Name: Optimizing iPSC Differentiation for Efficient Production to Generate Kidney Organoids (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-01T13:20:00
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Estamos muy agradecidos a todos los miembros de Mao y Hu Lab, pasados y presentes, por las interesantes discusiones y las grandes contribuciones al proyecto. Agradecemos al Centro Nacional de Investigación Clínica para la Salud Infantil por el gran apoyo. Este estudio contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang de China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (Subvenciones No. BK20210150 a Gang Wang).

Las iPSCs utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial. Las células se mantuvieron con medio mTeSR en placas recubiertas de matriz de membrana basal disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales). La Tabla 1 contiene todas las composiciones de medios utilizadas en el estudio.
1. Siembra de iPSCs para la diferenciación e inducción de la raya primitiva posterior (PS)
<ol><li>Lave las iPSC en la placa de 6 ...

Using Induced Pluripotent Stem Cell Suspension for Kidney Organoid Production

<ol>
	<li>Tekguc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids:+a+pioneering+model+for+kidney+diseases.">Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases.</a> Translational Research. 250, 1-17 (2022).</li><li>Hill, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+chronic+kidney+disease+-+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis.</a> PLOS ONE. 11 (7), 0158765 (2016).</li><li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+potential+in+organoid+research.">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).</li><li>Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6 (1), 8715 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Mugford, J. W., Sipil&#228;, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osr1+expression+demarcates+a+multi-potent+population+of+intermediate+mesoderm+that+undergoes+progressive+restriction+to+an+Osr1-dependent+nephron+progenitor+compartment+within+the+mammalian+kidney.">Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney.</a> Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).</li><li>SaxOn, L., Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+organogenesis+of+the+kidney.">Early organogenesis of the kidney.</a> Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).</li><li>Kobayashi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six2+defines+and+regulates+a+multipotent+self-renewing+nephron+progenitor+population+throughout+mammalian+kidney+development.">Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development.</a> Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).</li><li>Boyle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+using+Cited1-CreERT2+mice+demonstrates+that+the+cap+mesenchyme+contains+self-renewing+progenitor+cells+and+gives+rise+exclusively+to+nephronic+epithelia.">Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia.</a> Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).</li><li>Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+kidney+organoids:+progress+and+remaining+challenges.">Human kidney organoids: progress and remaining challenges.</a> Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).</li><li>Kumar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+micro-organoids+in+suspension+culture+as+a+scalable+source+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+cells.">Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells.</a> Development. 146 (5), 172361 (2019).</li><li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li></ol>

Se ha descrito un protocolo detallado para la generación de organoides renales a partir de iPSCs, que implica modificaciones menores en el medio basal, la densidad celular inicial y la concentración de CHIR99021. En varios experimentos, se encontró que los factores críticos para la generación exitosa de organoides renales eran la diferenciación inicial del mesodermo intermedio (MI) y el estado celular en el día 7. Además, diferentes líneas de iPSC exhibieron variaciones en la proliferación celular y el potencia...

