Name: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تنقية خلايا الكبد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للطب التجديدي
Uploaded: 2023-12-01T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا رقم المنحة [23390072].

استخدمت هذه الدراسة خلايا iPS البشرية التي تم الحصول عليها تجاريا (سلالة 253G1) (انظر جدول المواد).
1. صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية
<ol><li>الحفاظ على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية في ظروف خالية من التغذية في وسط AK02 على ...

تنقية خلايا الكبد البشرية المشتقة من iPSC عن طريق فرز الميتوكوندريا-ALCAM

<ol>
	<li>Yamamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+potential+of+pluripotent+stem+cells+correlates+to+the+level+of+CHD7.">Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7.</a> Scientific Reports. 8 (1), 241 (2018).</li><li>Laco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+inconsistencies+of+cardiac+differentiation+efficiency+induced+by+the+GSK3&#946;+inhibitor+CHIR99021+in+human+pluripotent+stem+cells.">Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3&#946; inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).</li><li>Anderson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balancing+serendipity+and+reproducibility:+Pluripotent+stem+cells+as+experimental+systems+for+intellectual+and+developmental+disorders.">Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders.</a> Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).</li><li>Chen, C. X. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+quality+control+workflow+to+evaluate+the+reproducibility+and+differentiation+potential+of+human+iPSCs+into+neurons.">Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+originating+from+induced+pluripotent+stem+cells+and+methods+for+their+prevention.">Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).</li><li>Nori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+safety+issues+of+iPSC-based+cell+therapy+in+a+spinal+cord+injury+model:+oncogenic+transformation+with+epithelial-mesenchymal+transition.">Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition.</a> Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).</li><li>Hentze, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells:+evaluation+of+essential+parameters+for+future+safety+studies.">Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies.</a> Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).</li><li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li><li>Hidaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chamber-specific+differentiation+of+Nkx2.5-positive+cardiac+precursor+cells+from+murine+embryonic+stem+cells.">Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells.</a> The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).</li><li>Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin+induces+differentiation+of+ANP-EGFP+expressing+embryonic+stem+cells+towards+a+pacemaker+phenotype.">Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype.</a> The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).</li><li>Duan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+enrichment+of+hepatocyte-like+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo.</a> Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).</li><li>Takayama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+high-functioning+human+iPS+cell-derived+hepatocyte-like+cells+for+pharmaceutical+research.">Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research.</a> Biomaterials. 161, 24-32 (2018).</li><li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature methods. 7, 61-66 (2009).</li><li>Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte-like+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+can+be+enriched+by+a+combination+of+mitochondrial+content+and+activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule.">Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule.</a> JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Enr&#237;quez, J., P&#233;rez-Martos, A., Montoya, J., Fern&#225;ndez-Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+mitochondrial+activity+and+biogenesis.">Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis.</a> Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).</li><li>Swart, G. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+leukocyte+cell+adhesion+molecule+(CD166/ALCAM):+Developmental+and+mechanistic+aspects+of+cell+clustering+and+cell+migration.">Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration.</a> European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).</li><li>Peters, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asialoglycoprotein+receptor+1+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+hepatocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).</li><li>Kamiya, A., Inagaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor+cell+systems+in+liver+development+and+regeneration.">Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration.</a> Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).</li><li>Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vitro+expansion+system+for+generation+of+human+ips+cell-derived+hepatic+progenitor-like+cells+exhibiting+a+bipotent+differentiation+potential.">An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential.</a> PLOS One. 8 (7), e67541 (2013).</li><li>Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-driven+hepatocyte+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).</li><li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALCAM+(CD166)+is+a+surface+marker+for+early+murine+cardiomyocytes.">ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes.</a> Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).</li><li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li></ol>

نظرا لوظائفها في استقلاب المغذيات وإزالة السموم ، تمتلك خلايا الكبد عددا كبيرا نسبيا من الميتوكوندريا مقارنة بأنواع الخلاياالأخرى 15. ALCAM هو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة ويلعب دورا في التصاق الخلايا والهجرة. يتم التعبير عنها في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك ?...

