Name: Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier tous les collègues de Ksilink pour leur aide précieuse et les discussions qui ont conduit à la conception du protocole présenté.

1. Préparation du milieu et des plaques pour l’ensemencement des neurones (Jour 1)
<ol><li>Pour préparer les plaques pour l’ensemencement des neurones au jour 1, réchauffez la laminine à température ambiante (RT) juste avant l’utilisation. Préparer la solution de laminine en diluant la solution mère de laminine (0,1 mg/mL) 1/10 dans du PBS+/+ froid (avec Ca 2+ et Mg2+). REMARQUE : Tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux...

Culturing Human Midbrain Dopaminergic Neurons for Phenotypic Profiling

<ol>
	<li>Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Parkinson's+disease.">The cell biology of Parkinson's disease.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).</li><li>Caicedo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-analysis+strategies+for+image-based+cell+profiling.">Data-analysis strategies for image-based cell profiling.</a> Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Painting,+a+high-content+image-based+assay+for+morphological+profiling+using+multiplexed+fluorescent+dyes.">Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+of+small+molecules.">Morphological profiling of small molecules.</a> Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).</li><li>Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+in+the+study+of+PD+molecular+pathogenesis.">iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).</li><li>Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+human+genetic+diseases+using+iPSC+models.">Drug screening for human genetic diseases using iPSC models.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).</li><li>Vuidel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotyping+of+Parkinson's+disease+patient+stem+cell-derived+midbrain+dopaminergic+neurons+using+machine+learning+classification.">High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).</li><li>Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).</li><li>Berthold, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KNIME:+The+Konstanz+Information+Miner.">KNIME: The Konstanz Information Miner.</a> Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).</li><li>Fathi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverging+Parkinson's+Disease+Pathology+between+patient-derived+GBAN370S,+LRRK2G2019S+and+engineered+SNCAA53T+iPSC-derived+Dopaminergic+Neurons.">Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+How+Dimension+Reduction+Tools+Work:+An+Empirical+Approach+to+Deciphering+t-SNE,+UMAP,+TriMap,+and+PaCMAP+for+Data+Visualization.">Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization.</a> Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).</li><li>Ke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LightGBM:+A+highly+efficient+gradient+boosting+decision+tree.">LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree.</a> Advances in Neural Information Processing Systems. 30, (2017).</li><li>Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Parkinson's+Disease:+iPSCs+towards+Better+Understanding+of+Human+Pathology.">Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology.</a> Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).</li><li>S&#225;nchez-Dan&#233;s, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+dopamine+neurons+from+human+iPS-based+models+of+genetic+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).</li><li>Oosterveen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+dopaminergic+subpopulations+model+the+selective+neuron+degeneration+in+Parkinson's+disease.">Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).</li><li>Hughes, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+high-content+cell+painting+identifies+copper+ionophores+as+selective+modulators+of+esophageal+cancer+phenotypes.">Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes.</a> ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).</li><li>Akbarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+by+means+of+the+Cell+Painting+assay+enables+identification+of+tubulin-targeting+compounds.">Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds.</a> Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Way, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+gene+expression+profiling+provide+complementary+information+for+mapping+cell+state.">Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state.</a> Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).</li><li>Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parameter+phenotypic+profiling:+using+cellular+effects+to+characterize+small-molecule+compounds.">Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).</li><li>Antonov, S. A., Novosadova, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+and+unresolved+problems+in+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopamine+neurons+for+parkinson's+disease+drug+development.">Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presymptomatic+compensation+in+Parkinson's+disease+is+not+dopamine-mediated.">Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated.</a> Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).</li><li>Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Biomarkers+of+parkinson+disease.">Preclinical Biomarkers of parkinson disease.</a> Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).</li><li>Verstraelen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+quantification+of+synapses+in+primary+neuronal+culture.">Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture.</a> iScience. 23 (9), 101542 (2020).</li><li>Liu-Yesucevitz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-Linked+mutations+enlarge+TDP-43-enriched+neuronal+RNA+granules+in+the+dendritic+arbor.">ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).</li></ol>

Le profilage phénotypique est une technique permettant de mesurer un grand nombre de phénotypes dans les cellules en appliquant des colorations fluorescentes, la microscopie et l’analyse d’images3. Des profils phénotypiques peuvent être obtenus et comparés entre des lignées cellulaires ou d’autres conditions expérimentales pour comprendre des changements complexes dans la biologie cellulaire qui pourraient passer inaperçus lors de l’utilisation d’une seule lecture. Nous décrivon...

