Name: Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-02-23T14:35:00
Duration: 1 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis at JoVE.com

We danken Dr. Raymond Sobel (Stanford University) voor het tonen van zijn methode om hersen- en ruggenmergsecties te verbeteren en te repareren. We danken Kyle Roberton en Milan Ganguly van het Toronto Centre for Phenogenomics voor het leren van de inbeddingsmethode en voor het snijden van zoveel van onze hersen- en ruggenmergsecties. We danken Dr. Matthew Cussick en Dr. Robert Fujinami (University of Utah) voor het delen van hun protocollen voor het scoren van submeningeale en perivasculaire ontsteking in het ruggenmerg. We danken Shalina Ousman voor het delen van de kloon van het CD45-antilichaam. We danken Xiofang Lu voor de training over de weefselprocessor en het weefselinbeddingsstation en het onderhouden van deze apparatuur in het Keenan Research Centre of Biomedical Research in het St. Michael's Hospital. Dit werk werd ondersteund door een biomedische subsidie van MS Canada (aan SED). Carmen Ucciferri wordt ondersteund door een studentschap van de regering van Canada. Nuria Alvarez-Sanchez wordt ondersteund door een Keenan postdoctorale fellowship.

Histological Staining of Spinal Cord for Assessing EAE Disease Severity

<ol>
	<li>Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+as+a+model+for+multiple+sclerosis+(MS).">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS).</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).</li><li>Rasouli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GM-CSF+in+T+is+increased+in+multiple+sclerosis+and+suppressed+by+IFN-beta+therapy.">Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy.</a> J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).</li><li>Zrzavy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+'homeostatic'+microglia+and+patterns+of+their+activation+in+active+multiple+sclerosis.">Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis.</a> Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).</li><li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+multiple+sclerosis+and+related+inflammatory+demyelinating+diseases.">Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases.</a> Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).</li><li>Glatigny, S., Bettelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE)+as+animal+models+of+multiple+sclerosis+(MS).">Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS).</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).</li><li>Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+animal+models:+A+clinical+and+histopathological+perspective.">Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective.</a> Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).</li><li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li><li>Croxford, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokine+GM-CSF+the+inflammatory+signature+of+CCR2++monocytes+and+licenses+autoimmunity.">The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity.</a> Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).</li><li>Jones, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+pathological+outcomes+in+MOG+35-55+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).</li><li>Zuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+gray+matter+demyelination+is+associated+with+leptomeningeal+neutrophil+accumulation.">Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation.</a> JCI Insight. 7 (12), 158144 (2022).</li><li>Bannerman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+pathology+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis:+Studies+in+thy1-yfp+transgenic+mice.">Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice.</a> Brain. 128, 1877-1886 (2005).</li><li>Cahill, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+hind-limb+clasping+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+models+aspects+of+the+neurodegenerative+process+seen+in+multiple+sclerosis.">Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Active induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).</li><li>Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).</li><li>Drohomyrecky, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+acts+within+peripheral+myeloid+cells+to+limit+the+expansion+of+myelin-reactive+T+cells+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(EAE).">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).</a> J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).</li><li>Osorio-Querejeta, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+innovative+animal+monitoring+device+for+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+(&amp;#34;I+am+D+EAE&amp;#34;):+A+more+detailed+evaluation+for+improved+results.">The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis (&amp;#34;I am D EAE&amp;#34;): A more detailed evaluation for improved results.</a> Mult Scler Relat Disord. 63, 103836 (2022).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+diverse+assessment+indicators+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. (187), e63866 (2022).</li><li>Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scoring+disease+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis+using+a+novel+infrared-based+automated+activity-monitoring+system.">Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system.