Name: Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

Эта работа была поддержана премией за инновации и развитие технологий от Центра развития терапии при Институте Броуда Массачусетского технологического института и Гарварда. Авторы хотели бы поблагодарить членов высшего руководства и комитет по рассмотрению за поддержку этой работы.

Все белки были гиперэкспрессированы в E.coli с хорошей продуктивностью и чистотой (>80%) в соответствии с литературными протоколами18. Биотинилирование проводили с помощью BirA-катализируемой реакции18. Все малые молекулы получали в исходных растворах 1 мМ в 100% Д?...

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome.">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li><li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy.">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li><li>Toure, M., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+PROTACS:+New+approaches+to+protein+degradation.">Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation.</a> Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).</li><li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation.">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li><li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Биофизическая характеристика бинарных и троичных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками может дать уникальную и дополняющую информацию о широко используемых клеточных системах. Понимание сродства между каждой боеголовкой молекулы PROTAC и ее партн?...

Полиубиквитинирование белков в клетке является жестко регулируемым процессом, в котором участвуют ферменты семейства убиквитин-лигаз 1,2. Концевыми ферментами в этом пути являются убиквитин-лигазы E3, которые ковалентно присоединяют молекулы убиквитина к своим белок-связывающим партнерам3. Полиубиквитинирование этих партнеров, связывающих белки, нацелено на их протеолитическую деградацию протеасомой4. Эта система является частью процесса белкового гомеостаза, который был терапевтически использован для индукции деградации белков, участвующих в заболевании5. Малые молекулы, которые индуцируют взаимодействие между убиквитин-лигазами E3, такие как E3-лигаза фон Хиппеля-Линдау (VHL) или церебблон (CRBN), обычно состоят из боеголовки, связывающей E3-лигазу, соединенной гибким линкером с боеголовкой, которая связывается с белком, предназначенным для деградации. Эти гетеробифункциональные молекулы обычно называют протеолизом, нацеленным на химеры, или PROTACS6.
Разработка PROTACS включает в себя оценку способности молекул индуцировать деградацию белков в клетках. Было разработано множество систем клеточного анализа, которые отслеживают индуцированное взаимодействие между белком-мишенью и компонентами E3-лигазы, такими как VHL или CRBN, при обработке клеток молекулой PROTAC. Один из таких клеточных анализов, система nanoluc-Halotag7, включает в себя E3-лигазу, сплавленную с акцептором Halotag, и белок-мишень, помеченный донором нанолюка. Образование тройного комплекса сближает донор нанолюка и акцептор галотага, что позволяет передавать энергию от донора к акцептору, что приводит к излучению света. Вариации этой системы могут быть использованы для оценки клеточной проницаемости молекул PROTACS8 или изменения относительного уровня убиквитинирования целевого белка9. В то время как эти клеточные системы необходимы для оптимизации PROTACS, образование комплексов между E3-лигазами и белками, предназначенными для деградации, является многоступенчатымпроцессом. Кинетика и термодинамика бинарных и троичных взаимодействий способствуют эффективному убиквитинированию и, как следствие, деградации белка12,13,14.
Описаны протоколы, которые могут быть адаптированы для биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных PROTACS, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), биослойной интерферометрии (BLI) и изотермической титрующей калориметрии (ITC). Протоколы SPR и ITC для молекулы MZ1 PROTAC, которая индуцирует образование тройных комплексов между Brd4BD2 и VHL, полученные из литературных сообщений13,15 и описанные здесь, позволили повторить полученные результаты с некоторой модификацией описанных процедур, которые будут обсуждаться. В настоящий отчет включено описание анализа BLI, используемого для оценки образования тройного комплекса между MZI, Brd4,BD2 и VHL. Измерения сродства с помощью BLI согласуются с теми, которые наблюдались в SPR и ITC. Также описан ранее опубликованный протокол, в котором был разработан SPR-анализ для оценки образования тройного комплекса, индуцированного PROTAC, между PPM1D, протеинфосфатазой Ser/Thr, экспрессия которой индуцируется p53-зависимым образом16, и CRBN. В этом случае молекула PROTAC имеет наномолярное сродство к PPM1D и только микромолярное сродство к CRBN. В этом случае связывание молекулы PROTAC с CRBN не является насыщаемым, что приводит к часто наблюдаемому «эффекту крюка». Крюковый эффект является свойством трех систем организма, в которых есть два вида, которые могут образовывать гетеротримерный комплекс, когда оба связаны с молекулой-мостом (рис. 1)17. Эффект крючка наблюдается, когда перемычка находится в избыточной концентрации по сравнению с двумя другими видами. Результирующее состояние — это состояние, в котором бинарные взаимодействия вытесняют троичные взаимодействия. Системы, в которых наблюдается эффект крюка, требуют специальных соображений по планированию экспериментов, обсуждаемых в этом отчете. Приведены общие понятия и требования к реагентам для оценки использования биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных PROTAC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