تعتبر الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات (ES و iPS ، على التوالي) مصادر خلايا واعدة للعلاجات التجديدية. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف كفاءة تمييز هذه الخلايا إلى أنواع محددة من الخلايا المستهدفة ، حتى عند استخدام نفس خط الخلية والبروتوكول والمجرب1،2،3،4. يمكن أن يعزى هذا التباين إلى الحساسية العالية لخلايا ES / iPS البشرية لبيئتها. لذلك ، من الصعب حاليا الحصول على خلايا مستهدفة نقية باستمرار. لتحقيق الطب التجديدي الآمن للغاية ، من الأهمية بمكان القضاء على الخلايا التكاثرية والخلايا الجذعية غير المتمايزة في الخلايا العلاجية ، وتكنولوجيا التنقية المتقدمة للخلايا المستهدفة ضرورية5،6،7.
فارز الخلايا هو جهاز يحلل الخلايا الفردية على الفور ويفرز الخلايا الحية ذات الأهمية بناء على قوة إشارة الفلورسنت ، مما يوفر حلا واعدا. يمكن تحقيق ذلك من خلال تلطيخ الأجسام المضادة لعلامات السطح الخاصة بنوع الخلية أو من خلال استخدام التعبيرات الجينية للمراسل الخاص بنوع الخلية. باستخدام هذه التقنية ، هناك العديد من التقارير حول طرق تنقية خلايا عضلة القلب المشتقة من الخلايا الجذعيةمتعددة القدرات 8،9،10 وخلايا الكبد11،12. طور هاتوري وآخرون طريقة مبتكرة لتنقية الميتوكوندريا باستخدام فارز الخلايا13. الاستفادة من حقيقة أن خلايا عضلة القلب لها متطلبات طاقة عالية من خلال نشاط الميتوكوندريا ، يمكن استخدام تلطيخ الخلايا بالصبغة الحية الإرشادية للميتوكوندريا TMRM (رباعي ميثيل رودامين ميثيل استر) لتسمية وتنقية خلايا عضلة القلب بدرجة عالية بواسطة FACS من الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا. تم تأكيد عدم وجود ورم من خلال فحوصات تشكيل الورم المسخي مع خلايا عضلة القلب المنقى. علاوة على ذلك ، اكتشف Yamashita et al. بشكل غير متوقع طريقة لتنقية خلايا الكبد من الأجسام الجنينية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق عزل الكسور ذات النشاط العالي للميتوكوندريا والتعبير الإيجابي ALCAM14. الأساس المنطقي لهذه الطريقة هو أن خلايا الكبد تحتوي أيضا على عدد كبير نسبيا من الميتوكوندريا بسبب استهلاكها العالي ل ATP لاستقلاب المغذياتوإزالة السموم 15 ، وتعبر خلايا الكبد عن ALCAM ، وهو عضو في عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة ، والتي تلعب دورا في التصاق الخلايا والهجرة16.
تطلبت الطرق السابقة عالية التنقية لخلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات تعديلات وراثية ، وكانت طرق التنقية غير الجينية منخفضةالكفاءة 17. الطريقة غير الوراثية للميتوكوندريا لها ميزة لتحقيق نقاء عالي. عند الحاجة إلى الخلايا السلفية الكبدية ، يمكن اختيار الطرق المستندة إلى CD133 و CD13 أو Dlk118,19. على الرغم من تقدم دقة تقنية تحرير الجينوم ، إلا أنه لا يمكن القضاء تماما على المخاطر المحتملة للتغيرات الجينومية غير المتوقعة (مثل التسرطن). يمكن أن تكون الطرق القائمة على نشاط الميتوكوندريا ، دون إشراك التعديل الوراثي ، خالية من هذه المخاطر.
نتيجة لفحص مؤشرات الميتوكوندريا المختلفة في خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة ، لوحظ أن TMRM تختفي تماما في غضون 24 ساعة ، بينما بقيت الأصباغ الأخرى لمدة 5 أيام على الأقل13. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أن TMRM و JC-1 لم يؤثرا على صلاحية الخلية عند تقييمهما باستخدام مقايسة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT) ، بينما أظهرت أصباغ أخرى تأثيرات متفاوتة على صلاحية الخلية13. TMRM يدل على سلامة أعلى.
حتى الآن ، تم تطوير العديد من طرق التمايز ثنائية الأبعاد (2D) كنهج أكثر كفاءة لإحداث التمايز مقارنة بتكوين الجسم الجنيني ثلاثي الأبعاد (3D). وذلك لأن المركبات المحفزة للتمايز التدريجي أو السيتوكينات يمكن أن تدار بشكل موحد للخلايا على مستوى 2D ، بدلا من مساحة 3D. في هذه الدراسة ، تم تعديل الطريقة20 المبلغ عنها سابقا للحث على التمايز في خلايا الكبد البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. هنا ، يتم وصف تفاصيل إجراءات تمايز 2D الحديثة وتنقية خلايا الكبد المشتقة من خلايا iPS البشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>253G1 human iPS cell line</td>
			<td>RIKEN BioResource Research Center</td>
			<td>HPS0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Activin A Solution, Human, Recombinant</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>18585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB1281</td>
			<td>Antibody against human nuclear antigen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50x), serum free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10182&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciclosporin A</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>035-18961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>034-22363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Gel-like basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CultureSure Y-27632</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>036-24023</td>
			<td>ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>047-18863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>047-29353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>51820-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 silk</td>
			<td>Nippi</td>
			<td>892021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmunoBlock</td>
			<td>KAC</td>
			<td>CTKN001</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-G Supplement(&#215;100)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>090-06741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>128-06075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>H293745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>28353-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>189-02025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium L-Ascorbate</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>03422-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit AK02N</td>
			<td>REPROCELL</td>
			<td>RCAK02N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS (10x)</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>12748-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>28229-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>NACALAI TESQUE, INC.</td>
			<td>20577-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRYPSIN 250</td>
			<td>Difco</td>
			<td>215240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose phosphate broth solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8159</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of live mitochondria staining in cell-sorting to purify hepatocytes derived from human induced pluripotent stem cells