</a> Sci Rep. 9, 19194 (2019).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).</li><li>Disanto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+neurofilament+light:+A+biomarker+of+neuronal+damage+in+multiple+sclerosis.">Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).</li><li>Novakova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+disease+activity+in+multiple+sclerosis+using+serum+neurofilament+light+protein.">Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein.</a> Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).</li><li>Pouzol, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Act-1004-1239,+a+first-in-class+CXCR7+antagonist+with+both+immunomodulatory+and+promyelinating+effects+for+the+treatment+of+inflammatory+demyelinating+diseases.">Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases.</a> FASEB J. 35 (3), 21431 (2021).</li><li>Breakell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obinutuzumab-induced+B-cell+depletion+reduces+spinal+cord+pathology+in+a+CD20+double+transgenic+mouse+model+of+multiple+sclerosis.">Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 21 (18), 6864 (2020).</li><li>Aharoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effect+of+glatiramer+acetate+on+neurofilament+light+chain+leakage+and+glutamate+excess+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis.">Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (24), 13419 (2021).</li><li>Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+distinguish+phosphorylated+and+nonphosphorylated+forms+of+neurofilaments+in+situ.">Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).</li><li>Kuhle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+neurofilament+is+associated+with+progression+of+brain+atrophy+and+disability+in+early+MS.">Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS.</a> Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).</li><li>Benkert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+neurofilament+light+chain+for+individual+prognostication+of+disease+activity+in+people+with+multiple+sclerosis:+A+retrospective+modelling+and+validation+study.">Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study.</a> Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).</li><li>D'Souza, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OGR1/GPR68+modulates+the+severity+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+regulates+nitric+oxide+production+by+macrophages.">OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages.</a> PLoS One. 11 (2), 0148439 (2016).</li><li>Doroshenko, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor-delta+deficiency+in+microglia+results+in+exacerbated+axonal+injury+and+tissue+loss+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 12, 570425 (2021).</li><li>Soulika, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+progression+of+axonopathy+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).</li><li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+Experimental+models+and+reality.">Multiple sclerosis: Experimental models and reality.</a> Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).</li></ol>

Shannon Dunn consulteert voor FSD Lucid Psycheceuticals.

Histologische kleuring van het ruggenmerg is een belangrijk hulpmiddel bij het beoordelen van de ernst van de EAE-ziekte, met name in gevallen waarin er verschillen zijn tussen behandelingsgroepen in de mate van herstel van de ziekte in de postacute fase van de ziekte. Kleuring voor immuuncelinfiltratie (CD45), myeline (LFB) en axonaal letsel (SMI-32) helpt bij het karakteriseren van de onderliggende oorzaak van de veranderde klinische scores bij muizen. Het histologische kleuringsprotocol dat hier wordt beschreven, biedt een perspectief op ontsteking en de mate van myeline- en axonaal letsel. Bovendien valideren de getoonde resultaten sNF-L-meting als een methode om de omvang van de totale neuronale schade bij EAE te beoordelen.
De kritische parameters voor deze analyse zijn ervoor te zorgen dat onderzoekers blind zijn voor de identiteit van de secties en dat er gelijkwaardige bemonstering is op elk niveau van het ruggenmerg bij de verschillende muizen. Dit komt omdat de ernst van de ontsteking groter kan zijn bij lagere niveaus van het koord. Een andere kritische parameter is de grootte van de experimentele groepen. Ruggenmerg en hersenen worden meestal geoogst van 6-8 muizen per groep op het eindpunt om significante verschillen te zien tussen groepen met behandelingen of genotypen met een bescheiden effectgrootte. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat geselecteerde muizen, wanneer gemiddeld, representatieve gemiddelde scores van de hele groep hebben. Wat het oplossen van problemen betreft, is een veelvoorkomend probleem dat wordt ondervonden door degenen die geen ervaring hebben met het protocol, dat het ruggenmerg onvoldoende lang wordt gefixeerd en niet gemakkelijk uit de wervelkolom kan worden geëxtrudeerd. Als dit het geval is, kan het ruggenmerg handmatig van de kolom worden ontleed door met een fijne schaar langs de processus spinosus te knippen en de kolom te openen om het ruggenmerg te onthullen. Als alternatief kunnen weefsels nog een paar dagen worden gefixeerd zonder het succes van antilichaamkleuring te verstoren. De antilichaamklonen die hier worden beschreven, werken in weefsel dat tot 2 weken in formaline is gefixeerd.