Е3-лигазы и белки, предназначенные для деградации, могут быть индуцированы для образования комплексов гетеробифункциональными молекулами в многоступенчатом процессе. Кинетика и термодинамика взаимодействий способствуют эффективности убиквитинирования и, как следствие, деградации белка. Биофизические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и изотермическая титровательная калориметрия (ITC), предоставляют ценную информацию, которую можно использовать для оптимизации этих взаимодействий. С помощью двух модельных систем был создан биофизический инструментарий для понимания кооперативности формирования тройных комплексов и влияния «эффекта крюка» на кинетику связывания. В одном случае был оценен протеолиз, нацеленный на молекулу химеры (PROTAC), которая индуцировала образование тройного комплекса между Brd4BD2 и VHL. Гетеробифункциональная молекула MZ1 обладает нМ сродством как к белку Brd4BD2 (SPR K D = 1 нМ, ITC K D = 4 нМ), так и к комплексу VHL (SPR K D = 29 нМ, ИТК K D = 66 нМ). Для этой системы были разработаны надежные анализы SPR, BLI и ITC, которые воспроизводили опубликованные результаты, демонстрирующие кооперативность образования тройных комплексов. В другом случае была изучена молекула, которая индуцировала тройные комплексы между белком PPM1D с молекулярной массой 46,0 кДа и цереблоном [CRBN (319-442)]. Гетеробифункциональная молекула BRD-5110 имеет SPR KD = 1 нМ для PPM1D, но гораздо более слабое связывание с усеченным комплексом CRBN (319-442) (SPR KD= ~ 3 мкМ). В этом случае связывание CRBN в SPR не насыщалось, что приводило к «хуковому эффекту». Была проведена оценка требований к пропускной способности и реагентам для SPR, BLI и ITC, а также даны общие рекомендации по их применению к проектам PROTAC.

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

Характеристику бинарного комплекса VHL:MZ1 и тройного комплекса VHL:MZ1:Brd4BD2 можно найти на рисунке 2 (ITC), рисунке 3 (BLI) и рисунке 4 (SPR) с использованием очень похожего буфера. K D, извлеченный из ортогональных анализов, является последо...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE

В данной работе мы описываем протоколы биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS), в которых участвуют убиквитин-лигазы фон Хиппеля-Линдау E3-лигазы (VHL) и цереблона (CRBN). Биофизические методы, проиллюстрированные здесь, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойную интерферометрию (BLI) и изотермическую титрованную калориметрию (ITC).

Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Наши исследования сосредоточены на воспроизведении устоявшихся модельных систем, их валидации с помощью дополнительных анализов и адаптации этих методологий к нашему конкретному исследовательскому контексту. Мы стремимся продемонстрировать универсальный подход, который может быть применен к различным проектам. Текущая экспериментальная задача, заключающаяся в стратегическом выборе подходящего формата и условий анализа на основе специфических требований проекта и существующих пробелов в знаниях.Это необходимо для получения эффективных и точных ответов в наших экспериментах. Наш протокол обеспечивает оптимизированный подход для бесшовной адаптации к различным системам ProTech. Кроме того, мы проводим тщательную оценку каждого метода, выделяя их плюсы и минусы.Мы предлагаем обоснованные инструкции по выбору наиболее подходящего формата в зависимости от конкретных условий.