El riñón desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica, dependiendo de su unidad funcional. Las nefronas, que excretan productos de desecho, pueden regular la composición de los fluidos corporales. La enfermedad renal crónica (ERC), causada por mutaciones hereditarias u otros factores de alto riesgo, eventualmente progresará a enfermedad renal terminal (IRT)1,2. Aparentemente, la IRT se debe a la limitada capacidad de regeneración de las nefronas. Por lo tanto, se requiere terapia de reemplazo renal. La diferenciación dirigida de las iPSC humanas permite la generación in vitro de organoides renales 3D específicos para cada paciente, que pueden utilizarse para estudiar el desarrollo renal, modelar enfermedades específicas del paciente y realizar el cribado de fármacos nefrotóxicos 3,4.
Durante el desarrollo embrionario, los riñones se originan en el mesodermo intermedio (MI), que se diferencia de la estría primitiva (PS). La vía de señalización clásica WNT puede inducir una diferenciación adicional de la IM con la participación coordinada de FGF (FGF9, FGF20) y BMP (señalización Bmp7 a través de JNK)5,6,7. Producen dos importantes poblaciones celulares de células progenitoras nefríticas (NPC): la yema ureteral (UB) y el mesénquima metanéfrico (MM), formando los conductos colectores y la nefrona, respectivamente 8,9. Cada nefrona está formada por segmentos glomerulares y tubulares, como los túbulos proximal y distal, y el asa de Henle10,11. De acuerdo con la teoría mencionada anteriormente, los protocolos actualmente publicados imitan las cascadas de señales y la estimulación del factor de crecimiento para inducir organoides renales 5,12.
En los últimos años, se han desarrollado muchos protocolos para diferenciar las iPSC humanas en organoides renales 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimizaron la duración del tratamiento con CHIR (agonista WNT) antes de la sustitución por FGF9. De acuerdo con su protocolo, la exposición a CHIR durante 4 días, seguida de FGF9 durante 3 días, es la forma más efectiva de inducir IM de iPSC. Se utilizaron filtros Transwell como formato de cultivo en su procedimiento; Sin embargo, este método es difícil para los principiantes. Por lo tanto, Kumar et al.13 intentaron cambiar el formato de la cultura y optaron por suspenderla. Disociaron las células adherentes en el día 7 para sembrarlas en placas de baja adherencia para ayudarlas a ensamblarse en cuerpos embrioides (EB) que contienen estructuras similares a nefronas. Sin embargo, el efecto por lotes de estos métodos fue evidente, especialmente en diferentes iPSC. Además, diferentes literaturas reportaron que la concentración de CHIR varió de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que la concentración de densidad celular y el CHIR podrían afectar a la generación de organoides en diferentes iPSCs, y esto se ha comprobado en numerosas ocasiones en nuestros experimentos. El presente protocolo ha modificado ligeramente el método de estudio de Kumar et al.13 y ha proporcionado a los usuarios un procedimiento paso a paso. El cronograma y el esquema del enfoque se muestran en la Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #701003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #o7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #100-51-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #120-51-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>Cat #HR40&#160;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65698/65698eq01.jpg" style="margin: auto;" />&#160;A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin anti-human LTL (1:300)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>Cat #B-1325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide level shaker</td>
			<td>HAMANY</td>
			<td>Cat #C0-06UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals, peptides, and recombinant proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (Wnt pathway activator)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat #3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain Solution</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat #SL7102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #D22914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 HEPES-free</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>Cat #G4610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Sheep IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab150179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum stoste</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>Cat #MB4516-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>Cat #D1040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Shanghai Jingxin</td>
			<td>Cat #JX-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)</td>
			<td>Earthox</td>
			<td>Cat #E032620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental models: Cell Lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Steri-Cycle CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltre LDEV-Free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>NEST</td>
			<td>Cat #801002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-human CUBN (1:300)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Cat #sc-20607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution (Cell culture supplement)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant FGF-9</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #78161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>Cat #FV3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #M7027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Centrifuge</td>
			<td>HENGNUO</td>
			<td>Cat #2-4B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD31 (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #555444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human ECAD (1:300)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Cat #610182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab30394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #39795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 5X Supplement</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #85851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTube Vials</td>
			<td>Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>Cat #377267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human GATA3 (1:300)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>Cat #5852S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human LRP2 (1:300)</td>
			<td>Sapphire Bioscience</td>
			<td>Cat #NBP2-39033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab224491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human WT1 (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat #ab32570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)</td>
			<td>YEASEN</td>
			<td>Cat #20901ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep anti-human NPHS1 (1:300)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>Cat #AF4269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff APEL 2 Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #05275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Cy3 (1:400)</td>
			<td>Gene Tex</td>
			<td>Cat #GTX85902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat #15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>Cat #72304</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating kidney organoids in suspension from induced pluripotent stem cells