الجذع الجنيني البشري (ES) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) لها تطبيقات محتملة في الطب التجديدي القائم على الخلايا لعلاج الأعضاء المريضة بشدة بسبب تكاثرها غير المحدود وخصائصها متعددة القدرات. ومع ذلك ، فإن التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية / الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية إلى أنواع خلايا مستهدفة نقية بنسبة 100٪ يمثل تحديا بسبب حساسيتها العالية للبيئة. يحدث تكوين الورم بعد الزرع بسبب الخلايا الملوثة والمكاثرة وغير المتمايزة ، مما يجعل تقنية التنقية العالية ضرورية لتحقيق آمن للطب التجديدي. للتخفيف من خطر تكوين الأورام، تم تطوير تقنية عالية التنقية لخلايا الكبد البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. تستخدم الطريقة FACS (فرز الخلايا المنشط بالتألق) باستخدام مزيج من المحتوى العالي للميتوكوندريا وعلامة سطح الخلية ALCAM (جزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط) دون تعديل وراثي. 97٪ ± 0.38٪ (ن = 5) من خلايا الكبد المنقاة باستخدام هذه الطريقة أظهرت تعبيرا عن بروتين الألبومين. تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات مفصلة لهذه الطريقة ، كما هو مطبق على أحدث طريقة تمايز ثنائية الأبعاد لخلايا iPS البشرية إلى خلايا الكبد.

