Name: Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons at JoVE.com

लेखक Ksilink में सभी सहयोगियों को उनकी मूल्यवान मदद और चर्चाओं के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं जो प्रस्तुत प्रोटोकॉल के डिजाइन की ओर ले जाते हैं।

1. न्यूरॉन सीडिंग के लिए मध्यम और प्लेटों की तैयारी (दिन 1)
<ol><li>पहले दिन न्यूरॉन सीडिंग के लिए प्लेटों को तैयार करने के लिए, उपयोग से ठीक पहले लैमिनिन को कमरे के तापमान (आरटी) पर गर्म करें। ठंडे पीबीएस...

Culturing Human Midbrain Dopaminergic Neurons for Phenotypic Profiling

<ol>
	<li>Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Parkinson's+disease.">The cell biology of Parkinson's disease.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).</li><li>Caicedo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-analysis+strategies+for+image-based+cell+profiling.">Data-analysis strategies for image-based cell profiling.</a> Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Painting,+a+high-content+image-based+assay+for+morphological+profiling+using+multiplexed+fluorescent+dyes.">Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+of+small+molecules.">Morphological profiling of small molecules.</a> Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).</li><li>Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+in+the+study+of+PD+molecular+pathogenesis.">iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).</li><li>Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+for+human+genetic+diseases+using+iPSC+models.">Drug screening for human genetic diseases using iPSC models.</a> Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).</li><li>Vuidel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+phenotyping+of+Parkinson's+disease+patient+stem+cell-derived+midbrain+dopaminergic+neurons+using+machine+learning+classification.">High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification.</a> Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).</li><li>Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).</li><li>Berthold, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KNIME:+The+Konstanz+Information+Miner.">KNIME: The Konstanz Information Miner.</a> Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).</li><li>Fathi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverging+Parkinson's+Disease+Pathology+between+patient-derived+GBAN370S,+LRRK2G2019S+and+engineered+SNCAA53T+iPSC-derived+Dopaminergic+Neurons.">Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+How+Dimension+Reduction+Tools+Work:+An+Empirical+Approach+to+Deciphering+t-SNE,+UMAP,+TriMap,+and+PaCMAP+for+Data+Visualization.">Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization.</a> Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).</li><li>Ke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LightGBM:+A+highly+efficient+gradient+boosting+decision+tree.">LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree.</a> Advances in Neural Information Processing Systems. 30, (2017).</li><li>Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Parkinson's+Disease:+iPSCs+towards+Better+Understanding+of+Human+Pathology.">Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology.</a> Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).</li><li>S&#225;nchez-Dan&#233;s, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+dopamine+neurons+from+human+iPS-based+models+of+genetic+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).</li><li>Oosterveen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+dopaminergic+subpopulations+model+the+selective+neuron+degeneration+in+Parkinson's+disease.">Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).</li><li>Hughes, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+high-content+cell+painting+identifies+copper+ionophores+as+selective+modulators+of+esophageal+cancer+phenotypes.">Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes.</a> ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).</li><li>Akbarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+by+means+of+the+Cell+Painting+assay+enables+identification+of+tubulin-targeting+compounds.">Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds.</a> Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Way, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+gene+expression+profiling+provide+complementary+information+for+mapping+cell+state.">Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state.</a> Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).</li><li>Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parameter+phenotypic+profiling:+using+cellular+effects+to+characterize+small-molecule+compounds.">Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).</li><li>Antonov, S. A., Novosadova, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+and+unresolved+problems+in+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopamine+neurons+for+parkinson's+disease+drug+development.">Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presymptomatic+compensation+in+Parkinson's+disease+is+not+dopamine-mediated.">Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated.</a> Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).</li><li>Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Biomarkers+of+parkinson+disease.">Preclinical Biomarkers of parkinson disease.</a> Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).</li><li>Verstraelen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+quantification+of+synapses+in+primary+neuronal+culture.">Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture.</a> iScience. 23 (9), 101542 (2020).</li><li>Liu-Yesucevitz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-Linked+mutations+enlarge+TDP-43-enriched+neuronal+RNA+granules+in+the+dendritic+arbor.">ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).</li></ol>

फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग फ्लोरोसेंट स्टेनिंग, माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण3 को लागू करके कोशिकाओं में बड़ी संख्या में फेनोटाइप को मापने की एक तकनीक है। फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त किए जा स?...

