Name: Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

이 연구는 MIT와 하버드의 브로드 연구소(Broad Institute of MIT and Harvard)의 치료제 개발 센터(Center for the Development of Therapeutics)의 혁신 및 기술 개발 상(Innovation and Technology Development Award)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 작업을 지원해 준 고위 경영진과 검토 위원회의 구성원들에게 감사의 뜻을 전한다.

모든 단백질은 문헌 프로토콜18에 따라 우수한 수율과 순도(>80%)로 대장균에서 과발현되었습니다. 비오틴화는 BirA-촉매 반응18을 사용하여 수행하였다. 모든 저분자는 100% DMSO에서 1mM 원액으로 준비되었습니다. 여기에 설명된 절차에는 특수 실험실 안전 장비나 예방 조치가 필요하지 않습니다. 표준 실험실 개인 보호 장비(PPE)를 사용해야 합니다(예: 실험?...

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

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	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

PROTAC 분자와 단백질 결합 파트너 간의 이원 및 삼원 상호 작용에 대한 생물물리학적 특성 분석은 널리 사용되는 세포 시스템과 관련하여 독특하고 보완적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. PROTAC 분자의 각 탄두와 단백질 결합 파트너 간의 친화도를 이해하면 이러한 상호 작용을 최적화하기 위한 의약 화학 노력을 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이전에 발표된 삼원 PROTAC 복합체의 결정 구조는...

세포 내 단백질의 폴리유비퀴틴화는 유비퀴틴 리가아제 계열의 효소를 포함하는 엄격하게 조절되는 과정입니다 1,2. 이 경로의 말단 효소는 유비퀴틴 분자를 단백질 결합 파트너에 공유 결합하는 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이다3. 이러한 단백질 결합 파트너의 폴리유비퀴틴화는 프로테아좀4에 의한 단백질 분해를 표적으로 합니다. 이 시스템은 질병에 관여하는 단백질의 분해를 유도하기 위해 치료적으로 활용된 단백질 항상성 과정의 일부이다5. Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 또는 세레블론(CRBN)과 같은 E3 유비퀴틴 리가아제 간의 상호작용을 유도하는 소분자는 일반적으로 분해 표적이 되는 단백질에 결합하는 탄두에 유연한 링커에 의해 연결된 E3 리가아제 결합 탄두로 구성됩니다. 이러한 이종이기능성 분자는 일반적으로 키메라 또는 PROTACS6를 표적으로 하는 단백질 분해라고 합니다.
PROTACS의 개발에는 세포 내 단백질의 분해를 유도하는 분자의 능력 평가가 포함됩니다. PROTAC 분자로 세포를 처리할 때 표적 단백질과 E3 리가아제 성분(예: VHL 또는 CRBN) 간의 유도된 상호 작용을 모니터링하는 많은 세포 분석 시스템이 개발되었습니다. 이러한 세포 분석 중 하나인 nanoluc-Halotag 시스템7은 Halotag 수용체에 융합된 E3 리가아제와 나노루크 공여체로 태그된 표적 단백질을 포함합니다. 삼원 복합체 형성은 nanoluc 공여체와 Halotag 수용체를 근접하게 하여 공여체에서 수용체로 에너지를 전달하여 빛을 방출합니다. 이 시스템의 변형은 PROTACS 분자8의 세포 투과성 또는 표적 단백질 유비퀴틴화9의 상대적 수준의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 시스템은 PROTACS의 최적화를 유도하는 데 필수적이지만, E3 리가아제와 분해 표적 단백질 사이의 복합체 형성은 다단계 과정입니다10,11. 관련된 이원 및 삼원 상호 작용의 동역학 및 열역학은 효율성 유비퀴틴화와 단백질12,13,14의 결과적인 분해에 기여합니다.
본 명세서에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 PROTACS에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성화에 적응할 수 있는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 문헌 보고(13,15)로부터 유래되고 여기에 기술된 Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 MZ1 PROTAC 분자에 대한 SPR 및 ITC 프로토콜은 보고된 절차의 일부 수정을 통해 보고된 결과를 요약할 수 있었으며, 이에 대해 논의될 것이다. MZI, Brd4BD2 및 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 평가하는 데 사용되는 BLI 분석에 대한 설명이 이 보고서에 포함되어 있습니다. BLI의 친화도 측정은 SPR 및 ITC에서 관찰된 것과 일치했습니다. p53 의존적 방식으로 발현이 유도되는 Ser/Thr 단백질 인산가수분해효소인 PPM1D와 CRBN 사이의 PROTAC 유도 삼원 복합체 형성을 평가하기 위해 SPR 분석이 개발된 이전에 발표된 프로토콜도 설명됩니다. 이 경우 PROTAC 분자는 PPM1D에 대해 나노몰 친화도를 갖지만 CRBN에 대해서는 마이크로몰 친화도만 갖습니다. 이 경우 CRBN에 대한 PROTAC 분자의 결합은 포화되지 않아 일반적으로 관찰되는 "후크 효과"가 발생합니다. 갈고리 효과(hook effect)는 두 종이 모두 가교 분자에 결합될 때 이종 삼합체 복합체를 형성할 수 있는 세 가지 신체 시스템의 특성입니다(그림 1)17. 갈고리 효과는 가교 종이 다른 두 종에 비해 과도하게 집중되어 있을 때 관찰됩니다. 결과 상태는 이항 상호 작용이 삼항 상호 작용을 능가하는 상태입니다. 후크 효과가 관찰되는 시스템에는 이 보고서에서 논의된 특정 실험 설계 고려 사항이 필요합니다. PROTAC 유도 삼원 복합체 형성 평가를 위한 생물물리학 분석의 활용을 평가하기 위한 일반 개념 및 시약 요구 사항이 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

