi, bu tür teknikler arasında elektron mikroskobu ve süper çözünürlüklü mikroskopi (nanoskopi) bulunur.
Merkezi sinir sisteminin (CNS) nöral ve glial hücreleri özellikle mitokondriyal fonksiyona bağlıdır. Ortalama olarak, beyin toplam vücut ağırlığının sadece %2'sini oluşturur, ancak toplam vücut glikozunun %25'ini kullanır ve vücut oksijen tüketiminin %20'sini oluşturur, bu da onu enerji metabolizmasındaki bozulmalara karşı savunmasız hale getirir36. Alzheimer hastalığı (AD), amyotrofik lateral skleroz (ALS), Huntington hastalığı (HD), multipl skleroz (MS) ve Parkinson hastalığı (PD) dahil olmak üzere ilerleyici nörodejeneratif hastalıklar (ND'ler), bugüne kadar en kapsamlı şekilde çalışılan patolojilerden bazılarıdır ve bu hastalıkların moleküler temellerini anlamaktan potansiyel terapötik önleme ve müdahaleler aramaya kadar uzanan araştırma çabaları. ND'ler, kısmen mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC)37 tarafından üretilen reaktif oksijen türlerinden (ROS) kaynaklanan artan oksidatif stresin yanı sıra değişen mitokondriyal kalsiyum işleme 38 ve mitokondriyal lipid metabolizması39 ile ilişkilidir. Bu fizyolojik değişikliklere, MS 40,41,42,43,44, ALS 45,46, HD47,48,49, MS 50 ve PD 51,52,53 ile ilişkili mitokondriyal morfolojide belirtilen kusurlar eşlik eder. Bu yapısal ve işlevsel kusurlar, karmaşık neden-sonuç ilişkileriyle birleştirilebilir. Örneğin, cristae morfolojisinin OXPHOS enzimlerini54 stabilize ettiği göz önüne alındığında, mitokondriyal ROS sadece ETC tarafından üretilmekle kalmaz, aynı zamanda ETC'nin bulunduğu altyapıya zarar vermek için hareket eder ve oksidatif hasara duyarlılığı artıran ileri beslemeli bir ROS döngüsünü teşvik eder. Ayrıca, cristae düzensizliğinin mitokondriyal DNA (mtDNA) salınımı ve otoimmün, metabolik ve yaşa bağlı bozukluklara bağlı inflamatuar yollar gibi süreçleri tetiklediği gösterilmiştir55. Bu nedenle, mitokondriyal yapının analizi, ND'lerin ve bunların moleküler temellerinin tam olarak anlaşılması için anahtardır.
Transmisyon elektron mikroskobu, elektron tomografisi ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ve X-ışını tomografisi, özellikle kriyo-yumuşak X-ışını tomografisi dahil olmak üzere kristaları görüntülemenin popüler yöntemleri önemli bulgular ortaya çıkarmış ve çeşitli numune türleri ile çalışmıştır 56,57,58,59,60 . Organel üst yapının daha iyi gözlemlenmesine yönelik son gelişmelere rağmen, bu yöntemler hala numune fiksasyonu gerektirme uyarısı ile birlikte gelir ve bu nedenle, cristae'nin gerçek zamanlı dinamiklerini doğrudan yakalayamaz. Süper çözünürlüklü floresan mikroskobu, özellikle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM), stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM), genleşme mikroskobu (ExM) ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu, klasik optik mikroskopi yöntemlerini kısıtlayan kırınım sınırının altında çözünürlük gerektiren yapıları görüntülemenin popüler yolları haline gelmiştir. ExM başka bir süper çözünürlük tekniği ile birlikte kullanıldığında, sonuçlar etkileyicidir, ancak numune bir jel61 içinde sabitlenmeli ve boyanmalıdır. Karşılaştırıldığında, SIM, PALM / STORM ve STED'in tümü canlı örneklerle başarıyla kullanılmıştır ve genellikle IMM'yi boyayan yeni ve umut verici boyalar, mitokondri cristae dinamiklerinincanlı görüntülenmesi için yeni ve kolay bir yaklaşım sağlar 62,63,64,65,66. STED görüntüleme için canlı boyalardaki son gelişmeler, boya parlaklığını ve fotostabiliteyi iyileştirmiştir ve bu boyalar, IMM'yi öncekilerden daha yüksek bir özgüllük derecesinde hedeflemektedir. Bu gelişmeler, süper çözünürlüklü görüntüleme ile uzun vadeli timelapse ve z-stack deneylerinin toplanmasına izin vererek, mitokondriyal üst yapı ve dinamiklerin daha iyi canlı hücre analizine kapı açar.