पार्किंसंस रोग (पीडी) में विभिन्न प्रकार की कोशिका जैविक प्रक्रियाएं परेशान होती हैं। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ऑक्सीडेटिव तनाव, प्रोटीन क्षरण दोष, वेसिकुलर तस्करी का विघटन और एंडोलाइसोसोमल फ़ंक्शन मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि से जुड़े हुए हैं, आमतौर पर पीडी1 में देखे जाते हैं। इसलिए, पीडी में कई रोग तंत्र शामिल होते हैं जो एक दूसरे के साथ बातचीत कर सकते हैं और खराब कर सकते हैं। इस यंत्रवत अंतःक्रिया की जांच करने का एक उपयोगी तरीका एक व्यापक फेनोटाइपिक फिंगरप्रिंट या मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन्स की प्रोफ़ाइल का निर्माण है।
फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग एक दृष्टिकोण है जिसमें मापने योग्य विशेषताओं के संग्रह के आधार पर एक नमूने की प्रोफ़ाइल बनाना शामिल है, और दूसरा, इसमें इस प्रोफ़ाइल 2,3 के आधार पर एक नमूने के बारे में भविष्यवाणियां करना शामिल है। प्रोफाइलिंग का लक्ष्य सुविधाओं की एक विविध श्रृंखला को पकड़ना है, जिनमें से कुछ पहले किसी बीमारी या उपचार से जुड़े नहीं हो सकतेहैं। नतीजतन, प्रोफाइलिंग अप्रत्याशित जैविक प्रक्रियाओं को प्रकट कर सकती है। फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग आमतौर पर फ्लोरोसेंटली दाग वाली कोशिकाओं पर निर्भर करती है, और फेनोटाइपिक प्रोफाइल4 बनाने के लिए सेल पेंटिंग जैसे मानकीकृत परख विकसित किए गए हैं। हाल ही में, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग, उदाहरण के लिए, छोटे अणुओं के लक्षण वर्णन या पीडी-उपप्रकारों की सटीक भविष्यवाणी के लिए पूरी तरह से रोगी-व्युत्पन्न फाइब्रोब्लास्ट 5,6 के आधार पर लागू किया गया है। इन प्रगति के बावजूद, फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग शायद ही कभी पोस्ट-माइटोटिक विभेदित कोशिकाओं पर लागू की गई है, जैसे कि मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स जो पीडी-लिंक्ड म्यूटेशन जैसे एलआरआरके 2 जी 2019 एस को व्यक्त करते हैं। आईपीएससी-व्युत्पन्न मॉडल की महत्वपूर्ण चुनौतियों में भेदभाव बैचों या जीनोटाइप में सूक्ष्म या परिवर्तनीय पैथोलॉजिकल विशेषताओं की उपस्थिति शामिल है, और यह तथ्य कि पृथक पीडी फेनोटाइप रोग की पूरी जटिलता को कैप्चर नहीं करते हैं। इसके अलावा, जबकि आईपीएससी न्यूरोनल मॉडल शारीरिक रूप से प्रासंगिक हैं, तकनीकी जटिलता 7,8 के बारे में चिंताओं के कारण पीडी दवा खोज प्रक्रियाओं में उनका उपयोग शायद ही कभी किया जाता है।
हमने पहले मानव एमडीए न्यूरॉन्स में कई पीडी-संबंधित पैथोफिजियोलॉजिकल फेनोटाइप ्स को मापने के लिए एक मजबूत पद्धति विकसित की थी जो आनुवंशिक और रासायनिक यौगिक-प्रेरित फेनोटाइपिकपरिवर्तनों के प्रति संवेदनशील हैं। यह लेख एमडीए न्यूरॉन्स (चित्रा 1) से फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए इस पद्धति के एक और अनुकूलित संस्करण का विस्तार से वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में पहले वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग दृष्टिकोणों पर कई फायदे हैं, जैसे कि उच्च गुणवत्ता वाले एमडीए न्यूरॉन्स और तकनीकी प्रजनन क्षमता का उपयोग। पहली बार, यह प्रोटोकॉल अत्यधिक स्केलेबल फैशन में रासायनिक गड़बड़ी के बाद शारीरिक रूप से प्रासंगिक पोस्ट-माइटोटिक एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग को सक्षम बनाता है। पूरी तरह से विभेदित और क्रायोसंरक्षित एमडीए न्यूरॉन्स व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो बैच-टू-बैच भेदभाव परिवर्तनशीलता को काफी कम करते हैं। दूसरे, तकनीकी परिवर्तनशीलता को एक अच्छी तरह से परिभाषित प्रयोगात्मक डिजाइन (यानी, संस्कृति अवधि या किनारे के कुओं से बचने), स्वचालित तरल हैंडलिंग और स्वचालित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके और कम किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, असुरक्षित क्लस्टरिंग या पर्यवेक्षित वर्गीकरण दृष्टिकोण का उपयोग करके फेनोटाइपिक प्रोफाइल विश्लेषण के प्रारंभिक चरणों को यहां उल्लिखित किया गया है, यह दर्शाता है कि फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग डेटा का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल आनुवंशिक या रासायनिक गड़बड़ी से प्रेरित एमडीए न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक परिवर्तनों में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयोग का होगा, विशेष रूप से जब एक अत्यधिक स्केलेबल अध्ययन सेटअप की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, स्क्रीनिंग अभियानों के दौरान या जब कम संख्या में यौगिकों के प्रभावों का अध्ययन किया जाना है, उदाहरण के लिए, विषाक्त प्रभाव निर्धारित करने के लिए। सारांश में, यह अनुमान लगाया गया है कि मानव न्यूरॉन्स के फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग का आवेदन जटिल रोग से संबंधित फेनोटाइप का अध्ययन करने और दवा उम्मीदवारों के सेलुलर प्रभावों को चिह्नित करने के लिए एक मूल्यवान तकनीक है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg"> चित्रा 1: मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स से छवि-आधारित फेनोटाइपिक प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti- chicken &#8211; Alexa 647</td>
			<td>Jackson ImmunoRearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td>https://www.anaconda.com/download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Map2</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-213</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse - Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit - Alexa 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21429</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T2928</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138501</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CV7000</td>
			<td>The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>Buffer for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek (Agilent)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution (PFA 16 %)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EM-15710-S</td>
			<td>Fixation before staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Base Medium 1</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1010</td>
			<td>Base medium for neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1087</td>
			<td>Apparently healthy donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1149</td>
			<td>Donor carrying LRRK2 G2019S mutation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Nervous System Supplement</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1031</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Neural Supplement B</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1029</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Python Notebook</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling</td>
			<td>Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td>Plate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFE-360</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-120085</td>
			<td>LRRK2 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoLink</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/PhenoLink</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 384w, PDL coated</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage plates Abgene 120 &#181;L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0781</td>
			<td>Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Permeabilization before lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>Determination of living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vprep Pipetting System&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic profiling of human stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons

पार्किंसंस रोग (पीडी) सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला से जुड़ा हुआ है जो मिडब्रेन डोपामिनर्जिक (एमडीए) न्यूरॉन हानि का कारण बनता है। कई वर्तमान इन विट्रो पीडी सेलुलर मॉडल में जटिलता की कमी होती है और कई फेनोटाइप को ध्यान में नहीं रखते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग समानांतर में पीडी-प्रासंगिक सेल प्रकार में न्यूरोनल फेनोटाइप ्स की एक श्रृंखला को एक साथ मापकर इन कमियों को संबोधित कर सकती है। यहां, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव एमडीए न्यूरॉन्स से फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्राप्त करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक न्यूरॉन-विशिष्ट फ्लोरोसेंट स्टेनिंग पैनल का उपयोग परमाणु, α-सिन्यूक्लिन, टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज (टीएच), और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) से संबंधित फेनोटाइप की कल्पना करने के लिए किया जाता है। वर्णित फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रोटोकॉल स्केलेबल है क्योंकि यह 384-वेल प्लेट्स, स्वचालित तरल हैंडलिंग और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल की उपयोगिता को स्वस्थ दाता एमडीए न्यूरॉन्स और एमडीए न्यूरॉन्स का उपयोग करके उदाहरण दिया जाता है जो ल्यूसीन-समृद्ध रिपीट काइनेज 2 (एलआरआरके 2) जीन में पीडी-लिंक्ड जी 2019 एस उत्परिवर्तन ले जाते हैं। दोनों सेल लाइनों को एलआरआरके 2 किनेज अवरोधक पीएफई -360 के साथ इलाज किया गया था और फेनोटाइपिक परिवर्तनों को मापा गया था। इसके अतिरिक्त, हम प्रदर्शित करते हैं कि क्लस्टरिंग या मशीन लर्निंग-संचालित पर्यवेक्षित वर्गीकरण विधियों का उपयोग करके बहुआयामी फेनोटाइपिक प्रोफाइल का विश्लेषण कैसे किया जा सकता है। वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से न्यूरोनल रोग मॉडलिंग पर काम करने वाले शोधकर्ताओं या मानव न्यूरॉन्स में रासायनिक यौगिक प्रभावों का अध्ययन करने में रुचि रखेगा।