Divers processus biologiques cellulaires sont perturbés dans la maladie de Parkinson (MP). Par exemple, un dysfonctionnement mitochondrial, un stress oxydatif, des défauts de dégradation des protéines, une perturbation du trafic vésiculaire et de la fonction endolysosomale ont été associés à une perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA) sont couramment observés dans la MP1. Par conséquent, la maladie de Parkinson semble impliquer de multiples mécanismes pathologiques qui peuvent interagir et s’aggraver mutuellement. Un moyen utile d’étudier cette interaction mécanistique est la création d’une empreinte phénotypique complète ou d’un profil des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA).
Le profilage phénotypique est une approche qui consiste à créer un profil d’échantillon à partir d’un ensemble de caractéristiques mesurables, et deuxièmement, à faire des prédictions sur un échantillon en fonction de ce profil 2,3. L’objectif du profilage est de saisir un large éventail de caractéristiques, dont certaines n’ont peut-être pas été associées auparavant à une maladie ou à un traitement3. Par conséquent, le profilage peut révéler des processus biologiques inattendus. Le profilage phénotypique repose généralement sur des cellules colorées par fluorescence, et des tests standardisés, tels que la peinture cellulaire, ont été développés pour créer des profils phénotypiques4. Récemment, le profilage phénotypique a, par exemple, été appliqué pour la caractérisation de petites molécules ou la prédiction précise de sous-types de MP uniquement sur la base de fibroblastes dérivés de patients 5,6. Malgré ces avancées, le profilage phénotypique a rarement été appliqué aux cellules différenciées post-mitotiques, telles que les neurones mDA dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) qui expriment des mutations liées à la maladie de Parkinson telles que LRRK2 G2019S. Les défis importants des modèles dérivés des CSPi comprennent la présence de caractéristiques pathologiques subtiles ou variables entre les lots de différenciation ou les génotypes, et le fait que les phénotypes de MP isolés ne rendent pas compte de toute la complexité de la maladie. De plus, bien que les modèles neuronaux iPSC soient physiologiquement pertinents, ils sont rarement utilisés dans les processus de découverte de médicaments contre la maladie de Parkinson en raison de préoccupations liées à la complexité technique 7,8.
Nous avons précédemment développé une méthodologie robuste pour mesurer plusieurs phénotypes physiopathologiques liés à la maladie de Parkinson dans les neurones mDA humains qui sont à la fois sensibles aux changements phénotypiques induits par les composés génétiques et chimiques9. Cet article décrit en détail une version optimisée de cette méthodologie pour créer des profils phénotypiques à partir de neurones mDA (Figure 1). Ce protocole présente plusieurs avantages par rapport aux approches de profilage phénotypique décrites précédemment, tels que l’utilisation de neurones mDA de haute qualité et la reproductibilité technique. Pour la première fois, ce protocole permet un profilage phénotypique dans les neurones mDA post-mitotiques physiologiquement pertinents après des perturbations chimiques de manière hautement évolutive. Des neurones mDA entièrement différenciés et cryoconservés sont disponibles dans le commerce, ce qui réduit considérablement la variabilité de la différenciation d’un lot à l’autre. Deuxièmement, la variabilité technique peut être encore réduite en utilisant un plan expérimental bien défini (c’est-à-dire la durée de la culture ou l’évitement des puits de bord), la manipulation automatisée des liquides et la microscopie automatisée. De plus, les étapes initiales de l’analyse du profil phénotypique à l’aide d’approches de classification ou de classification supervisées non supervisées sont décrites ici, indiquant comment les données de profilage phénotypique peuvent être analysées. Ce protocole sera utile aux chercheurs intéressés par les modifications phénotypiques des neurones mDA induites par des perturbations génétiques ou chimiques, en particulier lorsqu’un dispositif d’étude hautement évolutif est nécessaire, par exemple lors de campagnes de criblage ou lorsque les effets d’un plus petit nombre de composés doivent être étudiés, par exemple, pour déterminer les effets toxiques. En résumé, on s’attend à ce que l’application du profilage phénotypique des neurones humains soit une technique précieuse pour étudier les phénotypes complexes liés à des maladies et caractériser les effets cellulaires des candidats-médicaments.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique du protocole expérimental de génération de profils phénotypiques basés sur l’image à partir de neurones mDA humains dérivés de CSPi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti- chicken &#8211; Alexa 647</td>
			<td>Jackson ImmunoRearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td>https://www.anaconda.com/download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Map2</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-213</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse - Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit - Alexa 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21429</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T2928</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138501</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CV7000</td>
			<td>The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>Buffer for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek (Agilent)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution (PFA 16 %)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EM-15710-S</td>
			<td>Fixation before staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Base Medium 1</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1010</td>
			<td>Base medium for neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1087</td>
			<td>Apparently healthy donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1149</td>
			<td>Donor carrying LRRK2 G2019S mutation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Nervous System Supplement</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1031</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Neural Supplement B</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1029</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Python Notebook</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling</td>
			<td>Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td>Plate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFE-360</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-120085</td>
			<td>LRRK2 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoLink</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/PhenoLink</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 384w, PDL coated</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage plates Abgene 120 &#181;L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0781</td>
			<td>Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Permeabilization before lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>Determination of living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vprep Pipetting System&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic profiling of human stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons

La maladie de Parkinson (MP) est liée à une série de processus biologiques cellulaires qui provoquent la perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). De nombreux modèles cellulaires de MP in vitro actuels manquent de complexité et ne prennent pas en compte plusieurs phénotypes. Le profilage phénotypique dans les neurones mDA dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) peut remédier à ces lacunes en mesurant simultanément une gamme de phénotypes neuronaux dans un type de cellule pertinent pour la maladie de Parkinson en parallèle. Nous décrivons ici un protocole permettant d’obtenir et d’analyser des profils phénotypiques à partir de neurones mDA humains disponibles dans le commerce. Un panel de coloration fluorescente spécifique aux neurones est utilisé pour visualiser les phénotypes nucléaires, liés à la α-synucléine, à la tyrosine hydroxylase (TH) et à la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2). Le protocole de profilage phénotypique décrit est évolutif car il utilise des plaques à 384 puits, une manipulation automatique des liquides et une microscopie à haut débit. L’utilité du protocole est illustrée par l’utilisation de neurones mDA donneurs sains et de neurones mDA porteurs de la mutation G2019S liée à la maladie de Parkinson dans le gène LRRK2 (Leucine-rich repeat kinase 2). Les deux lignées cellulaires ont été traitées avec l’inhibiteur de la kinase LRRK2 PFE-360 et les changements phénotypiques ont été mesurés. De plus, nous démontrons comment les profils phénotypiques multidimensionnels peuvent être analysés à l’aide de méthodes de classification supervisée basées sur le clustering ou l’apprentissage automatique. Le protocole décrit intéressera particulièrement les chercheurs travaillant sur la modélisation des maladies neuronales ou l’étude des effets des composés chimiques dans les neurones humains.

Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons

Le profilage phénotypique dans les neurones mDA est un moyen efficace de quantifier de multiples aspects de la biologie cellulaire et leurs changements au cours de la modulation expérimentale. Pour illustrer cette méthodologie, cette étude a utilisé des neurones LRRK2 G2019S cryoconservés et des neurones mDA de donneurs sains. Ces neurones sont différenciés depuis environ 37 jours, sont des marqueurs neuronaux post-mitotiques et express (TUBB3 et MAP2) et des neurones dopaminergiques, y compris la tyrosine hydrox...

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Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (Video) | JoVE

Ce protocole décrit la culture cellulaire de neurones dopaminergiques du mésencéphale humain, suivie d’une coloration immunologique et de la génération de profils phénotypiques neuronaux à partir d’images microscopiques acquises à haut contenu permettant l’identification de variations phénotypiques dues à des modulations génétiques ou chimiques.

Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...

Nous construisons des profils phénotypiques de cellules humaines différenciées telles que les neurones. Notre objectif est de mieux comprendre les effets globaux des traitements composés chimiques sur les cellules. Les profils phénotypiques peuvent suggérer des points d’entrée moins biaisés pour d’autres études mécanistiques.La qualité des protocoles de différenciation des neurones dopaminergiques humains s’est considérablement améliorée, permettant la production de grands lots de neurones homogènes. De plus, il y a une augmentation de l’utilisation de l’automatisation de laboratoire pour la reproductibilité des cellules différenciées sur de longues périodes, et bien sûr, l’exploitation des données basées sur l’imagerie est devenue plus rapide et plus détaillée. L’un des grands défis consiste à s’assurer que les profils phénotypiques sont à la fois quantifiables et reproductibles.Pour y parvenir, il est crucial de produire des lots de neurones homogènes et d’identifier un protocole adapté à l’automatisation. Cependant, avec un protocole automatisé, il y a toujours un compromis à faire entre la faisabilité technique et la pertinence physiologique. Ici, nous avons trouvé un bon compromis.Nous avons développé une solution prête à l’emploi pour caractériser en profondeur les neurones dopaminergiques humains à l’aide d’une approche d’imagerie. Le protocole automatisé, ainsi que le flux de travail d’analyse d’images et de données, permettront à davantage de scientifiques de créer des profils phénotypiques neuronaux. Nous aimerions mieux comprendre comment les profils phénotypiques diffèrent entre les formes monogénétiques et idiopathiques de la maladie de Parkinson.Nous aimerions également explorer les changements dans les aspects phénotypiques lorsque les neurones dopaminergiques interagissent avec d’autres types de cellules cérébrales telles que la microglie, par exemple.