Burada, STED63 kullanılarak PKmito Orange (PKMO) boyası ile boyanmış farklılaşmamış ve farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi için protokoller sağlanmaktadır. SH-SY5Y hücre hattı, metastatik nöroblastom67,68,69,70'in kemik iliği biyopsisinden üretilen ebeveyn hücre hattı SK-N-SH'den üç kez alt klonlanmış bir türevdir. Bu hücre hattı, ND araştırmalarında, özellikle mitokondriyal disfonksiyonun yoğun bir şekilde dahil olduğu AD, HD ve PD gibi hastalıklarda yaygın olarak kullanılan bir in vitro modeldir 10,43,71,72,73. SH-SY5Y hücrelerini, kültür ortamını manipüle ederek nöron benzeri bir fenotipe sahip hücrelere ayırt etme yeteneğinin, birincil nöronal hücrelere güvenmeden sinirbilim araştırmaları için uygun bir model olduğu kanıtlanmıştır10,74. Bu protokolde, SH-SY5Y hücrelerinin farklılaşmasını indüklemek için hücre kültürü ortamına retinoik asit (RA) eklendi. RA bir A vitamini türevidir ve hücre döngüsünü düzenlediği ve nöronal farklılaşmayı düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu desteklediği gösterilmiştir75. Sıçan hipokampusundan izole edilen nöronların kültürlenmesi ve canlı hücre görüntülemesi için bir protokol de sağlanmıştır. Hipokampusun mitokondriyal dejenerasyondan etkilendiği ve korteks ile birlikte yaşlanmada önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir ve ND 76,77,78,79,80.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >25300054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.4% Trypan blue</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >T10282</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400054</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X antibiotic-antimycotic</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15240062</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 X/1.40 UPlanSApo oil immersion lens</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >Equipped in Olympus IX83 microscope for STED setup described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >All-trans-retinoic acid</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >R2625</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amyloid-&#946; (1-42, HiLyte Fluor647, 0.1 mg)</td>
			<td >AnaSpec</td>
			<td >AS-64161</td>
			<td >Other fluorescent conjugates available</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B27 supplement (50 X), serum free</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >17504044</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter (Countess II FL)</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >AMQAF1000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5804-R</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Counter slides</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >C10283</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Conical tubes (15 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cuvettes (Quartz Cells)</td>
			<td >Starna Cells, Inc.</td>
			<td >9-Q-10</td>
			<td >Used with Spectrometer as described in Section 1.3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose with sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11995073</td>
			<td >Used for SH-SY5Y cell materials as described in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (high glucose no sodium pyruvate)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11965092</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM (phenol red-free)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >31053028</td>
			<td >Used for imaging as described in Section 3</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8418</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNAase I from bovine pancreas</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >DN25</td>
			<td >Used for primary cell materials as described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E18 Rat Hippocampus</td>
			<td >Transnetyx Tissue</td>
			<td >SDEHP</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol (200 proof)</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP28184</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (FBS), not heat-inactivated</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >26140079</td>
			<td >For cultured cells, in Section 1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal bovine serum (heat inactivated)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >10082147</td>
			<td >For primary cell culture, Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter sterilization unit (0.1 &#181;m, 500 mL)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >5660010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FIJI (Is Just ImageJ) and Trainable Weka Segmentation (TWS) plug-in</td>
			<td >--</td>
			<td >--</td>
			<td >Free, open-source image analysis software that includes plug-ins including Trainable Weka Segmentation described in Section 5; TWS plug-in from ref. 90 of the main text</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GlutaMAX supplement (100 X)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >35050061</td>
			<td >Glutamine supplement used for primary cell materials described in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hausser Scientific bright-Line and Hy-Lite Counting Chambers</td>
			<td >Hausser Scientific</td>
