Name: تسليط الضوء على المؤلف: كشف البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار - نموذج زرع طرف مورين هند متعدد المحاور
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

يشعر المؤلفون بالامتنان للدعم والمساعدة التي قدمها جيف فوكس وفيديا فينكاتراماني من مركز أبحاث الأنسجة والكيمياء الحيوية والتصوير الجزيئي (HBMI) التابع لمركز أبحاث الجهاز العضلي الهيكلي بجامعة روتشستر ، بتمويل جزئي من P30AR06965. بالإضافة إلى ذلك ، يود المؤلفون أن يشكروا مركز الفحص المجهري الضوئي والنانوي (CALMN) في المركز الطبي بجامعة روتشستر للمساعدة في الفحص المجهري متعدد الفوتونات. تم تمويل هذه الدراسة من قبل R01 AR070765 و R01 AR070765-04S1 ، وكذلك 1R35GM147054 و 1R01AR082349.

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة الموارد الحيوانية بجامعة روتشستر.
1. إعداد وسائط زراعة الأنسجة
<ol><li>استزراع جميع النباتات في وسط النسر المعدل من Dulbecco (1x DMEM) مع 1٪ v / v البنسلين - الستربتومايسين و 200 ميكرومتر حمض الأسكوربيك L في حاضنة عند 37 درجة مئوي?...

فهم اصطدام الأوتار - نموذج زراعة الفئران لدراسة علم الأحياء الميكانيكي

توفر منصة زرع الأطراف الخلفية التجريبية للفأر المقترنة ببروتوكول زراعة الأنسجة الموصوف في هذه الدراسة نموذجا مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لتشكيل الغضروف الليفي الناجم عن الاصطدام عند إدخال وتر العرقوب. تتجلى فائدة هذا النموذج الخارجي من خلال النتائج التمثيلية ، والتي تشير إلى ...

