Name: Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett innovations- och teknikutvecklingspris från Center for the Development of Therapeutics vid Broad Institute of MIT och Harvard. Författarna vill tacka medlemmarna i ledningsgruppen och granskningskommittén för deras stöd i detta arbete.

Alla proteiner överuttrycktes i E.coli med god avkastning och renhet (>80%) enligt litteraturprotokollen18. Biotinylering utfördes med hjälp av en BirA-katalyserad reaktion18. Alla små molekyler framställdes vid 1 mM stamlösningar i 100% DMSO. De procedurer som beskrivs här kräver inte specialiserad laboratoriesäkerhetsutrustning eller försiktighetsåtgärder. Standardutrustning för laboratoriets personliga skyddsutrustning (PPE) bör användas (dvs. lab...

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

<ol>
	<li>Balaji, V., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+E3+ubiquitin+ligases+by+homotypic+and+heterotypic+assembly.">Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly.</a> F1000Research. 9, (2020).</li><li>Song, L., Luo, Z. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+regulation+of+ubiquitin+signaling.">Post-translational regulation of ubiquitin signaling.</a> Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).</li><li>Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ubiquitin+ligases:+styles,+structures+and+functions.">E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions.</a> Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).</li><li>Grice, G. L., Nathan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+ubiquitinated+proteins+by+the+proteasome.">The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).</li><li>Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degraders+enter+the+clinic+-+a+new+approach+to+cancer+therapy.">Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).</li><li>Toure, M., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+PROTACS:+New+approaches+to+protein+degradation.">Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation.</a> Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).</li><li>Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+different+E3+ligases+for+small+molecule+induced+protein+ubiquitination+and+degradation.">Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation.</a> ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).</li><li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+live-cell+kinetic+degradation+and+mechanistic+profiling+of+PROTAC+mode+of+action.">Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action.</a> ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).</li><li>Nabet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dTAG+system+for+immediate+and+target-specific+protein+degradation.">The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).</li><li>Paiva, S. -. L., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+protein+degradation:+elements+of+PROTAC+design.">Targeted protein degradation: elements of PROTAC design.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).</li><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+system.">The ubiquitin system.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li><li>Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+target+warhead+and+linkage+vector+on+inducing+protein+degradation:+Comparison+of+bromodomain+and+extra-terminal+(BET)+degraders+derived+from+triazolodiazepine+(JQ1)+and+tetrahydroquinoline+(I-BET726)+BET+inhibitor+scaffolds.">Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).</li><li>Roy, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPR-measured+dissociation+kinetics+of+PROTAC+ternary+complexes+influence+target+degradation+rate.">SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate.</a> ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Gadd, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+PROTAC+cooperative+recognition+for+selective+protein+degradation.">Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).</li><li>Nahta, R., Castellino, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+magnesium-dependent+1+&#948;+(PPM1D),+serine/threonine+protein+phosphatase+and+novel+pharmacological+target+in+cancer.">Phosphatase magnesium-dependent 1 &#948; (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer.</a> Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).</li><li>Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+mathematical+model+for+three-body+binding+equilibria.">A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).</li><li>Zorba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineating+the+role+of+cooperativity+in+the+design+of+potent+PROTACs+for+BTK.">Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).</li><li>Fairhead, M., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+biotinylation+of+purified+proteins+using+BirA.">Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA.</a> Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).</li><li>Nowak, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+binding+confers+selectivity+in+ligand-induced+protein+degradation.">Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation.</a> Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).</li></ol>

Biofysikalisk karakterisering av de binära och ternära interaktionerna mellan PROTAC-molekyler och deras proteinbindande partners kan ge unika och kompletterande insikter i förhållande till allmänt använda cellulära system. Att förstå affiniteten mellan varje stridsspets i en PROTAC-molekyl och dess proteinbindande partners kan hjälpa till att vägleda läkemedelskemiska ansträngningar mot optimering av dessa interaktioner. Tidigare publicerade kristallstrukturer av ternära PROTAC-komplex har avslöjat att at...