Het inbedden van de ruggenmergstukken vereist vaardigheid en oefening. Het wordt aanbevolen om oogloepen te dragen en een lamp op het inbeddingsstation te richten om beter te kunnen zien of de secties in dwarsdoorsnede of in longitudinale doorsnede vallen. Door de lengtes van de stukken ruggenmerg tijdens het groeven op minder dan 2 mm te houden, kunnen ze in dwarsdoorsnede vallen. Een ander veelvoorkomend probleem voor minder ervaren gebruikers is dat de LFB verdampt tijdens de nachtelijke incubatie, waardoor de helft van het objectglaasje bevlekt en de andere helft onbevlekt blijft. Om verdamping te voorkomen, moet de glazen kleurschaal worden afgesloten met thermoplastische folie en vervolgens met plasticfolie. Als er verdamping optreedt en secties ongelijkmatig gekleurd zijn, wordt aanbevolen om de objectglaasjes volledig te ontblauwen met lithiumcarbonaat en ze 's nachts opnieuw te kleuren in LFB. Een ander veelvoorkomend probleem is dat gebruikers de grijze massa na LFB niet volledig ontblauwen. Het is van cruciaal belang om afzonderlijke secties onder de microscoop te onderzoeken om er zeker van te zijn dat er voldoende ontblauwing is bereikt voordat u doorgaat met andere stappen in het protocol. Bovendien, hoewel de CD45- en SMI-32 IHC-kleuringen robuust presteren, is het nog steeds belangrijk om antilichaamconcentraties in voorlopige experimenten op te lossen voor elke nieuwe antilichaampartij die wordt ontvangen. Dit kan worden gedaan door verschillende concentraties van het antilichaam te testen op een positieve controlesectie (EAE-ruggenmerg). De eerste kleuring moet ook een negatieve controle omvatten die alleen bestaat uit secundair antilichaam zonder toevoeging van primair antilichaam. Ten slotte is het van cruciaal belang bij de beeldanalyse om individuele afbeeldingen te drempelen, aangezien de kleuring ongelijkmatig kan zijn over dia's of secties.
Dit protocol maakt gebruik van vrij beschikbare software. Als men geen toegang heeft tot een processor, een embedder of microtoom, kunnen deze stappen worden uitbesteed aan een pathologiekern in een ziekenhuis die deze diensten aanbiedt. Ook als men geen toegang heeft tot een diascanner, kan men een lichtmicroscoop gebruiken die is uitgerust met een videocamera om TIFF-beelden van het ruggenmerg of hersengebieden op te slaan. Voor een op microscoop gebaseerde workflow legt u LFB- of LFB/H&E-secties vast met een laag vermogen (40x vergroting) en voor CD45- en SMI-32-kleuring brengt u ten minste vier vensters in beeld die gecentreerd zijn in de ventrale, dorsale en laterale delen van het ruggenmerg (200x vergroting voor CD45 en 400x vergroting voor SMI-32). Op deze afbeeldingen kan beeldanalyse worden uitgevoerd om kleuring op een vergelijkbare manier te kwantificeren als beschreven.
De beslissing welke histologische benadering moet worden gevolgd om EAE te scoren, hangt af van hoeveel de klinische scores verschillen tussen groepen. Als er bijvoorbeeld drastische verschillen zijn in de klinische score van EAE (de ene groep kreeg EAE en de andere niet), heeft dit meestal betrekking op verschillen in perifeer gemedieerde ontsteking. In dit geval is het voldoende om te scoren op de aanwezigheid van demyeliniserende laesies op LFB/H&E-gekleurde secties en zullen verschillen tussen groepen aan het licht komen. Als groepen bij aanvang meer op elkaar lijken in klinische score en er in plaats daarvan verschillen zijn in de mate van klinisch herstel (bijv. experiment in figuur 5A), is het het beste om de volledige histologische workflow toe te passen die hier wordt geschetst, inclusief het scoren van hersenontsteking in de hersenstam en het cerebellum, om te onderscheiden of de verschillen in de chroniciteit van de ziekte verband houden met verschillen in ontsteking of weefselschade.  Als er verschillen in ontsteking worden gevonden zoals beoordeeld door CD45-telling, kunnen verdere IHC-onderzoeken worden gedaan om te kleuren voor T-cellen (anti-CD3), infiltrerende monocyten/macrofagen (Mac3) en microglia (Iba-1/TMEM119) (aanbevolen antilichaamklonen staan in aanvullende tabel 3). Activering van microglia wordt weerspiegeld door een toename van de intensiteit van Iba-1-kleuring op dubbel gelabelde Iba-1+TMEM-19+ microglia en een verhoogde terugtrekking van microglia-processen die kunnen worden beoordeeld door Sholl-analyse opsecties 32. Bovendien kunnen technieken zoals flowcytometrie of single cell RNA-sequencing worden toegepast om een diepere karakterisering van de frequentie en het fenotype van immuunpopulaties in de hersenen en het ruggenmerg uit te voeren.