Phenotypic Profiling of Human Stem Cell-Derived Midbrain Dopaminergic Neurons

एमडीए न्यूरॉन्स में फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग प्रयोगात्मक मॉड्यूलेशन के दौरान सेलुलर जीव विज्ञान और उनके परिवर्तनों के कई पहलुओं को निर्धारित करने का एक कुशल तरीका है। इस पद्धति का उदाहरण देने के लिए, ...

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Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (Video) | JoVE

यह प्रोटोकॉल मानव मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के सेल संवर्धन का वर्णन करता है, इसके बाद इम्यूनोलॉजिकल धुंधलापन और अधिग्रहित सूक्ष्म उच्च-सामग्री छवियों से न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइल की पीढ़ी आनुवंशिक या रासायनिक मॉड्यूलेशन के कारण फेनोटाइपिक विविधताओं की पहचान की अनुमति देती है।

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न मिडब्रेन डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...

हम न्यूरॉन्स जैसे विभेदित मानव कोशिकाओं के फेनोटाइपिक प्रोफाइल का निर्माण करते हैं। हमारा लक्ष्य कोशिकाओं पर रासायनिक यौगिक उपचार के समग्र प्रभावों को बेहतर ढंग से समझना है। फेनोटाइपिक प्रोफाइल आगे के यांत्रिक अध्ययन के लिए कम पक्षपाती प्रवेश बिंदुओं का सुझाव दे सकते हैं।मानव डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल की गुणवत्ता में काफी सुधार हुआ है, जिससे सजातीय न्यूरॉन्स के बड़े बैचों का उत्पादन संभव हो गया है। इसके अतिरिक्त, विस्तारित अवधि में विभेदित कोशिकाओं की प्रजनन क्षमता को संभालने के लिए प्रयोगशाला स्वचालन के उपयोग में वृद्धि हुई है, और निश्चित रूप से, इमेजिंग-आधारित डेटा का शोषण तेज और अधिक विस्तृत हो गया है। एक बड़ी चुनौती यह सुनिश्चित करना है कि फेनोटाइपिक प्रोफाइल मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दोनों हैं।इसे प्राप्त करने के लिए, सजातीय न्यूरॉन बैचों का उत्पादन करना और स्वचालन-अनुकूल प्रोटोकॉल की पहचान करना महत्वपूर्ण है। हालांकि, एक स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ, तकनीकी व्यवहार्यता और शारीरिक प्रासंगिकता के बीच हमेशा एक व्यापार-बंद होता है। यहां, हमें एक अच्छा ट्रेड-ऑफ मिला।हमने एक इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके मानव डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स को पूरी तरह से चिह्नित करने के लिए एक तैयार-से-उपयोग समाधान विकसित किया। छवि और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ स्वचालित प्रोटोकॉल, न्यूरोनल फेनोटाइपिक प्रोफाइल बनाने के लिए अधिक वैज्ञानिकों को लैस करेगा। हम बेहतर ढंग से समझना चाहते हैं कि पार्किंसंस रोग के मोनोजेनेटिक और इडियोपैथिक रूपों के बीच फेनोटाइपिक प्रोफाइल कैसे भिन्न होते हैं।हम फेनोटाइपिक पहलुओं में परिवर्तन का भी पता लगाना चाहते हैं जब डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स माइक्रोग्लिया जैसे अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारों के साथ बातचीत करते हैं, उदाहरण के लिए।