تعاني العديد من الأوتار ، بما في ذلك وتر العرقوب وأوتار الكفة المدورة ، من اصطدام عظمي بسبب الوضع التشريحي الطبيعي1,2,3,4. يؤدي اصطدام الأوتار إلى توليد إجهاد ضاغط موجه بشكل عرضي إلى محور الألياف الطولي5,6,7. تظهر مناطق اصطدام الأوتار نمطا ظاهريا فريدا للغضروف الليفي يتم فيه تضمين الخلايا المستديرة المنكمشة (الخلايا الليفية الغضروفية) داخل شبكة كولاجين غير منظمة مع زيادة ملحوظة في محتوى الجليكوزامينوجليكان (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. تشير الدراسات السابقة إلى أن البيئة الميكانيكية المتباينة الناتجة عن اصطدام الأوتار تحافظ على هذه المصفوفة الغنية ب GAG من خلال دفع ترسب البروتيوغليكان المتجمع الكبير ، وأبرزها aggrecan ، على الرغم من أن الآليات الأساسية غير واضحة.1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. في حين أن الغضروف الليفي هو سمة طبيعية في المناطق المصابة من الأوتار السليمة ، فإن استقلاب البروتيوغليكان الشاذ المرتبط بتكوين الغضروف الليفي المفرط هو سمة مميزة لاعتلال الأوتار ، وهو مرض شائع وموهن يظهر بشكل غير متناسب في الأوتار المصابة بشكل مزمن.1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. وفقا لذلك ، يتم التعرف سريريا على اصطدام الأوتار كعامل خارجي مهم يقود العديد من اعتلالات الأوتار الأكثر شيوعا ، بما في ذلك مرض الكفة المدورة واعتلال وتر العرقوب (IAT)50,51,52. حاليا ، علاج اعتلال الأوتار غير فعال. على سبيل المثال ، ما يقرب من 47 ٪ من المرضى الذين يعانون من IAT يحتاجون إلى تدخل جراحي بعد فشل الإدارة المحافظة ، مع نتائج متغيرة بعد الجراحة53,54,55,56. على الرغم من العلاقة الواضحة بين الاصطدام واعتلال الأوتار ، فإن الآليات الميكانيكية البيولوجية التي تستشعر بها الخلايا في الأوتار الاصطدامية وتستجيب لبيئتها الميكانيكية موصوفة بشكل سيئ ، مما يحجب فهم التسبب في اعتلال الأوتار ويؤدي إلى علاج غير كاف.
نماذج Explant هي أدوات مفيدة في دراسة علم الأحياء الميكانيكية الأوتار57,58. كخطوة أولى نحو فهم البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار ، استكشفت العديد من الدراسات السابقة الاستجابة الخلوية بعد تطبيق الضغط البسيط أحادي المحور على الخلايا أو استئصالالأوتار 27،29،30،31،32،33،34،39. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا في المختبر إلى مصفوفات خارج الخلية وحول الخلية تسهل نقل الإجهاد ، وتعزل عوامل النمو المهمة والسيتوكينات المنبعثة عن التشوه الميكانيكي ، وتوفر ركيزة لمجمعات الالتصاق البؤري التي تلعب دورا في النقل الميكانيكي57,59. بالإضافة إلى ذلك ، فشلت كل من الدراسات المختبرية والدراسات المزعزلة في تلخيص بيئة الإجهاد الميكانيكي متعدد المحاور الناتجة عن اصطدام الأوتار في الجسم الحي ، والذي يعتمد على السمات التشريحية للمنطقة الاصطدامية 5,6. في سياق إدخال وتر العرقوب الاصطدام ، يشمل ذلك الأنسجة المحيطة مثل الجراب العقبي الخلفي ووسادة الدهونKager 60،61،62،63. على العكس من ذلك ، في الجسم الحي تسمح نماذج اصطدام الأوتار25،28،36،37،38،64،65،66 بالحد الأدنى من التحكم في حجم وتواتر الحمل المطبق مباشرة على الوتر ، وهو قيد معترف به جيدا للنماذج في الجسم الحي لدراسة علم الأحياء الميكانيكي للوتر57,58، 67,68,69,70. نظرا للتحديات في قياس إجهاد الأوتار في الجسم الحي ، فإن بيئة الإجهاد الداخلية المتولدة داخل هذه النماذج غالبا ما تكون سيئة التوصيف بشكل جيد.
في هذه المخطوطة ، نقدم منصة تجريبية مخصصة تعيد إنشاء اصطدام إدخال وتر العرقوب على العقبي داخل نباتات الأطراف الخلفية الكاملة للفئران والتي ، عند إقرانها ببروتوكول زراعة الأنسجة هذا ، تحافظ على صلاحيتها على مدار 7 أيام في زراعة النباتات وتسمح بدراسة العواقب البيولوجية لاصطدام الأوتار. تم بناء المنصة على قاعدة حمض اللبنيك المطبوعة ثلاثية الأبعاد (PLA) التي توفر الأساس لربط المقابض وإدراج تقليل حجم PLA المطبوع ثلاثي الأبعاد. تستخدم المقابض لتثبيت الجزء العلوي من الساق والركبة بالقرب من تقاطع الوتر العضلي للأخيل مع الجانب الذيلي للطرف الخلفي متجها لأعلى ، مما يسمح بتصوير وتر العرقوب من الأعلى باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية أو المجهر المقلوب (الشكل 1 أ). ينزلق إدراج تقليل الحجم على طول مسار على القاعدة ويقلل من الحجم المطلوب لوسائط زراعة الأنسجة. يتم توجيه خط مضفر ملفوف حول مخلب الخلف من المنصة باستخدام التصميم الأساسي ومقطع PLA مطبوع 3D. عن طريق سحب الخيط ، يتم ثني المخلب الخلفي ظهريا ، ويصطدم إدخال وتر العرقوب بالعقبي ، مما يؤدي إلى إجهاد ضغط عرضي مرتفع 5,6 (الشكل 1 أ). تحتوي المنصة داخل حمام أكريليك يحافظ على نباتات الأطراف الخلفية المغمورة في وسائط زراعة الأنسجة. يحافظ تثبيت الخيط المشدود إلى خارج الحمام بشريط لاصق على انثناء ظهر الكاحل لإنتاج اصطدام ثابت بإدخال وتر العرقوب. يتم توفير ملفات CAD للمكونات المطبوعة 3D في أشكال متعددة (ملف تكميلي 1) ، مما يسمح بالاستيراد إلى مجموعة من برامج CAD التجارية والمجانية والمفتوحة المصدر لتعديلها لتناسب الاحتياجات التجريبية. إذا لم يكن الوصول إلى طابعات 3D متاحا للتصنيع ، فيمكن توفير ملفات CAD لخدمات الطباعة ثلاثية الأبعاد عبر الإنترنت التي ستقوم بطباعة الأجزاء وشحنها بتكلفة منخفضة.
الأهم من ذلك ، أن مجمع ثلاثية الرؤوس surae-Achilles العضلي يمتد على مفاصل الركبة والكاحل71،72،73. وبالتالي ، يتأثر إجهاد الشد في وتر العرقوب بثني الركبة. تمديد الركبة يضع وتر العرقوب تحت التوتر ، في حين أن ثني الركبة يقلل من التوتر. من خلال تمديد الركبة أولا ثم ثني الكاحل بشكل سلبي ، يمكن فرض سلالات الضغط عند الإدخال الاصطدام على سلالات الشد. على العكس من ذلك ، من خلال ثني الكاحل بشكل سلبي مع ثني الركبة ، يتم تقليل إجهاد الشد ، ويبقى الإجهاد الضاغط. ويستكشف البروتوكول الحالي ثلاثة شروط من هذا القبيل. 1) بالنسبة للاصطدام الثابت ، يتم ثني القدم ظهريا إلى < 110 درجة فيما يتعلق بالساق لاصطدام الإدخال ، مع ثني الركبة لتقليل التوتر. 2) بالنسبة لمجموعة التوتر الأساسية ، يتم تمديد الكاحل فوق 145 درجة من الانثناء الظهري مع تمديد الركبة ، مما يولد إجهادا للشد في الغالب عند الإدخال. 3) بالنسبة للمجموعة المفرغة ، يتم استزراع النباتات الخارجية في طبق بتري مع الركبة والكاحل في أوضاع محايدة في حالة عدم وجود حمل مطبق خارجيا. يتم قياس الزوايا المشار إليها أعلاه فوتوغرافيا بالنسبة لنظام الإحداثيات حيث تكون القدم والساق متوازيتين بزاوية 180 درجة وعمودية بزاوية 90 درجة.
تشمل الخطوات الرئيسية للبروتوكول 1) تشريح نباتات الأطراف الخلفية والإزالة الدقيقة للجلد والوتر الأخمصي. 2) زراعة النباتات بعد المعالجة المسبقة للديكساميثازون لمدة 48 ساعة ؛ 3) تقسيم الأنسجة وتلطيخ النسيجية. و 4) تحليل الصور الملونة لتقييم تكوين الغضروف الليفي. بعد التشريح ، تتم معالجة كل نبتة طرف خلفي لمدة 48 ساعة في وسط الاستزراع المكمل بديكساميثازون74. يتم تعيين الأطراف المقابلة من كل فأر لمجموعات تجريبية منفصلة للمقارنة الزوجية ، مما يساعد على التحكم في التباين البيولوجي. بعد المعالجة المسبقة ، يتم وضع النباتات في منصات كما هو موضح أعلاه وزراعتها لمدة 7 أيام أخرى (الشكل 1 ب). يتم إجراء مقارنات إضافية مع مجموعة المعالجة مسبقا (اليوم 0) حيث تتم إزالة النباتات مباشرة بعد المعالجة المسبقة لمدة 48 ساعة.
بعد زراعة النباتات ، يتم قطع الأطراف الخلفية ، وتثبيت الفورمالين ، وإزالة الكلس ودمجها في البارافين. يوفر التقسيم التسلسلي في الاتجاه السهمي تصورا لوتر العرقوب من الوصلة العضلية إلى الإدخال العقبي مع السماح بتتبع عمق القسم عبر الوتر بأكمله. يستخدم وضع العلامات الطرفية dUTP X-nick بوساطة dUTP X-nick (TUNEL) لتصور تلف الحمض النووي الثانوي لموت الخلايا المبرمج وتقييم الجدوى. يتم إجراء الأنسجة الزرقاء Toluidine وتحليل الصور الملونة المخصصة لتحديد التغيرات في تلطيخ GAG. ثم يتم استخدام أقسام الأنسجة الملطخة باللون الأزرق Toluidine لتصوير SHG لتوصيف التغيرات في تنظيم ألياف الكولاج (الشكل 1B).
تشير النتائج التمثيلية المقدمة إلى تغير التلوين النسيجي للمصفوفة الغنية ب GAG وعدم تنظيم شبكة الكولاجين خارج الخلية الناتجة عن 7 أيام من الاصطدام الساكن داخل النموذج. يمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء التغير الغضروفي الليفي الناجم عن الاصطدام.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