Het tellen van SMI-32+ axonen is een gevoelige methode om axonschade op te sporen in EAE32,33 en in MS34. SMI-32, dat de niet-gefosforyleerde vorm van zwaar of medium neurofilament detecteert, hoopt zich op in eindbollen van doorgesneden neuronen. Een alternatief voor het detecteren van gewonde axonen is het kleuren met amyloïde precursoreiwit (APP) dat zich kan ophopen in axonen als gevolg van verstoordaxonentransport33. Het kleuringspatroon voor SMI-32 en APP, hoewel beide een weerspiegeling zijn van axonletsel, overlappen elkaar doorgaans niet, wat aangeeft dat ze verschillende pathologieën detecteren33. Men kan histologische metingen van axonletsel ook aanvullen door sNF-L te meten, wat een snelle en gevoelige maat is voor aanhoudend axonaal letsel in zowel het ruggenmerg als de hersenen. Het biedt het voordeel dat het bij levende muizen in een halve dag kan worden gedaan. Een nadeel van deze methode is dat de kits duur zijn en de machine zeer gespecialiseerd is. Het bedrijf dat de sNF-L-kit verkoopt, biedt wel een vergoeding voor service voor degenen die geen toegang hebben tot een SIMOA-machine. Een alternatief voor het beoordelen van axonletsel is om te scoren voor axonverlies door axonen te tellen in toluïdineblauw gekleurde delen van het ruggenmerg12 of neurofilamentbundels te tellen die door SMI-31 worden gedetecteerd in gebieden van de witte stof van het ruggenmerg32. Beide zijn bewerkelijker benaderingen dan SMI-32- of sNF-L-metingen.
Als de klinische scores van EAE verschillen tussen de groepen, maar de scores voor ontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel geen verschillen tussen groepen aan het licht brengen, kan het nuttig zijn om te kleuren voor astrocytenactivering met behulp van GFAP (zie aanvullende tabel 3 voor aanbevolen antilichaamkloon). Activering van astrocyten wordt geassocieerd met een toename van GFAP-kleuring en het is aangetoond dat dit correleert met EAE-progressie in sommige EAE-modellen, waaronder chronische EAE in de DA-rat35.
Concluderend beschrijft dit protocol methoden en biedt het een analyseworkflow om histologische scores van EAE uit te voeren.

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is het meest voorkomende muizenmodel voor de demyeliniserende ziekte bij de mens, Multiple Sclerose (MS)1. Klassieke MS-inflammatoire pathologie, waaronder de infiltratie van IFN-γ (gamma) en IL-17-producerende T-helpercellen2, de infiltratie van inflammatoire monocyten3, de vorming van perivasculaire en submeningeale inflammatoire demyeliniserende laesies4, en het optreden van axonletsel4 in het centrale zenuwstelsel (CZS), wordt ook waargenomen bij EAE 5,6,7,8,9 . De gelijkenis in immuunmechanismen tussen EAE en MS heeft EAE tot een geschikt preklinisch model gemaakt voor het testen van de werkzaamheid en werkingsmechanismen van een aantal goedgekeurde immuungebaseerde therapieën voor MS, waaronder natalizumab, fingolimod, dimethylfumaraat en glatirameelacetaat (besproken in 1,5). Bepaalde EAE-regimes modelleren andere aspecten van progressieve MS-pathologie dan axonaal letsel, waaronder de ontwikkeling van submeningeale ontsteking in de hersenen, chronische demyelinisatie, atrofie van het ruggenmerg, synaps en verlies van neuronen 6,10,11,12. EAE heeft dus nut voor het screenen van de werkzaamheid van neuroprotectieve therapieën voor MS.