			<td >267110</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS (no calcium, no magnesium)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14170120</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2.2.1 and 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td >Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Huygens Professional deconvolution software (V. 20.10)</td>
			<td >Scientific Volume Imaging (SVI)</td>
			<td >--</td>
			<td >The deconvolution software used in this protocol and described in Section 5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IX83 inverted microscope with Continuous Autofocus</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >--</td>
			<td >This paper uses a STED Infinity Line system built around an Olympus IX83 inverted microscope, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lightbox software (V. 16.3.16118)</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >Vendor software used for STED image acquisition, described in Section 4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Live Orange Mito dye</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >LVORANGE-0146-30NMOL</td>
			<td >Live cell imaging IMM-targeting dye described in Discussion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neurobasal media</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >21103049</td>
			<td >Used for primary cell materials referred to in Section 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc Lab-Tek II 2-well chambered coverglass</td>
			<td >Nunc</td>
			<td >155379</td>
			<td >Can purchase a variety of chambers but make sure the coverglass is #1.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pasteur Pipets (Fisherbrand)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >22183632</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PKmito Orange dye</td>
			<td >Spirochrome</td>
			<td >SC053</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Poly-D-lysine</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >A3890401</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SH-SY5Y Cell line</td>
			<td >ATCC</td>
			<td >CRL2266</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >11360070</td>
			<td >Used for primary cell materials described in Section 2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Spectrometer (GENESYS 180 UV-Vis)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >840309000</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >STED Expert Line microscope</td>
			<td >Abberior</td>
			<td >--</td>
			<td >STED setup can be customized, but at time of purchase instrument was considered Abberior&#8217;s Expert Line; brief description of setup is available in Section 4 of protocol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 flask (TC-treated, filter cap)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific</td>
			<td >156367</td>
			<td >Other culture vessels and sizes available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using live cell sted imaging to visualize mitochondrial inner membrane ultrastructure in neuronal cell models

Mitokondri, enerji üretimi,Ca2+ homeostazının düzenlenmesi, lipid biyosentezi ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi dahil olmak üzere hücrede birçok önemli rol oynar. Bu mitokondri aracılı süreçler, nöronlarda özel roller üstlenir, bu hücrelerin yüksek enerji taleplerini karşılamak için aerobik metabolizmayı koordine eder,Ca2+ sinyalini modüle eder, akson büyümesi ve rejenerasyonu için lipitler sağlar ve nöronal gelişim ve işlev için ROS üretimini ayarlar. Mitokondriyal disfonksiyon bu nedenle nörodejeneratif hastalıklarda merkezi bir itici güçtür. Mitokondriyal yapı ve işlev ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır. Cristae adı verilen yapısal kıvrımlara sahip morfolojik olarak karmaşık iç zar, mitokondrinin imza süreçlerini gerçekleştiren birçok moleküler sistemi barındırır. İç zarın mimari özellikleri ultrastrüktüreldir ve bu nedenle geleneksel kırınım sınırlı çözülmüş mikroskopi ile görselleştirilemeyecek kadar küçüktür. Bu nedenle, mitokondriyal üst yapı hakkındaki bilgilerin çoğu, sabit numuneler üzerindeki elektron mikroskobundan gelmiştir. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü floresan mikroskobunda ortaya çıkan teknolojiler artık onlarca nanometreye kadar çözünürlük sağlayarak canlı hücrelerdeki ultrayapısal özelliklerin görselleştirilmesine izin veriyor. Bu nedenle süper çözünürlüklü görüntüleme, mitokondriyal yapının, nano ölçekli protein dağılımlarının ve cristae dinamiklerinin ince ayrıntılarını doğrudan görüntülemek için benzeri görülmemiş bir yetenek sunar ve mitokondriyi insan sağlığı ve hastalığına bağlayan temel yeni bilgiler sağlar. Bu protokol, canlı insan nöroblastom hücrelerinin ve primer sıçan nöronlarının mitokondriyal üst yapısını görselleştirmek için uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) süper çözünürlüklü mikroskopinin kullanımını sunar. Bu prosedür beş bölüm halinde düzenlenmiştir: (1) SH-SY5Y hücre hattının büyümesi ve farklılaşması, (2) birincil sıçan hipokampal nöronlarının izolasyonu, kaplanması ve büyümesi, (3) canlı STED görüntüleme için hücrelerin boyanması prosedürleri, (4) referans için bir STED mikroskobu kullanılarak canlı hücre STED deneyleri için prosedürler ve (5) iç zarın morfolojik özelliklerini ölçmek ve ölçmek için örnekler kullanarak segmentasyon ve görüntü işleme için rehberlik.