분해를 표적으로 하는 E3 리가아제와 단백질은 다단계 공정에서 이종 이작용 분자에 의해 복합체를 형성하도록 유도될 수 있습니다. 관련된 상호 작용의 역학 및 열역학은 유비퀴틴화의 효율성과 결과적으로 단백질의 분해에 기여합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량계(ITC)와 같은 생물물리학 기술은 이러한 상호 작용의 최적화에 사용할 수 있는 귀중한 정보를 제공합니다. 두 가지 모델 시스템을 사용하여 삼원 복합체 형성의 협력성과 결합 역학에 대한 '후크 효과'의 영향을 이해하기 위한 생물물리학 분석 도구 키트를 확립했습니다. 한 사례에서, Brd4BD2와 VHL 사이의 삼원 복합체 형성을 유도하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTAC) 분자를 평가하였다. 이종 이작용 분자 MZ1은 Brd4BD2 단백질(SPR KD = 1nM, ITC K D = 4nM)과 VHL 복합체(SPRKD = 29nM, ITC K D = 66nM) 모두에 대해 nM 친화도를 갖습니다. 이 시스템을 위해 삼원 복합체 형성의 협력성을 입증하는 발표된 결과를 재현하는 강력한 SPR, BLI 및 ITC 분석이 개발되었습니다. 다른 경우에는 46.0kDa 단백질, PPM1D 및 세레블론[CRBN(319-442)] 사이의 삼원 복합체를 유도하는 분자를 연구했습니다. 이종 이작용 분자인 BRD-5110은 PPM1D에 대해 SPR KD = 1nM이지만 잘린 CRBN(319-442) 복합체(SPR KD= ~ 3μM)에 대한 결합은 훨씬 약합니다. 이 경우 SPR에서 CRBN에 대한 바인딩이 포화 상태가 아니므로 "후크 효과"가 발생했습니다. SPR, BLI 및 ITC에 대한 처리량 및 시약 요구 사항을 평가하고 PROTAC 프로젝트에 적용하기 위한 일반적인 권장 사항을 제공했습니다.

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

VHL: MZ1 이원 복합체 및 VHL: MZ1: Brd4BD2 삼원 복합체의 특성 분석은 매우 유사한 버퍼를 사용하여 그림 2(ITC), 그림 3(BLI) 및 그림 4(SPR)에서 찾을 수 있습니다. 직교 분석에서 추출한 KD는 일관성이 있습니다. 협력성은 K D (이진) / KD (삼항)로 계산할 수 있으며, 이는 매우 양수 (ITC에서 15 또는 SPR에서 26)입...

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Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE

여기서는 유비퀴틴 리가아제, Von Hippel-Lindau E3 리가아제(VHL) 및 세레블론(CRBN)을 포함하는 단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성의 생물물리학적 특성 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 본원에 예시된 생물물리학적 방법에는 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생체층 간섭계(BLI) 및 등온 적정 열량측정법(ITC)이 포함된다.

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

우리의 연구는 확립된 모델 시스템을 복제하고, 추가 분석을 통해 검증하고, 특정 연구 맥락에 맞게 이러한 방법론을 조정하는 데 중점을 둡니다. 다양한 프로젝트에 적용할 수 있는 다재다능한 접근 방식을 시연하는 것을 목표로 합니다. 현재의 실험적 과제는 프로젝트별 요구 사항 및 기존 지식 격차에 따라 적절한 분석 형식과 조건을 전략적으로 선택하는 라이센싱입니다.이는 실험에서 효율적이고 정확한 답을 얻는 데 필수적입니다. 당사의 프로토콜은 다양한 ProTech 시스템에 원활하게 적응할 수 있도록 간소화된 접근 방식을 제공합니다. 또한 각 방법에 대한 철저한 평가를 수행하여 각각의 장단점을 강조합니다.특정 조건에 따라 가장 적합한 형식을 선택하는 방법에 대한 정보에 입각한 지침을 제공합니다.