Name: Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention d’aide à la recherche scientifique (KAKENHI) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (subvention nos. JP19K10259 et 22K10032 à MAI).

Ce protocole utilise des souris nues mâles âgées de 4 semaines. Hébergez quatre souris dans une cage soumise à un cycle lumière/obscurité de 12 h à 22−24 °C et à une humidité relative de 50 % à 70 %. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale et dentaire de Tokyo (ID d’approbation : A2019-204C, A2020-116A et A2021-121A).
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Artificial Cartilage Implants for Bone Regeneration via Endochondral Ossification

L’utilisation de matériaux d’échafaudage appropriés qui favorisent la transition du cartilage hypertrophique à l’os est une approche prometteuse pour mettre à l’échelle les greffes de cartilage hypertrophique à base de CSM et traiter les défauts osseux de taille cliniquement significative. Ici, nous montrons que l’AH est un excellent matériau d’échafaudage pour soutenir la différenciation du tissu cartilagineux hypertrophique à base de CSM in vitro et pour favoriser la formation osseuse e...

L’os autologue est toujours la référence en matière de réparation des défauts osseux dus à des traumatismes, des malformations congénitales et de la résection chirurgicale. Cependant, la greffe osseuse autogène présente des limites importantes, notamment la douleur du donneur, le risque d’infection et le volume osseux limité qui peut être isolé des patients 1,2,3,4. De nombreux biomatériaux ont été développés comme substituts osseux, combinant des polymères naturels ou synthétiques avec des matériaux minéralisés tels que le phosphate de calcium ou l’hydroxyapatite 5,6. La formation osseuse dans ces matériaux d’ingénierie est généralement réalisée en utilisant le matériau minéralisé comme matériau d’amorçage pour permettre aux cellules souches de se différencier directement en ostéoblastes par le processus d’ossification intramembranaire (IMO)7. Ce processus n’a pas d’étape angiogénique, ce qui entraîne une vascularisation in vivo insuffisante du greffon après l’implantation 8,9,10 et, par conséquent, les approches utilisant un tel processus peuvent ne pas être optimales pour traiter les grands défauts osseux 11.
Il a été démontré que les stratégies appliquées pour récapituler le processus d’ossification endochondrale (ECO), un mécanisme inné de la squelétogenèse au cours du développement, permettent de surmonter des problèmes importants associés aux approches traditionnelles basées sur l’OMI. Dans l’ECO, les chondrocytes de la matrice cartilagineuse libèrent le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), qui favorise l’infiltration vasculaire et le remodelage de la matrice cartilagineuse dans l’os12. L’approche de l’ostéogenèse médiée par l’ECO via le remodelage du cartilage et l’angiogenèse, qui est également activée lors de la réparation des fractures, utilise du tissu cartilagineux créé artificiellement dérivé des CSM comme matériau d’amorçage. Les chondrocytes peuvent tolérer l’hypoxie dans les défauts osseux, induire l’angiogenèse et convertir une greffe de cartilage sans système vasculaire en tissu angiogénique. De nombreuses études ont rapporté que les greffes de cartilage à base de CSM génèrent de l’os in vivo en mettant en œuvre un tel programme ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.
Une condition essentielle pour l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est de savoir comment préparer la quantité souhaitée de greffe de cartilage dans un cadre clinique. Il n’est pas pratique de préparer un cartilage clinique d’une taille adaptée au défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage du greffon doit former intégralement de l’os lorsque plusieurs fragments sont implantés22. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale. De nombreux hydrogels d’origine naturelle soutiennent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ; Cependant, le matériau de support optimal pour répondre aux exigences de l’application clinique n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un polysaccharide biodégradable et biocompatible présent dans la matrice extracellulaire du cartilage33. L’AH interagit avec les CSM via des récepteurs de surface tels que CD44 pour soutenir la différenciation chondrogénique 25,26,28,30,31,32,34. De plus, les échafaudages à base d’AH favorisent la différenciation ostéogénique médiée par l’OMI des cellules souches de la pulpe dentaire humaine35, et les échafaudages combinés au collagène favorisent l’ostéogenèse médiée par l’ECO36,37.
Nous présentons ici une méthode de préparation d’hydrogels d’AH à l’aide de CSM humaines adultes dérivées de moelle osseuse et leur utilisation pour la chondrogenèse hypertrophique in vitro et l’ossification endochondrale ultérieure in vivo38. Nous avons comparé les caractéristiques de l’AH avec celles du collagène, un matériau largement utilisé dans l’ingénierie du tissu osseux avec les CSM et un matériau utile pour la mise à l’échelle des greffons artificiels pour l’ossification endochondrale17. Dans un modèle de souris immunodéprimées, les constructions d’AH et de collagène ensemencées avec des CSM humaines ont été évaluées pour leur potentiel ECO in vivo par implantation sous-cutanée. Les résultats montrent que les hydrogels d’AH sont excellents comme échafaudage pour les CSM afin de créer des greffes de cartilage artificiel qui permettent la formation osseuse par ECO.
Le protocole est divisé en deux étapes. Tout d’abord, des constructions de CSM humaines ensemencées sur de l’hydrogel d’acide hyaluronique sont préparées et différenciées en cartilage hypertrophique in vitro. Ensuite, les constructions différenciées sont implantées par voie sous-cutanée dans un modèle nu pour induire une ossification endochondrale in vivo (Figure 1).