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Bu protokol, canlı hücre STED görüntülemesine ve ardından mitokondriyal krista analizlerine odaklanarak kültürlenmiş ve birincil hücreler için hücre büyüme koşullarını açıklar. Farklılaşmamış SH-SY5Y (Şekil 3A) ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y (Şekil 3B) hücrelerinden mitokondri ImageJ ile yapılan projeksiyonlar, geleneksel konfokal ve STED ile z-yığınları olarak toplanabilir ve ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir. Timelapse görüntüleme de yapılabilir ve daha sonra dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 3C,D). Primer sıçan hipokampal nöronları için biraz farklı görüntüleme parametreleri kullanılarak (Tablo 1), konfokal ve ham STED görüntüleri z-yığınları olarak elde edilebilir ve ham STED görüntüleri dekonvolvasyon yapılabilir (Şekil 4A). Primer nöronlardan mitokondrinin timelapse görüntülenmesi de mümkündür (Şekil 4B). Genel olarak, hızlandırılmış görüntüler mitokondriyal dinamik olayları gösterebilmelidir.
Segmentasyon için kullanılan örneklerden ham STED ve dekonvolved STED z-yığını projeksiyonları tutarlı göründüğünde, kantitatif ölçümler gerçekleştirilir. TWS eklentisi, bir olasılık maskesi yapmak için bölümlere ayırmak için dekonvolved STED görüntüsünü kullanır ve bu daha sonra boyut ve şekil parametreleri elde etmek için cristae'nin ikili bir maskesini oluşturmak için kullanılır (Şekil 5A). Bu maskedeki bölgeler ROI yöneticisine kaydedilir ve göreli yoğunluktaki farklılıkları ölçmek için istenirse ham STED görüntüsüne uygulanabilir. Dekonvolved STED projeksiyonları, belirli bir alandaki kristae periyodikliğini ve yoğunluğunu belirlemek için de kullanılabilir (Şekil 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig01.jpg"> Şekil 1: Mitokondriyal morfoloji. Mitokondri, farklı alt bölmeleri (A) tanımlayan iki zarlı bir sisteme sahiptir. Cristae, tanımlanmış özelliklere (B) sahip iç zarın kıvrımlarıdır. Kısaltmalar: OMM, dış mitokondriyal membran; ICS, intrakristal uzay; IMS, zarlar arası boşluk; CM, cristae membranı; IBM, iç sınır zarı; IMM, iç mitokondriyal membran; CT, cristae ucu; CJ, cristae kavşağı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig02.jpg"> Şekil 2: İş akışının şeması. SH-SY5Y hücreleri veya birincil sıçan hipokampal nöronları, PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütülür. SH-SY5Y hücreleri, farklılaşmadan kalacak şekilde paralel olarak büyütülür veya altı gün boyunca RA farklılaşmasına maruz kalır. Birincil sıçan hipokampal nöronları, yedi gün boyunca hipokampal bölümlerden izole edildikten sonra PDL kaplı bir kapak camı üzerinde büyütüldü. Görüntülenmeye hazır olduğunda, hücreler PKMO ile boyandı ve STED ile görüntülendi. Ham STED görüntüleri daha sonra dekonvolvasyona tabi tutulur ve dekonvolvasyonlu görüntüler, cristae yoğunluğu, alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı gibi boyut ve şekil ölçümleri elde etmek için FIJI'de işlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig03.jpg"> Şekil 3: SH-SY5Y hücrelerinde mitokondrinin görüntülenmesi. PKMO boyamalı farklılaşmamış (A) ve RA farklılaşmış (B) SH-SY5Y hücrelerinden mitokondrinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolvasyonlu STED görüntüsü z-yığını projeksiyonları (sağda) gösterilmektedir. 