Los organoides renales se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) a través de varios enfoques. Estos organoides son muy prometedores para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y las posibles aplicaciones terapéuticas. Este artículo presenta un procedimiento paso a paso para crear organoides renales a partir de iPSCs, comenzando desde la estría primitiva posterior (PS) hasta el mesodermo intermedio (IM). El enfoque se basa en el medio APEL 2, que es un medio definido y libre de componentes animales. Se complementa con una alta concentración de agonista WNT (CHIR99021) durante 4 días, seguido de factor de crecimiento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina y una baja concentración de CHIR99021 durante 3 días adicionales. Durante este proceso, se hace hincapié en la selección de la densidad celular óptima y la concentración de CHIR99021 al inicio de las iPSC, ya que estos factores son críticos para la generación exitosa de organoides renales. Un aspecto importante de este protocolo es el cultivo en suspensión en una placa de baja adherencia, lo que permite que el IM se desarrolle gradualmente en estructuras nefronas, que abarcan estructuras tubulares glomerulares, tubulares proximales y tubulares distales, todas presentadas en un formato visualmente comprensible. En general, este protocolo detallado ofrece una técnica eficiente y específica para producir organoides renales a partir de diversas iPSC, lo que garantiza resultados exitosos y consistentes.

Generating Kidney Organoids in Suspension from Induced Pluripotent Stem Cells

La producción de IM se logra mediante la activación de la señalización canónica de WNT utilizando el inhibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Desde el día 0 hasta el día 4, las iPSC se expanden rápidamente y adquieren formas romboidales o triangulares. La confluencia alcanza el 90%-100% y se acumula uniformemente hasta el día 7. Tras el cultivo en suspensión, los agregados forman espontáneamente estructuras de nefronas después de disociarse en el día 7. Los organoides renales creados a través ...

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Optimizing iPSC Differentiation for Efficient Production to Generate Kidney Organoids (Video) | JoVE

Este protocolo presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) utilizando condiciones de cultivo en suspensión. El énfasis principal de este estudio radica en la determinación de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT, lo que beneficia a los investigadores interesados en la investigación de organoides renales.

Generación de organoides renales en suspensión a partir de células madre pluripotentes inducidas

Kidney organoids can be generated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) through various approaches. These organoids hold great promise for disease ...

Nuestra investigación presenta un método completo y eficiente para producir organoides renales a partir de células madre pluripotentes inducidas, utilizando condiciones de cultivo en suspensión. Enfatizamos la importancia de la densidad celular inicial y la concentración de agonistas WNT durante la fase de inducción, lo que educará a los nuevos investigadores de organoides. En la actualidad, es difícil obtener una única línea celular de alta densidad para las iPSC.El impacto de los lotes fue notable, particularmente en varias líneas de iPSC. Los organoides renales de cada lote pueden tener una forma y tamaño variados. Se necesitan varios intentos para obtener la mejor densidad celular inicial y la mejor concentración de CHIR para una línea de iPSC.Hemos establecido que la diferenciación inicial del método intermediario es importante para la formación exitosa de organoides renales. Nuestro protocolo describe en detalle cómo elegir las densidades celulares óptimas y las concentraciones de CHIR durante el proceso, ya que las diferentes líneas de iPSC mostraron variaciones en la proliferación celular y la capacidad de diferenciación. Los investigadores pueden generar rápidamente los organoides renales específicos a partir de sus iPSC.De acuerdo con nuestro protocolo, ajustando la densidad celular y la concentración de CHIR, sin duda es beneficioso para todos nuestros investigadores centrarse en su enfermedad renal. La investigación futura de nuestro laboratorio tiene que optimizar el método del protocolo en modelos de enfermedad, regenerar nuevos medicamentos y el cribado de fármacos. En los últimos cinco años, nuestro laboratorio se centrará en la epigenética y el desarrollo de fármacos de diversas enfermedades renales hereditarias, basándose en el desarrollo del paciente, la iPSC y los modelos de enfermedad renal organizada.