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13571-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>GC Lymphotec</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblastic growth factor</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>RCHEOT002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>012-23881</td>
			<td>7.5 w/v%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dormicum</td>
			<td>Astellas Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>1676045</td>
			<td>&#160;10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haccpper Generator</td>
			<td>TechnoMax</td>
			<td>CH-400-5QB</td>
			<td>50 ppm hypochlorous acid water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyStem Cell Culture Scaffold Kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HYS020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#223;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G supplement</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>090-06741</td>
			<td>&#215;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>016-21841</td>
			<td>200mmol/L (&#215;100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29001-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Thyroxine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 
			BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>165-13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS / pH7.4 100ml</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;3&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>HZ-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>Meiji Seika Kaisha</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiocare Ointment</td>
			<td>SAVAVET/SAVA Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>048-34332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated bone formation through in vivo endochondral ossification using mesenchymal stem cells

La thérapie conventionnelle de régénération osseuse utilisant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est difficile à appliquer aux défauts osseux supérieurs à la taille critique, car elle n’a pas de mécanisme pour induire l’angiogenèse. L’implantation de tissu cartilagineux artificiel fabriqué à partir de CSM induit l’angiogenèse et la formation osseuse in vivo via l’ossification endochondrale (ECO). Par conséquent, cette approche médiée par l’ECO peut être une thérapie de régénération osseuse prometteuse à l’avenir. Un aspect important de l’application clinique de cette approche médiée par l’ECO est l’établissement d’un protocole de préparation d’une quantité suffisante de cartilage à implanter pour réparer le défaut osseux. Il n’est surtout pas pratique de concevoir une seule masse de cartilage greffé d’une taille conforme à la forme du défaut osseux réel. Par conséquent, le cartilage à transplanter doit avoir la propriété de former de l’os intégralement lorsque plusieurs morceaux sont implantés. Les hydrogels peuvent être un outil intéressant pour la mise à l’échelle des greffons d’ingénierie tissulaire pour l’ossification endochondrale afin de répondre aux exigences cliniques. Bien que de nombreux hydrogels d’origine naturelle favorisent la formation de cartilage MSC in vitro et ECO in vivo, le matériau d’échafaudage optimal pour répondre aux besoins des applications cliniques n’a pas encore été déterminé. L’acide hyaluronique (AH) est un composant crucial de la matrice extracellulaire cartilagineuse et est un polysaccharide biodégradable et biocompatible. Ici, nous montrons que les hydrogels d’AH ont d’excellentes propriétés pour soutenir la différenciation in vitro du tissu cartilagineux à base de CSM et favoriser la formation osseuse endochondrale in vivo.

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Les hydrogels d’AH encapsulés dans MSC ont été cultivés dans un milieu chondrogénique supplémenté en TGFβ3, un inducteur de la chondrogenèse41 (étape 4.1). Nous avons comparé les propriétés de l’AH avec celles du collagène, qui s’est avéré efficace dans la création de greffes de cartilage artificiel à base de CSM pour l’ossification endochondrale, comme décrit précédemment38. Les CSM indifférenciées n’ont pas été incluses comme témoins n?...

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Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE

La thérapie osseuse par ossification endochondrale par implantation de tissu cartilagineux artificiel produit à partir de cellules souches mésenchymateuses a le potentiel de contourner les inconvénients des thérapies conventionnelles. Les hydrogels d’acide hyaluronique sont efficaces pour mettre à l’échelle des greffes de cartilage uniformément différenciées ainsi que pour créer un os intégré avec vascularisation entre les greffons fusionnés in vivo.

Formation osseuse intégrée par ossification endochondrale in vivo à l’aide de cellules souches mésenchymateuses

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

Notre recherche vise à développer une méthode qui améliore le manque de circulation sanguine et peut être appliquée aux gros défauts osseux. Le protocole présenté ici ne fait qu’un avec les approches que nous avons adoptées à cette fin. L’approche de la formation osseuse à l’aide de cartilage artificiel, la structure qui imite le processus naturel de développement du squelette au cours de l’embryogenèse.Cette approche est relativement nouvelle dans la recherche sur la régénération osseuse. L’avantage d’induire la néogenèse cartilagineuse, qui n’est pas une méthode actuellement utilisée en pratique clinique, existe pour les greffes osseuses vascularisées. Traditionnellement, la recherche sur la régénération osseuse a utilisé les techniques qui combinent les cellules souches, les biomatériaux et les facteurs de croissance, seuls ou en combinaison.La méthode de formation osseuse par implantation de cartilage artificiel utilise une technique qui fabrique du cartilage artificiel en mélangeant des cellules souches avec des biomatériaux qui servent de matériau d’échafaudage et en induisant une différenciation du cartilage. La guérison clinique du défaut osseux de nos patients nécessite une grande quantité de cartilage artificiel de haute qualité. Notre protocole relève le défi de la production de cartilage artificiel de haute qualité et de la façon de faire fusionner plusieurs cartilages les uns avec les autres pour former un os unifié.Notre protocole permet de générer un cartilage plus gros et de meilleure qualité avec moins de cellules que les protocoles qui utilisent ou non d’autres matériaux d’échafaudage pour créer du cartilage artificiel. De plus, le protocole peut générer un morceau d’os intégré, même avec plusieurs morceaux implantés in vivo. Ceci est important car il n’est pas pratique de préparer du cartilage clinique d’une forme et d’une taille adaptées au défaut osseux.