Name: Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-07-14T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration at JoVE.com

이 연구는 일본과학진흥회(JSPS)의 과학연구지원금(KAKENHI)의 지원을 받았습니다. JP19K10259 및 22K10032에서 MAI로).

이 프로토콜은 생후 4주 된 수컷 누드 마우스를 사용합니다. 22-24°C 및 50%-70% 상대 습도에서 12시간 명암주기 하에 케이지에 4마리의 쥐를 수용합니다. 모든 동물 실험은 도쿄 의과 치과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회가 승인한 지침(승인 ID: A2019-204C, A2020-116A, A2021-121A)에 따라 수행되었습니다.
1. 완충액 및 시약의 준비
<ol><li>MSC 기초 배지에 MSC 성장 배지의 보...

Artificial Cartilage Implants for Bone Regeneration via Endochondral Ossification

비후성 연골에서 뼈로의 전환을 촉진하는 적절한 스캐폴드 재료를 사용하는 것은 MSC 기반 엔지니어링 비대성 연골 이식편을 확장하고 임상적으로 중요한 크기의 뼈 결함을 치료하는 유망한 접근 방식입니다. 여기에서, 우리는 HA가 시험관내에서 MSC 기반 비대성 연골 조직의 분화를 지원하고 생체내에서 내연골골 형성을 촉진하는 우수한 스캐폴드 물질임을 보여준다 38<...

자가 뼈는 여전히 외상, 선천적 결함 및 외과적 절제로 인한 뼈 결함을 복구하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 자가 골 이식술은 기증자의 통증, 감염 위험, 환자로부터 분리할 수 있는 제한된 골량 등 상당한 한계가 있다 1,2,3,4. 천연 또는 합성 고분자를 인산칼슘 또는 하이드록시아파타이트 5,6과 같은 광물화 물질과 결합한 수많은 생체 재료가 뼈 대체품으로 개발되었습니다. 이러한 공학적 물질의 골 형성은 일반적으로 줄기세포가 막내 골화(intramembrane ossification, IMO) 과정을 통해 조골세포(osteoblast)로 직접 분화할 수 있도록 하기 위해 광물화된 물질을 프라이밍 물질로 사용하여 이루어진다7. 이 과정은 혈관신생 단계가 결여되어 이식편 후 이식편의 생체내 혈관화가 불충분하므로8,9,10 이러한 과정을 이용한 접근법은 큰 뼈 결손을 치료하는 데 최적이 아닐 수 있다 11.
발달 중 골격 형성의 타고난 메커니즘인 내연골 골화(ECO) 과정을 재현하기 위해 적용된 전략은 전통적인 IMO 기반 접근 방식과 관련된 중요한 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. ECO에서 연골 템플릿의 연골 세포는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 방출하여 혈관 침투 및 연골 템플릿의 뼈12로의 리모델링을 촉진합니다. 골절 복원 중에도 활성화되는 연골 리모델링 및 혈관신생을 통한 골형성에 대한 ECO 매개 접근법은 MSC에서 유래한 인공적으로 생성된 연골 조직을 프라이밍 재료로 사용합니다. 연골세포는 뼈 결손의 저산소증을 견디고, 혈관신생을 유도하며, 혈관이 없는 연골 이식편을 혈관신생 조직으로 전환할 수 있습니다. 수많은 연구에서 MSC 기반 연골 이식편이 이러한 ECO 프로그램 13,14,15,16,17,18,19,20,21을 구현하여 생체 내에서 뼈를 생성한다고 보고되었습니다.
이 ECO 매개 접근법의 임상 적용을 위한 필수 요건은 임상 환경에서 원하는 양의 연골 이식편을 준비하는 방법입니다. 실제 뼈 결손에 맞는 크기의 임상 연골을 준비하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식편 연골은 여러 개의 절편을 이식할 때 뼈를 일체로 형성해야 한다22. 하이드로겔은 내연골 골화(endochondral ossification)를 위한 조직 공학 이식편을 확장하기 위한 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔은 시험관 내 MSC 연골 형성 및 생체 내 ECO 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; 그러나 임상 적용 요구 사항을 충족하기 위한 최적의 지지 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골33의 세포외 기질에 존재하는 생분해성 및 생체적합성 다당류입니다. HA는 CD44와 같은 표면 수용체를 통해 MSC와 상호 작용하여 연골 분화 25,26,28,30,31,32,34를 지원합니다. 또한, HA 스캐폴드는 인간 치아 치수 줄기 세포(35)의 IMO 매개 골형성 분화를 촉진하고, 콜라겐과 결합된 스캐폴드는 ECO 매개 골형성(36,37)을 촉진한다.
여기에서, 우리는 골수 유래 성인 인간 MSC를 사용하여 HA 하이드로겔을 제조하는 방법 및 시험관내 비대성 연골형성 및 후속 생체내 내연골 골화에 대한 사용 방법을 제시한다 38. HA의 특성을 MSC를 이용한 골조직공학에 널리 적용되는 물질이자 내연골형성을 위한 인공이식편을 확대하는 데 유용한 물질인 콜라겐의 특성과 비교하였다17. 면역 저하 마우스 모델에서, 인간 MSC로 파종된 HA 및 콜라겐 구조체는 피하 착상에 의해 생체 내 ECO 전위에 대해 평가되었습니다. 그 결과, HA 하이드로겔은 ECO를 통해 뼈를 형성할 수 있는 인공 연골 이식편을 만들기 위한 MSC의 발판으로 탁월하다는 것을 보여줍니다.
프로토콜은 두 단계로 나뉩니다. 먼저, 히알루론산 하이드로겔에 파종된 인간 MSC의 작제물을 제조하여 in vitro에서 비후성 연골로 분화합니다. 다음으로, 분화된 구조체를 누드 모델에 피하 이식하여 생체 내 연골 골화를 유도합니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>209-16941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13571-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker</td>
			<td>GC Lymphotec</td>
			<td>CS-02-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>basic fibroblastic growth factor</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>RCHEOT002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>012-23881</td>
			<td>7.5 w/v%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Domitor</td>
			<td>Nippon Zenyaku Kogyo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dormicum</td>
			<td>Astellas Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6429</td>
			<td>high glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D6421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin sulfate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>1676045</td>
			<td>&#160;10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haccpper Generator</td>
			<td>TechnoMax</td>
			<td>CH-400-5QB</td>
			<td>50 ppm hypochlorous acid water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyStem Cell Culture Scaffold Kit</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HYS020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-1&#223;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G supplement</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>090-06741</td>
			<td>&#215;100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Alanyl-L-Glutamine</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>016-21841</td>
			<td>200mmol/L (&#215;100)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>29001-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Thyroxine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 
			BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraffin</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>165-13375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS / pH7.4 100ml</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;3&#160;</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>HZ-1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetorphale</td>
			<td>Meiji Seika Kaisha</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visiocare Ointment</td>
			<td>SAVAVET/SAVA Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical&#160;</td>
			<td>048-34332</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrated bone formation through in vivo endochondral ossification using mesenchymal stem cells