30 sn aralıklarla ve RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin 5 yinelemesine sahip bir zaman atlamalı (C) gösterilir (C) seçilen bölgeler (beyaz kutular) genişletilerek (D) bu bölgelerin enterpolasyon olmadan ölçeklendirilmiş görüntüleri kullanılarak. Ölçek çubukları: A, B, 250 nm; C,D, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig04.jpg"> Şekil 4: Primer sıçan hipokampal nöronlarında mitokondrinin görüntülenmesi. Temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve Huygens dekonvolved STED (sağda) görüntüsü primer sıçan hipokampal nöronlarından mitokondrinin z-yığını projeksiyonları gösterilmiştir (A). Bu nöronlarda 25 s aralıklarla ve 5 mitokondri yinelemesi ile bir timelapse gösterilmiştir (B). Ölçek çubukları: A, 250 nm; B, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65561/65561fig05.jpg"> Şekil 5: ImageJ'de dekonvolved STED görüntülerinin işlenmesi. Cristae boyutunu ve şeklini ölçmek için Eğitilebilir Weka Segmentasyon eklentisinin temsili kullanımı gösterilmiştir (A). Soldan sağa, aşağıdaki görüntüler gösterilir: dekonvolved görüntüsü, TWS eklentisinden segmentasyona dayalı olasılık haritası, olasılık haritasını girdi olarak kullanarak FIJI'de eşiklemeden maske, ROI'lerin ana hatlarıyla belirtildiği maske ve ROI'ler orijinal dekonvolved STED görüntüsünün üzerine bindirilir. Bu nesnelere karşılık gelen alan, çevre, dairesellik ve en boy oranı ölçümleri Ek Tablo 1'de bulunabilir. Cristae yoğunluğu için bir okuma olarak tepeden tepeye mesafeleri ölçmek için dekonvolved STED görüntüsünü kullanan bir çizgi grafiği gösterilir (B). Ölçek çubukları: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Piksel boyutu (nm)</td>
			<td>Bekleme süresi (μs)</td>
			<td>Hat acc.</td>
			<td>STED edinimi sırasında 561 nm uyarılma (%)</td>
			<td>775 nm STED tükenme gücü (%)</td>
			<td>Adım boyutu (nm)</td>
			<td>İğne deliği (AU)</td>
			<td>Timelapse aralık(lar)ı</td>
			<td>Zaman atlamalı yinelemeler</td>
		</tr><tr><td>Farksız SH-SY5Y</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>RA-Diferansiyel SH-SY5Y</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10-12</td>
			<td>15</td>
			<td>20-22</td>
			<td>150-200</td>
			<td>1.0</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Birincil Nöronlar</td>
			<td>20-25</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
			<td>200</td>
			<td>0.7</td>
			<td>30</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="10">NOT: Piksel boyutu, görüntüleme gereksinimlerine ve görüntülerin bulanıklığını giderme amacına bağlı olarak değişebilir. Dekonvolüsyon için uygun örnekleme gereklidir. Evrişim olmadan ham STED görüntüler için piksel boyutları 30 nm'ye kadar çıkabilir.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: STED edinme parametrelerinin özeti. Her hücre tipi, farklılaşmamış SH-SY5Y, RA ile farklılaşmış SH-SY5Y ve primer sıçan hipokampal nöronları için 2D STED görüntüleme için kullanılan ayarlar görüntülenir. Tüm zaman atlamaları için, ROI boyutuna göre değişen aralıklarla 5 yineleme alındı.