Polyubiquitinering av proteiner i cellen är en hårt reglerad process som involverar enzymer i Ubiquitin-ligasfamiljen 1,2. De terminala enzymerna i vägen är E3 ubiquitin-ligaser som kovalent binder ubiquitinmolekyler till sina proteinbindande partners3. Polyubiquitineringen av dessa proteinbindande partners riktar sig mot dem för proteolytisk nedbrytning av proteasom4. Detta system är en del av proteinhomeostasprocessen som har utnyttjats terapeutiskt för att inducera nedbrytningen av proteiner som är involverade i sjukdom5. Små molekyler som inducerar interaktionen mellan E3 ubiquitin-ligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) eller cereblon (CRBN), består vanligtvis av en E3-ligasbindande stridsspets ansluten med en flexibel länkare till en stridsspets som binder till proteinet som är föremål för nedbrytning. Dessa heterobifunktionella molekyler kallas vanligen proteolysriktade chimärer eller PROTACS6.
Utvecklingen av PROTACS innebär att man utvärderar molekylers förmåga att inducera nedbrytning av proteiner i celler. Många cellulära analyssystem har utvecklats som övervakar den inducerade interaktionen mellan målproteinet och E3-ligaskomponenter, såsom VHL eller CRBN, vid behandling av cellerna med en PROTAC-molekyl. En sådan cellulär analys, nanoluc-Halotag-system7, involverar ett E3-ligas som smälts samman med Halotag-acceptorn och ett målprotein som är märkt med en nanoluc-donator. Ternära komplexbildning för nanolucdonatorn och Halotag-acceptorn i närheten, vilket möjliggör överföring av energi från givaren till acceptorn, vilket resulterar i utsläpp av ljus. Variationer av detta system kan användas för att bedöma den cellulära permeabiliteten hos PROTACS-molekyler8 eller förändringar i den relativa nivån av målproteinubiquitinering9. Även om dessa cellulära system är viktiga för att driva optimeringen av PROTACS, är bildandet av komplex mellan E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning en flerstegsprocess10,11. Kinetiken och termodynamiken för de binära och ternära interaktioner som är involverade bidrar till effektivitetubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet12,13,14.
Här beskrivs protokoll som kan anpassas för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av PROTACS med hjälp av ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isoterm titreringskalorimetri (ITC). SPR- och ITC-protokoll för MZ1 PROTAC-molekylen som inducerar ternära komplexbildning mellan Brd4BD2 och VHL härledda från litteraturrapporter13,15 och som beskrivs här kunde rekapitulera de rapporterade resultaten med viss modifiering av de rapporterade procedurerna, vilket kommer att diskuteras. En beskrivning av en BLI-analys som används för att utvärdera ternära komplex bildning mellan MZI, Brd4BD2 och VHL ingår i denna rapport. Affinitetsmätningar från BLI överensstämde med de som observerades i SPR och ITC. Ett tidigare publicerat protokoll där en SPR-analys utvecklades för att bedöma den PROTAC-inducerade ternära komplexbildningen mellan PPM1D, ett Ser/Thr-proteinfosfatas vars uttryck induceras på ett p53-beroende sätt16, och CRBN beskrivs också. I detta fall har PROTAC-molekylen en nanomolär affinitet för PPM1D men endast en mikromolär affinitet för CRBN. I detta fall är bindningen av PROTAC-molekylen till CRBN inte mättnadsbar, vilket resulterar i den allmänt observerade "krokeffekten". Krokeffekten är en egenskap hos tre kroppssystem där det finns två arter som kan bilda ett heterotrimert komplex när båda är bundna till en överbryggande molekyl (Figur 1)17. Krokeffekten observeras när den överbryggande arten är i överkoncentration i förhållande till de två andra arterna. Det resulterande tillståndet är ett tillstånd där de binära interaktionerna konkurrerar ut de ternära interaktionerna. De system där krokeffekten observeras kräver specifika experimentella designöverväganden som diskuteras i denna rapport. Allmänna begrepp och reagenskrav för utvärdering av användningen av biofysikaliska analyser för utvärdering av PROTAC-inducerad ternära komplexbildning tillhandahålls.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td>flat-bottom, black plates used In BLI experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>73520-120</td>
			<td>Plate use for ITC sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>650101</td>
			<td>Plate used to prepare samples for SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto iTC200 micro-calorimeter</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore S200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29136649</td>
			<td>Instrument used to perform SPR experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MZ1</td>
			<td>ProbeChem</td>
			<td>PC-60099</td>
			<td>PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100532</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet Red-384</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>PQA0001</td>
			<td>Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate cover</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28975816</td>
			<td>Plate cover for Greiner plate (650101)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series S SA sensor chip</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>BR100531</td>
			<td>SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18-509</td>
			<td>Coated sensors used in BLI experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the development and application of biophysical assays for evaluating ternary complex formation induced by proteolysis targeting chimeras (protacs)