EAE wordt op verschillende manieren geïnduceerd bij knaagdieren. Actieve immunisatie is de meest gebruikelijke inductiemethode en omvat immunisatie van knaagdieren met myeline-antigenen (hele eiwitten of peptiden) geëmulgeerd in CFA, aangevuld met hittegedode Mycobacterium tuberculosis13. Afhankelijk van de muizenstam wordt kinkhoesttoxine (PTX) ook toegediend op dag 0 en dag 2 van immunisatie om de penetrantie van ziekte te verhogen13. EAE kan ook worden geïnduceerd door myeline-specifieke T-cellen verkregen van myeline/CFA-geprimeerde muizen adopterend over te brengen naar gezonde muizen14 of kan zich spontaan ontwikkelen bij muizen die T-celreceptoren tot overexpressie brengen die specifiek zijn voor de belangrijkste myeline-antigenen5.
De ernst en progressie van de EAE-ziekte worden gewoonlijk gescoord met behulp van een discrete 5-punts klinische schaal: 1 – slapheid van de staart, 2 – zwakte van de achterpoten of voeten, 3 – volledige verlamming van een of beide achterpoten, 4 – zwakte van de voorpoten, 5 – stervende of dood13. Dit klinische scoresysteem is goed in het documenteren van de progressie van oplopende verlamming die optreedt bij het begin van de ziekte, maar is minder gevoelig voor het vastleggen van de mate van herstel van CZS-ontstekingsaanvallen. Zowel muizen die moeilijk lopen als muizen die gemakkelijk lopen maar een zwakke voet vertonen, krijgen bijvoorbeeld een score van 2 op de EAE-schaal. Scores kunnen hoog blijven in de postacute fase van EAE vanwege de aanwezigheid van permanent axonletsel of -verlies, zelfs ondanks het verdwijnen van de ontstekingsreactie9. Er zijn verschillende pogingen gedaan om meer verfijnde scoresystemen, gedragstests, metingen van achterpoten en grijpkracht en infraroodbewakingssystemen te ontwikkelen om verschillen in klinische tekorten in EAE 9,16,17,18 beter vast te leggen; Deze meer ingewikkelde scoremetingen maken echter geen onderscheid tussen de bijdrage van ontsteking versus weefselbeschadiging aan de onderliggende neurologische tekorten. De gouden standaardbenadering om de ernst van EAE te scoren, is dus om zowel klinische als histologische scores uit te voeren.
Hier wordt een protocol beschreven voor het ontleden en inbedden van ruggenmerg- en hersenmonsters van muizen in paraffine op een manier die het stochastische proces van laesievorming dat optreedt bij EAE vastlegt. Er wordt ook een protocol gepresenteerd voor het beitsen van secties met Luxol fast blue (LFB), oorspronkelijk gemaakt door Kluver en Barrera19, dat myeline in het CZS detecteert. Secties worden ofwel gekleurd met alleen LFB (voor demyelinisatieanalyse) of worden tegengekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) om ontstekingslaesies te visualiseren en te scoren. Er worden ook protocollen verstrekt om de aanwezigheid van totale leukocyten (CD45), het verlies van myeline en het aantal gewonde axonen (SMI-32) in het ruggenmerg te kwantificeren met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen, immunohistochemische (IHC) technieken en openbaar toegankelijke software. Het protocol dat wordt gebruikt om leukocyten in het ruggenmerg te kwantificeren, kan ook worden toegepast om leukocyten in de hersenen te kwantificeren.