يؤدي اصطدام الأوتار بالعظام إلى توليد بيئة إجهاد ميكانيكية متعددة المحاور مع إجهاد ضاغط عرضي مرتفع بشكل ملحوظ ، مما يثير نمطا ظاهريا لغضروفا ليفيا موضعيا يتميز بتراكم المصفوفة الغنية بالجليكوزامينوجليكان (GAG) وإعادة تشكيل شبكة الكولاجين. في حين أن الغضروف الليفي هو سمة طبيعية في المناطق المصابة من الأوتار السليمة ، فإن ترسب GAG الزائد وعدم تنظيم شبكة الكولاجين هي السمات المميزة لاعتلال الأوتار. وفقا لذلك ، يتم التعرف سريريا على الاصطدام كعامل خارجي مهم في بدء وتطور اعتلال الأوتار. ومع ذلك ، فإن البيولوجيا الميكانيكية الكامنة وراء اصطدام الأوتار لا تزال قيد الدراسة. أدت الجهود السابقة لتوضيح الاستجابة الخلوية لاصطدام الأوتار إلى تطبيق ضغط أحادي المحور على الخلايا واستئصال الأوتار في المختبر. ومع ذلك ، تفتقر الخلايا المعزولة إلى بيئة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد حاسمة للاستجابة الميكانيكية ، وتفشل كل من الدراسات في المختبر والدراسات المختبرية المستأصلة في تلخيص بيئة الإجهاد متعدد المحاور الناتجة عن اصطدام الأوتار في الجسم الحي ، والذي يعتمد على السمات التشريحية للمنطقة الاصطدامية. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، تفتقر نماذج اصطدام الأوتار إلى السيطرة على بيئة الإجهاد الميكانيكي. للتغلب على هذه القيود ، نقدم نموذجا جديدا لزرع الأطراف الخلفية للفأر مناسبا لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب. يحافظ هذا النموذج على وتر العرقوب في الموقع للحفاظ على التشريح المحلي ويعيد إنتاج بيئة الإجهاد متعددة المحاور الناتجة عن اصطدام إدخال وتر العرقوب على العقبي أثناء الانثناء الظهري للكاحل المطبق بشكل سلبي مع الاحتفاظ بالخلايا داخل بيئتها الأصلية. نحن نصف بروتوكول زراعة الأنسجة جزءا لا يتجزأ من هذا النموذج ونقدم البيانات التي تثبت استمرارية النبات المستدام على مدار 7 أيام. تظهر النتائج التمثيلية تلطيخا محسنا نسيجيا وانخفاضا في محاذاة ألياف الكولاجين الثانوية للاصطدام ، مما يشير إلى ارتفاع تكوين الغضروف الليفي. يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة للتحقيق في أنظمة التحميل الميكانيكية المختلفة ويسمح بمعالجة المسارات الجزيئية ذات الأهمية لتحديد الآليات التي تتوسط تغيير النمط الظاهري في وتر العرقوب استجابة للاصطدام.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