Ek Şekil 1: SH-SY5Y hücrelerinin amiloid-β (Aβ) ilavesi ile görüntülenmesi. PKMO boyası (üstte) ve Aβ-HiLyte647 (altta) ile RA ile farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinin temsili konfokal (solda), ham STED (ortada) ve dekonvolvasyonlu STED (sağda) görüntüleri gösterilmektedir (A). Ham Aβ STED (macenta) (B) ile ham PKMO STED (yeşil) veya dekonvolved Aβ STED (macenta) (C) ile dekonvolved PKMO STED'in (yeşil) birleştirilmiş z-yığını projeksiyonları gösterilmektedir. Ölçek çubukları: 0,5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/Suppl%20Fig.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Parçalı cristae'nin boyut ve şekil ölçümleri. Segmentli mitokondriden Şekil 5A'da özetlenen nesnelere karşılık gelen alan (μm2), çevre (μm), dairesellik ve en boy oranının boyut ve şekil ölçümleri gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 2: Amiloid β numuneleri ile edinim parametrelerinin özeti. Farklılaşmamış ve RA farklılaşmış SH-SY5Y hücrelerinde PKMO ve Aβ-HiLyte647'nin 2D STED görüntülemesi için kullanılan ayarlar görüntülenir. Aβ-HiLyte647'nin konfokal olması, çözülecek belirli bir yapı olmadığı için tek başına kullanılabilir; Aβ-HiLyte647'nin STED görüntüleri, daha küçük parçacık boyutları için burada gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Amiloid β tedavi protokolü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65561/65561_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Decoding Mitochondrial Aging at JoVE.com

Decoding Mitochondrial Aging (Video) | JoVE

Bu protokol, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak mitokondriyal üst yapı görselleştirme ve analizi için kültürlenmiş SH-SY5Y hücrelerinin ve birincil sıçan hipokampal nöronlarının yayılması, farklılaşması ve boyanması için bir iş akışı sunar.

Nöronal Hücre Modellerinde Mitokondriyal İç Membran Üst Yapısını Görselleştirmek için Canlı Hücre STED Görüntülemenin Kullanılması

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

Araştırma programımız, özellikle yaşlanmaya bağlı işlev bozukluğu ile ilgili olarak mitokondrinin yapısal ve işlevsel yönlerine odaklanmaktadır. Bu amaçla, mitokondriyal yaşlanmanın temel mekanizmalarını keşfetmek ve mitokondriyal sağlığı korumak ve eski haline getirmek için terapötik müdahaleler geliştirmek için çok çeşitli biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal teknikler kullanıyoruz. Mitokondriyal fonksiyon ve yapı ayrılmaz bir şekilde ilişkilidir.Standart ışık mikroskobu teknikleri, temel morfoloji ve ağ yapıları gibi büyük ölçekli mitokondriyal özellikleri ölçmek için uygundur. Geleneksel optik mikroskopi tarafından sağlanandan daha yüksek çözünürlük gerektiren mitokondriyal ultra yapı veya özelliklerin analizi, tipik olarak sabit numuneler üzerinde elektron mikroskobu veya tomografi kullanılarak yapılır. Süper çözünürlüklü mikroskopi, kırınım sınırının ötesindeki özellikleri ölçen floresan tabanlı bir görüntüleme tekniğidir.Mitokondri için bu, nano ölçekli protein dağılımı ve cristae mimarisinin ölçümlerini içerir. Burada açıklanan sabit görüntüleme protokolü, araştırmacıların canlı hücrelerdeki iç zarın ayrıntılı yapısını ölçmelerine olanak tanır. Canlı hücre görüntüleme, numune fiksasyonuna gerek kalmadan fizyolojik olarak ilgili koşullar altında cristae'nin karmaşık özelliklerini gözlemlememize ve kantitatif olarak analiz etmemize olanak tanır.Bu, araştırmacılara ultra yapısal özelliklerde meydana gelen dinamik değişiklikler ve bunların stresörlere ve farmakolojik bileşiklere zamansal tepkileri hakkında yeni bilgiler verecektir.