Name: Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-08-18T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82122048; 82003773; 82203380) og Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2023A1515011416).

Humanbiopsert vev ble innhentet fra den respektive pasienten ved Affiliated Cancer Hospital og Institute of Guangzhou Medical University, og informert samtykke ble innhentet fra pasientene. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.
1. Etablering av pasientavledede HCC-organoider fra kirurgiske prøver
MERK: Etableringen av HCC-organoider omfatter ulike stadier, n...

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

<ol>
	<li>Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocellular+carcinoma.">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).</li><li>Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+in+hepatocellular+carcinoma.">Tumour evolution in hepatocellular carcinoma.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 17 (3), 139-152 (2020).</li><li>Yang, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+view+of+hepatocellular+carcinoma:+trends,+risk,+prevention+and+management.">A global view of hepatocellular carcinoma: trends, risk, prevention and management.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 16 (10), 589-604 (2019).</li><li>Huang, A., Yang, X. R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+hepatocellular+carcinoma.">Targeted therapy for hepatocellular carcinoma.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 146 (2020).</li><li>Cancer Genome Atlas Research Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+and+Integrative+Genomic+Characterization+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Comprehensive and Integrative Genomic Characterization of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cell. 169 (7), 1327.e23-1341.e23 (2017).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+patient-derived+cancer+organoids+for+drug-screening+applications.">Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).</li><li>Peng, W. C., Kraaier, L. J., Kluiver, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+organoids+and+cell+transplantation:+What+the+future+holds.">Hepatocyte organoids and cell transplantation: What the future holds.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 53 (10), 1512-1528 (2021).</li><li>Nuciforo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+liver+cancers+derived+from+tumor+needle+biopsies.">Organoid models of human liver cancers derived from tumor needle biopsies.</a> Cell Reports. 24 (5), 1363-1376 (2018).</li><li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hepatocyte+differentiation+model+reveals+two+subtypes+of+liver+cancer+with+different+oncofetal+properties+and+therapeutic+targets.">A hepatocyte differentiation model reveals two subtypes of liver cancer with different oncofetal properties and therapeutic targets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (11), 6103-6113 (2020).</li><li>Kong, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor+lineage+plasticity+in+hepatocellular+carcinoma+using+an+anti-CLDN6+antibody-drug+conjugate.">Targeting tumor lineage plasticity in hepatocellular carcinoma using an anti-CLDN6 antibody-drug conjugate.</a> Science Translational Medicine. 13 (579), eabb6282 (2021).</li><li>Li, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+potential+oncofetal+targets+in+human+hepatocellular+carcinoma.">Identification and functional characterization of potential oncofetal targets in human hepatocellular carcinoma.</a> STAR Protocols. 3 (4), 101921 (2022).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell-mediated+therapeutic+resistance+in+hepatocellular+carcinoma.">Cancer stem cell-mediated therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma.</a> Hepatoma Research. 8, 36 (2022).</li></ol>

En bemerkelsesverdig fordel med pasientavledede organoidmodeller ligger i deres evne til trofast å replikere de biologiske egenskapene til svulster, som omfatter vevstruktur og genomisk landskap. Disse modellene viser et bemerkelsesverdig nivå av nøyaktighet og speiler effektivt heterogeniteten og progresjonen av svulster, selv over lengre perioder med dyrking 6,8,9. Gjennom bruken av denne raffinerte organoidkulturprotokolle...