Histologische evaluatie van axonaal verlies en letsel in de hersenen is relatief moeilijker dan in het ruggenmerg, omdat de wittestofbanen van de hersenen niet parallel aan elkaar lopen. De meting van serum neurofilament licht (sNF-L) is naar voren gekomen als een veelbelovende biomarker voor neuronale beschadiging bij MS20,21. Recente studies hebben deze technologie uitgebreid tot EAE 22,23,24. Hier wordt een methode gepresenteerd om serum neurofilament licht (sNF-L) te meten bij levende muizen met behulp van een Small Molecule Assay (SIMOA) assay. Deze methode vereist slechts een kleine hoeveelheid serum en kan in slechts een halve dag bij levende muizen worden uitgevoerd, waardoor snelle feedback wordt gegeven over hoe een geteste therapie het algehele CZS-letsel beïnvloedt. Alle methoden die hier worden beschreven, kunnen worden toegepast op muizen van elk geslacht of stam.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT501128-4L</td>
			<td >Used to fix spinal cord and brain specimens</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1000 mL Glass Beaker</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td >1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL Falcon Tube</td>
			<td >Starstedt</td>
			<td >62.554.100</td>
			<td>Fixing and storing spinal cord and brain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td >4980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >500 mL Glass Beaker</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td >1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >92 mm x 16 mm Petri Dishes</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>82-1473-001</td>
			<td>Used in the tissue grossing procedure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >95% Ethyl Alcohol</td>
			<td >Commercial Alcohols</td>
			<td >P016EA95</td>
			<td>Dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ABC Elite Kit</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >PK6100</td>
			<td>Used for immunohistochemistry labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqua Hold 2 PAP Pen</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >UZ-75955-53</td>
			<td>Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avidin/Biotin Blocking Kit</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >SP-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biosafety Cabinet</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biotinylated rabbit anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Labratories</td>
			<td>BA-4000</td>
			<td>Used for CD45 staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >C57BL6/J Mice</td>
			<td >Jackson Laboratory</td>
			<td >Stock # 664</td>
			<td>These mice were used in experiments shown in paper.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Sorvall ST Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CitriSolv</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >04-355-121</td>
			<td>Used for de-waxing. Is an alternative to xylene</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAB Kit</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >SK-4100</td>
			<td>Used for developing in immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddH2O</td>
			<td >-</td>
			<td >-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable Scalpel</td>
			<td >Magna</td>
			<td >M92-10</td>
			<td>Used for grossing spinal cord and brain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >UZ-48585-60</td>
			<td>Used for histochemical staining and washes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack</td>
			<td >Cole Parmer</td>
			<td >10061392</td>
			<td>Used for immunohistochemistry and histochemistry</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eosin Y</td>
			<td >Bioshop</td>
			<td >173772-87-1</td>
			<td>Stains cytoplasm</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Feather Microtome Blades</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td>12-634-1C</td>
			<td>Used for sectioning paraffin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filter Paper</td>
			<td >Whatman</td>
			<td >1001110</td>
			<td>Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fine Surgical Scissors</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14160-10</td>
			<td>Used to snip brain and the skull</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fumehood</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibco DPBS</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >14190944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glacial Acetic Acid</td>
			<td >BioShop</td>
			<td >ACE333.4</td>
			<td>Used in the luxol fast blue staining procedure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Histoplex Histology Containers</td>
			<td>Starplex Scientific</td>
			<td>565-060-26</td>
			<td>Fixing spinal cord and brain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hydrogen Peroxide</td>
			<td >Fisher Chemicals</td>
			<td >H325-500</td>
			<td>Used to remove endogenous peroxidase in the tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Used for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lens paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >52846-001</td>
			<td>Used for trapping spinal cord species in cassette during processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lithium carbonate</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >554-13-3</td>
			<td>De-blueing after luxol fast blue staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Luxol blue</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >1328-51-4</td>
			<td>Stains CNS myelin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >M.O.M Immunodetection Kit</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >BMK-2202</td>
			<td>Used to stain SMI-32</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methanol</td>
			<td >Fisher Chemicals</td>
			<td >A454.2</td>
			<td>Used for fixation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#39;s Hematoxylin</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >26381-02</td>
			<td>Stains nuclei</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro-Adson Forceps with Teeth</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11027-12</td>
			<td>Used for reflecting the skull during dissections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microvette Capillary Tubes CB 300 Z</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>16.440.100</td>
			<td>Used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micrscope Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12545A</td>