Embryonic and induced pluripotent stem cells (ES and iPS, respectively) are considered promising cell sources for regenerative therapies. However, the efficiency of differentiating these cells into specific target cell types can vary, even when using the same cell line, protocol, and experimenter1,2,3,4. This variability may be attributed to the high sensitivity of human ES/iPS cells to their environment. Therefore, it is currently difficult to consistently obtain pure target cells. To achieve highly safe regenerative medicine, it is crucial to eliminate proliferative cells and undifferentiated stem cells in therapeutic cells, and advanced purification technology for target cells is essential5,6,7.
A cell sorter is a device that instantaneously analyzes individual cells and sorts live cells of interest based on the fluorescent signal strengths, offering a promising solution. This can be accomplished through antibody staining of cell type-specific surface markers or by utilizing cell type-specific reporter gene expressions. Using this technique, there are several reports on methods for purifying pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes8,9,10 and hepatocytes11,12. Hattori et al. developed an innovative mitochondrial purification method using a cell sorter13. Taking advantage of the fact that cardiomyocytes have high energy demands through mitochondrial activity, staining the cells with the live mitochondria-indicative dye TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) can be used to label and highly purify cardiomyocytes by FACS from human ES cell-derived embryoid bodies containing various cell types. The absence of tumorigenicity was confirmed by teratoma formation assays with the purified cardiomyocytes. Furthermore, Yamashita et al. unexpectedly discovered a method to purify hepatocytes from human ES cell-derived embryoid bodies by isolating fractions with high mitochondrial activity and ALCAM-positive expression14. The rationale for this method is that hepatocytes also have a relatively high number of mitochondria due to their high consumption of ATP for nutrient metabolism and detoxification15, and hepatocytes express ALCAM, a member of the immunoglobulin superfamily, which plays a role in cell adhesion and migration16.
Previous highly purifying methods for pluripotent stem cell-derived hepatocytes required genetic modifications, and non-genetic purification methods had low efficiency17. The mitochondrial non-genetic method holds merit for achieving high purity. When hepatic progenitor cells are needed, CD133 and CD13- or Dlk1-based methods18,19 can be chosen. Although the accuracy of genome editing technology has advanced, the potential risk of unforeseen genomic changes (e.g., carcinogenesis) cannot be entirely eliminated. Methods based on mitochondrial activity, without involving genetic modification, can be free from such risks.
As a result of examining various mitochondrial indicators in neonatal rat cardiomyocytes, TMRM was observed to disappear completely within 24 h, whereas other dyes remained for at least 5 days13. Moreover, it is important to note that TMRM and JC-1 did not impact cell viability when assessed with the 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, while other dyes demonstrated varying effects on cell viability13. TMRM demonstrates higher safety.
To date, several two-dimensional (2D) differentiation methods have been developed as more efficient approaches for inducing differentiation compared to three-dimensional (3D) embryoid body formation. This is because step-wise differentiation-inducing compounds or cytokines can be uniformly administered to cells on a 2D plane, rather than in a 3D space. In this study, the previously reported method20 was modified to induce differentiation into human iPS cell-derived hepatocytes. Here, the details of the procedures for the up-to-date 2D differentiation and purification of hepatocytes derived from human iPS cells are described.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير تنقية خلايا الكبد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان للطب التجديدي

تطبيق تلطيخ الميتوكوندريا الحية في فرز الخلايا لتنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

The scope of our research is to purify human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, using without genetic modification. We aim to address the issue of the tumorigenic risk associated with the undifferentiated cells, among those differentiated from human iPS cells. One of the current experimental challenges is a low cell purity, due to the mechanical storage of sorting.We are developing a new purification method, that utilizes the unique metabolism features of hepatocytes, for large-scale purification. One non-cell sorting method for hepatic progenitor cells cannot obtain pure hepatocytes. Another one for mature hepatocytes can only treat a small fraction of hepatocytes, because of the limited expression of the marker protein.In contrast, our approach can obtain hepatocytes at different maturation levels with a higher eve. Human iPS cell-derived hepatocytes are extremely immature, and show more reduced hepatocyte macro expression after purification. Our future goal is to enhance hepatocyte modulation using organoidal technology and day-to-day advancements to regenerative medicine and drug discovery.