E3-ligaser och proteiner som är avsedda för nedbrytning kan induceras att bilda komplex av heterobifunktionella molekyler i en flerstegsprocess. Kinetiken och termodynamiken i de inblandade interaktionerna bidrar till effektiviteten av ubiquitinering och resulterande nedbrytning av proteinet. Biofysikaliska tekniker som ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) ger värdefull information som kan användas för att optimera dessa interaktioner. Med hjälp av två modellsystem etablerades en biofysikalisk analysverktygslåda för att förstå kooperativiteten hos ternära komplex och effekten av "krokeffekten" på bindningskinetiken. I ett fall utvärderades en proteolysriktad chimärmolekyl (PROTAC) som inducerade ternära komplexbildning mellan Brd4BD2 och VHL. Den heterobifunktionella molekylen, MZ1, har nM-affiniteter för både Brd4BD2-proteinet (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) och VHL-komplexet (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). För detta system utvecklades robusta SPR-, BLI- och ITC-analyser som reproducerade publicerade resultat som visade kooperativiteten hos ternära komplexbildning. I det andra fallet studerades en molekyl som inducerade ternära komplex mellan ett 46,0 kDa-protein, PPM1D, och cereblon [CRBN (319-442)]. Den heterobifunktionella molekylen, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM för PPM1D men mycket svagare bindning mot det trunkerade CRBN-komplexet (319-442) (SPR KD= ~ 3 μM). I det fallet var bindningen för CRBN i SPR inte mättnadsbar, vilket resulterade i en "hook-effekt". Genomströmnings- och reagenskrav för SPR, BLI och ITC utvärderades, och allmänna rekommendationer för deras tillämpning på PROTAC-projekt tillhandahölls.

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

Karakterisering av VHL: MZ1 binärt komplex och VHL: MZ1: Brd4BD2 ternära komplex finns i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) och figur 4 (SPR) med en mycket liknande buffert. KD extraherad från ortogonala analyser är konsekvent. Kooperativiteten kan beräknas med K D (binär) / KD (ternär), som är mycket positiv (15 från ITC eller 26 från SPR).
Karakterisering ...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes at JoVE.com

Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE

Här beskriver vi protokoll för biofysikalisk karakterisering av ternära komplexbildning inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS) som involverar ubiquitinligaserna Von Hippel-Lindau E3-ligas (VHL) och Cereblon (CRBN). Biofysikaliska metoder som illustreras här inkluderar ytplasmonresonans (SPR), biolagerinterferometri (BLI) och isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Utveckling och tillämpning av biofysikaliska analyser för att utvärdera ternära komplex inducerad av proteolysriktade chimärer (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...

Vår forskning fokuserar på att replikera etablerade modellsystem, validera dem genom ytterligare analyser och anpassa dessa metoder för att passa vår specifika forskningskontext. Vi strävar efter att visa ett mångsidigt tillvägagångssätt som kan tillämpas på olika projekt. Den nuvarande experimentella utmaningen, licensiering strategiskt välja lämpligt analysformat och villkor baserat på projektspecifika krav och befintliga kunskapsluckor.Detta är viktigt för att uppnå effektiva och korrekta svar i våra experiment. Vårt protokoll ger ett strömlinjeformat tillvägagångssätt för sömlös anpassning till olika ProTech-system. Dessutom gör vi en grundlig utvärdering av varje metod och lyfter fram deras respektive för- och nackdelar.Vi erbjuder välgrundade instruktioner om hur du väljer det lämpligaste formatet baserat på specifika förhållanden.