			<td>Used for coverslipping</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12620-938</td>
			<td>Used for making buffers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NF light kit</td>
			<td >Quanterix</td>
			<td >103186</td>
			<td>This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nitrile Gloves</td>
			<td >VWR</td>
			<td >76307-462</td>
			<td>Safety</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Goat Serum</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >S-1000</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal Rabbit Serum</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >S-5000</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >OmniSette Tissue Cassettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >M4935FS</td>
			<td>Used for embedding spinal cord and brain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p1000 Pipette and Tips</td>
			<td >various</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >p200 Pipette and Tips</td>
			<td >various</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraffin Embedding station</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >Model EG1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td>Used for embedding spinal cord and brain</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Permount Mounting Medium</td>
			<td >Fisher Chemicals</td>
			<td >SP15-100</td>
			<td>Used for mounting coverslips on slides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pH meter</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13636AB315B</td>
			<td>Used for pHing buffers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >13-711-20</td>
			<td>Used for pHing buffers</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>Used for making PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td>Used for making PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pressure Cooker</td>
			<td >Nordic Ware</td>
			<td >Tender Cooker</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Purified rat anti-mouse CD45</td>
			<td >Vector Labratories</td>
			<td >553076</td>
			<td>Detects leukocytes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent grade alcohol 100%</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89370-084</td>
			<td>Dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent grade alcohol 70%</td>
			<td >VWR</td>
			<td >64-17-5</td>
			<td>Dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Rotary Microtome</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >Model RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Simoa Machine</td>
			<td>Quanterix</td>
			<td>HD-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Slide Scanner</td>
			<td >Zeiss</td>
			<td>AxioScan.Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SMI-32 mouse IgG1 antibody</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >801701</td>
			<td>Detects damaged axons</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>Used for making PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium Phosphate Dibasic&#160;</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td>Used for making PBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard Adson Forceps</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >11150-10</td>
			<td>Used for dissection steps</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superfrost Plus Microscope slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td>Used to collect sections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Surgical Tough Cuts</td>
			<td >Fine Science Tools</td>
			<td >14110-15</td>
			<td>Used to cut through the spine, body wall, and skin</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tissue Processor</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >Model TP1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-soldium citrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-04-6132</td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween-20</td>
			<td >BioBasic</td>
			<td >9005-64-5</td>
			<td>Used for washing sections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-P Pierce XP-100 plate seal</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>12-140</td>
			<td>Used for the sNF-L Assay</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Fisher Chemicals</td>
			<td >1330-20-7</td>
			<td>Used for de-waxing and clearing sections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Funnel</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-63100-64</td>
			<td>Used to filter formalin before grossing tissue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stir Plate</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Used to make solutions</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oven</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Used to bake tissue sections after cutting</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Used to seal LFB staining dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microwave</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td>Timing may vary depending on the microwave model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td>Used to make blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408--129</td>
			<td>Used to store mouse serum samples</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vortex</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td>Used to prepare samples for sNF-L assay</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Waterbath</td>
			<td >Any</td>
			<td ></td>
			<td>Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een veelvoorkomend immuunmodel van multiple sclerose (MS). Deze ziekte kan bij knaagdieren worden geïnduceerd door actieve immunisatie met eiwitcomponenten van de myelineschede en het adjuvans van Complete Freund (CFA) of door de overdracht van myeline-specifieke T-effectorcellen van knaagdieren die zijn geprimed met myeline-eiwit/CFA naar naïeve knaagdieren. De ernst van EAE wordt doorgaans gescoord op een 5-punts klinische schaal die de mate van oplopende verlamming meet, maar deze schaal is niet optimaal voor het beoordelen van de mate van herstel van EAE. Klinische scores blijven bijvoorbeeld hoog in sommige EAE-modellen (bijv. myeline-oligodendrocytglycoproteïne [MOG] peptide-geïnduceerd model van EAE) ondanks het verdwijnen van de ontsteking. Het is dus belangrijk om de klinische score aan te vullen met histologische scores van EAE, wat ook een middel biedt om de onderliggende mechanismen van cellulaire beschadiging in het centrale zenuwstelsel (CZS) te bestuderen.
Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd om ruggenmerg- en hersensecties van muizen voor te bereiden en te kleuren en om ontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel in het ruggenmerg te scoren. De methode voor het scoren van leukocyteninfiltratie in het ruggenmerg kan ook worden toegepast om hersenontsteking bij EAE te scoren. Er wordt ook een protocol beschreven voor het meten van oplosbaar neurofilamentlicht (sNF-L) in het serum van muizen met behulp van een Small Molecule Assay (SIMOA)-assay, die feedback geeft over de omvang van de algehele CZS-schade bij levende muizen.

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Watch this Scientific Journal Video about Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis at JoVE.com

Unveiling the Pathway Linking Obesity to Autoimmune Inflammation in Multiple Sclerosis (Video) | JoVE

Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) dient als een diermodel van multiple sclerose. Dit artikel beschrijft een benadering voor het scoren van ruggenmergontsteking, demyelinisatie en axonaal letsel bij EAE. Daarnaast wordt een methode gepresenteerd om oplosbare neurofilamentlichtniveaus in het muizenserum te kwantificeren, waardoor de beoordeling van axonaal letsel bij levende muizen wordt vergemakkelijkt.

Scoren van ontsteking, demyelinisatie en axonletsel van het centrale zenuwstelsel bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

We zijn geïnteresseerd in het begrijpen van hoe auto-immuniteit en multiple sclerose of MS ontstaan. Dit onderzoek maakt gebruik van verschillende benaderingen om te bestuderen hoe risicofactoren geassocieerd zijn met MS. Leid tot de ontwikkeling van auto-immuniteit. Experimentele auto-immuun encefalomyelitis of EAE is een muismodel van MS dat kan worden gebruikt om het effect van verschillende risicofactoren op auto-immuniteit te onderzoeken.We hebben onlangs de biologische route ontdekt van hoe een MS-risicofactor, obesitas, leidt tot verhoogde auto-immuunontsteking bij muizen. Studies in het EAE-model waren van cruciaal belang voor het ontrafelen van deze mechanismen. De ernst van de EAE-ziekte wordt vaak gescoord op een vijfpunts klinische schaal.Deze schaal heeft echter een beperkte gevoeligheid en kan niet onderscheiden of klinische tekorten worden veroorzaakt door ontsteking of weefselbeschadiging. Histologie van het ruggenmerg en de hersenen is de gouden standaardmethode om ontstekingen en weefselschade bij EAE te beoordelen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode voor het meten van ontstekingen en weefselschade in het ruggenmerg en de hersenen tijdens EAE.Ons protocol kan naast de klinische schaal worden gebruikt om de ernst van EAE beter te karakteriseren. Ons protocol meet de belangrijkste histologische kenmerken van EAE, waaronder immuuninfiltratie, demyelinisatie, axonale schade in het ruggenmerg en hersenontsteking. Het omvat ook het meten van neurofilamentlicht in muizenserum, dat de omvang van CZS-letsel aangeeft.Dit uitgebreide protocol biedt een gedetailleerdere karakterisering van EAE dan het gebruik van slechts één marker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Harvesting and Fixing Mouse Brain and Spinal Cord Tissues for Histological Scoring of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Harvesting and Fixing Mouse Brain and Spinal Cord Tissues for Histological Scoring of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (Video) | JoVE 

Oogsten en repareren van muizenhersenen en ruggenmergweefsels voor histologische scores van experimentele auto-immuunencefalomyelitis

Paraffin Embedding and Histopathological Scoring of Demyelinating Lesions and Perivascular Cuffs in Mouse Brain and Spinal Cord Tissues

Paraffin Embedding and Histopathological Scoring of Demyelinating Lesions and Perivascular Cuffs in Mouse Brain and Spinal Cord Tissues (Video) | JoVE 