يوضح الجدول الزمني للعمليات التي تحفز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية على التمايز إلى خلايا كبدية من خلال ثقافة ثنائية الأبعاد (الشكل 1 أ) وخصائص الخلية التمثيلية (الشكل 1 ب). تقريبا في يوم التمايز 12 ، بدأت الخلايا في إظهار أشكال الخلايا متعد...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

يمكن تنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال فرز الخلايا ، باستخدام مزيج من تلطيخ الميتوكوندريا وجزيء التصاق خلايا الكريات البيض المنشط (ALCAM ، المعروف أيضا باسم CD166).

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely ...

نطاق بحثنا هو تنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، باستخدام دون تعديل وراثي. نحن نهدف إلى معالجة مسألة المخاطر السرطانية المرتبطة بالخلايا غير المتمايزة ، من بين تلك المتمايزة عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات البشرية. أحد التحديات التجريبية الحالية هو انخفاض نقاء الخلية ، بسبب التخزين الميكانيكي للفرز.نحن نعمل على تطوير طريقة تنقية جديدة ، تستخدم ميزات التمثيل الغذائي الفريدة لخلايا الكبد ، للتنقية على نطاق واسع. لا يمكن لإحدى طرق الفرز غير الخلوية للخلايا السلفية الكبدية الحصول على خلايا كبدية نقية. واحد آخر لخلايا الكبد الناضجة يمكن أن يعالج فقط جزء صغير من خلايا الكبد ، بسبب التعبير المحدود لبروتين العلامة.في المقابل ، يمكن لنهجنا الحصول على خلايا الكبد عند مستويات نضج مختلفة مع عشية أعلى. خلايا الكبد البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات غير ناضجة للغاية، وتظهر المزيد من الانخفاض في التعبير الكلي لخلايا الكبد بعد التنقية. هدفنا المستقبلي هو تعزيز تعديل خلايا الكبد باستخدام التكنولوجيا العضوية والتطورات اليومية في الطب التجديدي واكتشاف الأدوية.

application-live-mitochondria-staining-cell-sorting-to-purify

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human embryonic stem (ES) and induced pluripotent stem (iPS) cells have potential applications in cell-based regenerative medicine for treating severely diseased organs due to their unlimited proliferation and pluripotent properties. However, differentiating human ES/iPS cells into 100% pure target cell types is challenging due to their high sensitivity to the environment. Tumorigenesis after transplantation is caused by contaminated, proliferating, and undifferentiated cells, making high-purification technology essential for the safe realization of regenerative medicine. To mitigate the risk of tumorigenesis, a high-purification technology has been developed for human iPS cell-derived hepatocytes. The method employs FACS (fluorescence-activated cell sorting) using a combination of high mitochondrial content and the cell-surface marker ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) without genetic modification. 97% &plusmn; 0.38% (n = 5) of the purified hepatocytes using this method exhibited albumin protein expression. This article aims to provide detailed procedures for this method, as applied to the most current two-dimensional differentiation method for human iPS cells into hepatocytes.

Hepatocytes derived from pluripotent stem cells can be purified through cell sorting, using a combination of mitochondrial and activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM, also known as CD166) staining.