تسليط الضوء على المؤلف: كشف البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار - نموذج زرع طرف مورين هند متعدد المحاور 

مورين هند نموذج زرع الأطراف لدراسة البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام وتر العرقوب

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

تظهر الصور التمثيلية لأقسام الأنسجة الملطخة TUNEL الحد الأدنى من نوى موت الخلايا المبرمج داخل جسم وتر العرقوب بعد 7 أيام من زراعة النباتات عبر المجموعات التجريبية (الشكل 2 أ). يوفر القياس الكمي لهذه الصور دليلا على أن بروتوكول زراعة الأنسجة يحافظ على ما يصل إلى 78٪ من الصلاحية ?...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

نقدم منصة تجريبية مخصصة وبروتوكول زراعة الأنسجة الذي يعيد إنشاء التغيير الغضروفي الليفي المدفوع بتأثير إدخال وتر العرقوب في نباتات الأطراف الخلفية للفأر مع بقاء الخلية المستدامة ، مما يوفر نموذجا مناسبا لاستكشاف البيولوجيا الميكانيكية لاصطدام الأوتار.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

ندرس البيولوجيا الميكانيكية الكامنة وراء اصطدام الأوتار والعملية التي يدفع بها هذا الطلب الميكانيكي الفريد تكوين غضروف الألياف الموضعي في الصحة والمرض. نسعى هنا إلى توصيف المصفوفة للنمذجة المتعلقة بالأنماط غير المتجانسة مكانيا للإجهاد الميكانيكي متعدد المحاور ، الناتجة عن الاصطدام وتحديد الآليات الجزيئية التي تتوسط هذه الاستجابة. طبقت النماذج المختبرية لدراسة البيولوجيا الميكانيكية للاصطدام ضغطا بسيطا على خلايا الأوتار المعزولة أو ضغطا اصطناعيا أحادي المحور على زراعة الأوتار الجزئية والكاملة.نماذج حيوانية راسخة لاصطدام الأوتار ، والتلاعب بالمصدر الخارجي لاصطدام الأوتار في الجسم الحي في أغلب الأحيان جراحيا واستكشاف علم الأحياء بعد استئناف النشاط البدني. تقدم النماذج في المختبر قيودا كبيرة حيث تفتقر الخلايا المعزولة إلى بيئتها خارج الخلية ثلاثية الأبعاد ، وهو أمر حاسم للاستجابة الميكانيكية. في حين أن نماذج الزرع المستأصلة تتحايل على هذا القيد ، فإن كلاهما يفشل في إعادة إنشاء أنماط إجهاد متعددة المحاور ناتجة عن الاصطدام في الجسم الحي.على العكس من ذلك ، توفر النماذج الحيوانية قدرة محدودة على قياس أو التحكم في سلالات الأنسجة الداخلية. يحافظ نموذج زراعة الأطراف في مورين هند لدراسة البيولوجيا الميكانيكية للاصطدام على الخلايا داخل بيئتها خارج الخلية ويحافظ على التشريح المحلي لإدخال وتر العرقوب الاصطدام في الموقع ، مما يسمح بوصفة طبية خاضعة للرقابة للاصطدام من خلال حركة المفاصل المطبقة بشكل سلبي لإعادة إنشاء أنماط متعددة المحاور من إجهاد الأنسجة التي يمكن قياسها وتوصيفها جيدا.

murine-hind-limb-explant-model-for-studying-mechanobiology-achilles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

تشريح الزرع لتوليد نموذج زرع طرف مورين هند لدراسة اصطدام الأوتار

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.