Hepatocellulært karsinom (HCC), en utbredt og omfattende mangfoldig svulst1, har fått betydelig oppmerksomhet i det medisinske samfunnet. Tilstedeværelsen av avstamningsplastisitet og betydelig heterogenitet i HCC antyder at tumorceller som stammer fra forskjellige pasienter og til og med forskjellige lesjoner hos samme pasient, kan manifestere forskjellige molekylære og fenotypiske egenskaper, og dermed presentere formidable hindringer i utviklingen av innovative terapeutiske tilnærminger 2,3,4,5 . Det er derfor et tvingende behov for økt forståelse av de biologiske egenskapene og mekanismene for legemiddelresistens i HCC for å informere formuleringen av mer effektive behandlingsstrategier.
I de siste tiårene har forskere dedikert sin innsats til utvikling av in vitro-modeller med det formål å studere HCC 3,4. Til tross for noen fremskritt, fortsetter begrensningene. Disse modellene omfatter en rekke teknikker, for eksempel bruk av cellelinjer, primære celler og pasientavledede xenotransplantater (PDX). Cellelinjer fungerer som in vitro-modeller for langsiktig kultur av tumorceller oppnådd fra HCC-pasienter, og tilbyr fordelene med bekvemmelighet og lett ekspansjon. Primære cellemodeller involverer direkte isolasjon og kultur av primære tumorceller fra pasientens tumorvev, og gir dermed en representasjon av biologiske egenskaper som ligner pasientene selv. PDX-modeller innebærer transplantasjon av pasientens tumorvev i mus, med sikte på mer trofast å simulere tumorvekst og respons. Disse modellene har vært medvirkende til HCC-forskning, men de har visse begrensninger, inkludert heterogeniteten til cellelinjer og manglende evne til å replikere in vivo-forhold fullt ut. Videre kan langvarig in vitro-dyrking føre til forringelse av cellenes opprinnelige egenskaper og funksjon, noe som gir utfordringer med å nøyaktig representere de biologiske egenskapene til HCC. I tillegg er bruken av PDX-modeller både tidkrevende og kostbar3.
For å løse disse begrensningene og mer nøyaktig replikere de fysiologiske egenskapene til HCC, har bruken av organoidteknologi blitt introdusert som en lovende forskningsplattform som er i stand til å overgå tidligere begrensninger. Organoider, som er tredimensjonale cellemodeller dyrket in vitro, har evnen til å replikere strukturen og funksjonaliteten til faktiske organer. I HCC-sammenheng eksisterer det imidlertid visse utfordringer med å etablere organoide modeller. Disse utfordringene inkluderer utilstrekkelig detaljerte beskrivelser av HCC-organoidkonstruksjonsprosedyrer, mangel på omfattende protokoller for hele prosessen med HCC-organoidkonstruksjon, og den typisk lille størrelsen på dyrkede organoider 6,7,8. I lys av de typisk begrensede dimensjonene av dyrkede organoider, forsøkte vi å takle disse utfordringene gjennom utviklingen av en omfattende protokoll som omfatter hele HCC-organoidkonstruksjonen6. Denne protokollen omfatter vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passasje, kryopreservering og gjenopplivning. Ved å optimalisere de prosessuelle trinnene og raffinere sammensetningen av kulturmediet, har vi lykkes med å etablere HCC-organoidmodeller som er i stand til vedvarende vekst og langsiktig passasje 6,8. I de påfølgende avsnittene vil en omfattende redegjørelse for de operasjonelle vanskelighetene og relevante faktorer involvert i konstruksjonen av HCC-organoider bli presentert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[Leu15]-gastrin I human</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G9145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Merck</td>
			<td>AXYMCT150LC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A8301 (TGF&#946; inhibitor)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (503), minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (503), serum-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP7</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer size 100 &#956;m</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SML1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Merck</td>
			<td>11088858001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Ultra-Low</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CLS3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Organoid Harvesting Solution</td>
			<td>R&#38;D SYSTEMS</td>
			<td>3700-100-01</td>
			<td>Organoid harvesting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPT</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D5942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Merck</td>
			<td>C6164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Merck</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s balanced salt solution (EBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24010043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, 1 M</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (1003)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A0737-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spodin1-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical specimen of tumor removed from HCC patients</td>
			<td>Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604013</td>
			<td>Trypsin substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt-3a-conditioned medium</td>
			<td>(Broutier et al.)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Secretion of cell lines</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery

Hepatocellulært karsinom (HCC) er en svært utbredt og dødelig svulst over hele verden, og dens sene oppdagelse og mangel på effektive spesifikke terapeutiske midler nødvendiggjør videre forskning på patogenesen og behandlingen. Organoider, en ny modell som ligner innfødt tumorvev og kan dyrkes in vitro, har fått betydelig interesse de siste årene, med mange rapporter om utvikling av organoidmodeller for leverkreft. I denne studien har vi lykkes med å optimalisere prosedyren og etablert en kulturprotokoll som muliggjør dannelse av større HCC-organoider med stabile passasje- og kulturforhold. Vi har omfattende skissert hvert trinn i prosedyren, som dekker hele prosessen med HCC-vevsdissosiasjon, organoid plating, kultur, passaging, kryopreservering og gjenopplivning, og gitt detaljerte forholdsregler i dette papiret. Disse organoider utviser genetisk likhet med det opprinnelige HCC-vevet og kan brukes til forskjellige applikasjoner, inkludert identifisering av potensielle terapeutiske mål for svulster og påfølgende legemiddelutvikling.

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Ved implementering av ovennevnte prosedyre kan fremveksten av HCC-organoide sfæroider typisk observeres i løpet av 3 dager (figur 1). Figur 1A,B viser det etablerte HCC-organoidet, som raskt utvikler kompakte sfæroider preget av avrundede kanter og permeabel cytosol på den første etableringsdagen. Under veksten av HCC-organoider hadde bruken av forskjellige konsentrasjoner av BME forskjellige effekter på organoidernes veksthastighet. Vi dy...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids (Video) | JoVE

Vi gir en omfattende oversikt og forbedring av eksisterende protokoller for organoiddannelse av hepatocellulært karsinom (HCC), som omfatter alle stadier av organoiddyrking. Dette systemet fungerer som en verdifull modell for identifisering av potensielle terapeutiske mål og vurdering av legemiddelkandidateffektivitet.

Utvikling og optimalisering av en human hepatocellulært karsinom pasientavledet organoidmodell for potensiell målidentifikasjon og legemiddeloppdagelse

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...

Vårt laboratorium har som mål å undersøke molekylær patogenese av leverkreft og identifisere nye terapeutiske mål for stoffutvikling. Vi ønsker å svare på hvordan kreft initierer, metastaser og fremgang til legemiddeltoleranse ved hjelp av nye sykdomsmodeller som pasientavledede organoider. De nåværende eksperimentelle utfordringene er i to aspekter.For det første mangler det et komplett sett med protokoller for konstruksjon av hepatocellulære karsinomorganoider for hele prosessen. For det andre er størrelsen på dyrkede HCC-organoider for liten for etterfølgende eksperimentell behandling. I denne protokollen gir vi detaljer om den optimaliserte organoidkulturen og påfølgende overførings- og fryseprosedyrer, samt forholdsregler som skal tas under alle prosedyrene.Vi optimaliserte sammensetningen av organoidmediet for organoider med nær de opprinnelige vevsegenskapene. Vi kan overvåke tumorutviklingen ved hjelp av pasientavledede organoider og forsøke å identifisere nye molekylære og terapeutiske mål for HCC-behandling.