중간엽줄기세포(MSC)를 이용한 기존의 골재생치료는 혈관신생을 유도하는 기전이 없기 때문에 임계치보다 큰 뼈결손에는 적용이 어렵다. MSC로 제작된 인공 연골 조직을 이식하면 내연골 골화(ECO)를 통해 생체 내 혈관신생 및 뼈 형성을 유도합니다. 따라서 이러한 ECO 매개 접근법은 미래에 유망한 뼈 재생 치료법이 될 수 있습니다. 이 ECO 매개 접근법의 임상 적용의 중요한 측면은 뼈 결함을 복구하기 위해 이식할 수 있는 충분한 연골을 준비하기 위한 프로토콜을 수립하는 것입니다. 특히 실제 뼈 결손의 모양과 일치하는 크기의 이식된 연골 덩어리를 설계하는 것은 실용적이지 않습니다. 따라서 이식하는 연골은 여러 조각을 이식할 때 뼈를 일체로 형성하는 성질을 가져야 합니다. 하이드로겔은 임상적 요구 사항을 충족하기 위해 내연골 골화를 위한 조직 공학 이식편을 확장하는 데 매력적인 도구가 될 수 있습니다. 많은 자연 유래 하이드로겔이 in vitro 및 ECO in vivo에서 MSC 연골 형성을 지원하지만, 임상 응용 분야의 요구 사항을 충족하는 최적의 스캐폴드 재료는 아직 결정되지 않았습니다. 히알루론산(HA)은 연골 세포외 기질의 중요한 구성 요소이며 생분해성 및 생체 적합성 다당류입니다. 여기에서 HA 하이드로겔은 MSC 기반 연골 조직의 in vitro 분화를 지원하고 in vivo 내연골 형성을 촉진하는 우수한 특성을 가지고 있음을 보여줍니다.

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

MSC-캡슐화된 HA 하이드로겔은 연골 형성41 의 유도인자인 TGFβ3가 보충된 연골 형성 배지에서 배양하였다(단계 4.1). HA의 특성을 콜라겐의 특성과 비교했는데, 콜라겐은 앞서 설명한 바와 같이 내연골 골화를 위한 MSC 기반 인공 연골 이식편을 만드는 데 효과적인 것으로 나타났습니다38. 미분화 MSC는 골형성 분화(즉, 막내 골화)에 의해 뼈를 생성?...

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Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

우리의 연구는 혈류 부족을 개선하고 큰 뼈 결함에 적용할 수 있는 방법을 개발하고자 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이를 위해 우리가 취한 접근 방식 중 하나입니다. 인공 연골을 이용한 뼈 형성에 대한 접근 방식, 배아 발생 중 골격 발달의 자연적인 과정을 모방하는 구조.이 접근법은 뼈 재생 연구에서 비교적 새로운 것입니다. 현재 임상에서 사용되고 있지 않은 연골 신생을 유도하는 장점은 혈관 골이식에 존재한다. 전통적으로 뼈 재생 연구는 줄기세포, 생체 재료 및 성장 인자를 단독으로 또는 조합하여 결합하는 기술을 사용해 왔습니다.인공연골을 이식하여 뼈를 형성하는 방법은 줄기세포와 비계 소재를 혼합하여 인공연골을 만드는 기술을 이용하여 연골 분화를 유도합니다. 환자의 뼈 결함을 임상적으로 치료하려면 고품질의 인공 연골이 많이 필요합니다. 당사의 프로토콜은 고품질 인공 연골을 생산하는 문제와 여러 연골을 서로 융합하여 통일된 뼈를 형성하는 방법을 다룹니다.당사의 프로토콜은 인공 연골을 만들기 위해 다른 스캐폴드 재료를 사용하거나 사용하지 않는 프로토콜보다 더 적은 수의 세포로 더 크고 고품질의 연골을 생성하는 데 도움이 됩니다. 또한, 이 프로토콜은 생체 내에서 여러 조각을 이식한 경우에도 하나의 통합된 뼈 조각을 생성할 수 있습니다. 이는 뼈 결손에 맞는 모양과 크기의 임상 연골을 준비하는 것이 비현실적이기 때문에 중요합니다.