Hepatic Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells in 2D Cultures

To begin, coat each well of a six-well plate with one milliliter of basement membrane matrix and incubate at 37 degrees Celsius for one hour. Remove the coated matrix from the plate and add human-induced pluripotent stem cells prepared in AK02N medium supplemented with 10 micromolar ROCK inhibitor. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for three days.After three days, on day zero of the initiating hepatic differentiation, wash the cells once with RPMI 1640 medium. Next, to initiate endoderm differentiation, add RPMI B27 GlutaMAX supplemented with three to six micromolar CHIR 99021 and 100 nanograms per milliliter Activin A into the plate. Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours.On day one, replace the existing medium with RPMI B27 GlutaMAX supplemented with 50 nanograms per milliliter of Activin A.Incubate the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 24 hours. On day two, to induce hepatic progenitor differentiation, replace the existing medium with RPMI B27 GlutaMAX medium supplemented with 1%dimethyl sulfoxide, and continue incubation for up to five days. On day seven, to initiate hepatocyte maturation, switch to hepatocyte maturation medium and incubate for 20 days at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.On day 27, human-induced pluripotent stem cells displayed polygonal cell shapes and rounded nuclei, characteristics of hepatocytes.

التمايز الكبدي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان في الثقافات 2D

Cell Preparation for Purification of Human-Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Hepatocytes

After 27 days of initiating hepatic differentiation of human induced pluripotent stem cells, wash the cells with two milliliters of PBS per well. Prepare the enzyme solution in ADS buffer using the given components. Add one milliliter of solution per well of a six well plate.Place the plate at 37 degrees Celsius on a rotating shaker for about two hours to detach the cells from the plate. Confirm the cell detachment under a microscope, then pipette the cell suspension to disperse into single cells, and collect them in a 50 milliliter tube containing the hepatocyte maturation medium. Centrifuge the cell suspension at 200G for five minutes at 18 degrees Celsius.And using an aspirator, remove the supernatant. To stain the mitochondria of cells, resuspend the pellet in five milliliters of hepatocyte maturation medium containing 100 nanomolar TMRM. Incubate the cells for 30 minutes at 37 degrees Celsius while protecting them from light.Again, centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one to five milliliters of cold ADS buffer containing 2%FBS. After cell counting, aliquot 500, 000 cells to a 1.5 milliliter tube and label it as the no primary antibody control. Centrifuge the remaining cell suspension at 200G for five minutes at four degrees Celsius, and remove the supernatant.Add 100 microliters of diluted primary antibody per one million cells. Transfer the cell suspension to a 1.5 milliliter tube and incubate on ice for 50 minutes. After incubation, centrifuge the cell suspension and wash the cells twice with cold ADS buffer containing 2%FBS.Now add 100 microliters of diluted secondary antibody per one million cells to the primary antibody, stained or unstained cells, and incubate for 30 minutes on ice. Again, centrifuge the cell suspension and wash the cells twice with cold ADS buffer containing 2%FBS. After resuspending the cells in ADS buffer, filter them through a snap cap cell strainer and place the tube on ice.

تحضير الخلايا لتنقية خلايا الكبد المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Fluorescence-Activated Cell Sorting of Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

To begin, set up the fluorescence-activated cell sorting, or FACS machine, for cell sorting following the manufacturer's instructions. Place the sample tube on the FACS machine and load it. Gate TMRM-high and ALCAM negative population in the P1 region to sort non-hepatocytes.Then gate the TMRM high and ALCAM positive population in the P2 region to sort hepatocytes. Collect sorted cells in 15-milliliter collection tubes containing hepatocyte maturation medium. After sorting, remove the collection tube from the FACS machine.Centrifuge the sorted cell suspension at 200 G for five minutes at 18 degrees Celsius. Remove the supernatant, and re-suspend the pellet in two milliliters of hepatocyte maturation medium with 10 micromolar rock inhibitor and 20 nanomolar cyclosporine A.Seed the cells on mitomycin C-treated mouse embryonic fibroblasts with hepatocyte maturation medium in a six-well plate. Culture the cells in a 37-degree Celsius carbon dioxide incubator for five days before immuno staining for hepatocyte purity test.FACS analysis conducted on day 27 of hepatic differentiation revealed TMRM high and ALCAM positive population. The immunohistochemical staining of P1 and P2 cells cultured on mouse embryonic fibroblasts after sorting is shown. A purity test by counting albumin-positive cells showed 0%of P1, and approximately 97%of P2 cells were hepatocyte-like cells.