Name: Auteur in de schijnwerpers: het ontrafelen van de mechanobiologie van peesimpingement - een multiaxiaal explantatiemodel voor de achterpoten van muizen
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

De auteurs zijn dankbaar voor de steun en hulp van Jeff Fox en Vidya Venkatramani van de Histology, Biochemistry and Molecular Imaging (HBMI) Core van het University of Rochester Center for Musculoskeletal Research, gedeeltelijk gefinancierd door P30AR06965. Daarnaast willen de auteurs het Centrum voor Lichtmicroscopie en Nanoscopie (CALMN) van het University of Rochester Medical Center bedanken voor hulp bij multifotonenmicroscopie. Deze studie werd gefinancierd door R01 AR070765 en R01 AR070765-04S1, evenals 1R35GM147054 en 1R01AR082349.

Al het dierenwerk werd goedgekeurd door het University of Rochester Committee on Animal Resources.
1. Bereiding van weefselkweekmedia
<ol><li>Kweek alle explantaten in Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x DMEM) met 1% v/v penicilline-streptomycine en 200 μM L-ascorbinezuur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek gedurende de eerste voorbehandeling van 48 uur elke explantatie in 70 ml kweekmedia aangevuld met 100 nM dexamethason74. Na ...

Inzicht in peesimpingement - Muizen explantatiemodel voor het bestuderen van mechanobiologie

Het experimentele explantatieplatform van de achterpoten van muizen in combinatie met het weefselkweekprotocol dat in deze studie wordt beschreven, biedt een geschikt model voor het bestuderen van de mechanobiologie van impingement-gedreven fibrokraakbeenvorming bij de insertie van de achillespees. Het nut van dit explantatiemodel wordt aangetoond door de representatieve resultaten, die wijzen op behoud van de levensvatbaarheid van de cellen gelijktijdig met een significante en ruimtelijk heterogene verandering in Toluï...

Een groot aantal pezen, waaronder de achillespees en rotator cuff-pezen, ervaren benige impingement als gevolg van normale anatomische positionering1,2,3,4. Peesimpingement genereert drukspanning die dwars op de longitudinale vezelas is gericht5,6,7. Gebieden van peesimpingement vertonen een uniek fenotype van fibrokraakbeen waarin gekrompen, ronde cellen (fibrochondrocyten) zijn ingebed in een ongeorganiseerd collageennetwerk met een duidelijk verhoogd glycosaminoglycaan (GAG)-gehalte2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Eerdere studies suggereren dat de ongelijksoortige mechanische omgeving die wordt geproduceerd door peesimpingement deze GAG-rijke matrix in stand houdt door de afzetting van grote aggregerende proteoglycanen, met name aggrecan, te stimuleren, hoewel de onderliggende mechanismen onduidelijk zijn1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, is een afwijkend proteoglycaanmetabolisme geassocieerd met overmatige vorming van fibrokraakbeen een kenmerkend kenmerk van tendinopathie, een veel voorkomende en slopende ziekte die onevenredig vaak voorkomt bij chronisch aangetaste pezen1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dienovereenkomstig wordt peesimpingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor die verschillende van de meest voorkomende tendinopathieën aandrijft, waaronder rotator cuff-ziekte en insertionele achillespeesontsteking (IAT)50,51,52. Momenteel is de behandeling van tendinopathie inefficiënt. Ongeveer 47% van de patiënten met IAT heeft bijvoorbeeld een chirurgische ingreep nodig na mislukte conservatieve behandeling, met variabele postoperatieve uitkomsten53,54,55,56. Ondanks de schijnbare relatie tussen impingement en tendinopathie, zijn de mechanobiologische mechanismen waarmee cellen in een aangetaste pees hun mechanische omgeving waarnemen en erop reageren, slecht beschreven, wat het begrip van de pathogenese van tendinopathie verduistert en resulteert in een ontoereikende behandeling.
Explantatiemodellen zijn nuttige hulpmiddelen bij de studie van peesmechanobiologie57,58. Als een eerste stap in de richting van het begrijpen van de mechanobiologie van peesimpingement, hebben verschillende eerdere studies de cellulaire respons onderzocht na de toepassing van eenvoudige uniaxiale compressie op cellen of uitgesneden peesexplantaten 27,29,30,31,32,33,34,39. Cellen in vitro missen echter extracellulaire en pericellulaire matrices die de overdracht van spanningen vergemakkelijken, belangrijke groeifactoren en cytokines die vrijkomen door mechanische vervorming sekwestreren en substraat bieden voor focale adhesiecomplexen die een rol spelen bij mechanotransductie57,59. Bovendien kunnen zowel in vitro als excitant-onderzoeken niet worden gerecituleerd in de multiaxiale mechanische belastingsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo, die afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied 5,6. In de context van de beknelde achillespeesinsertie omvat dit omliggende weefsels zoals de retrocalcaneale slijmbeurs en Kager's vetkussen 60,61,62,63. Omgekeerd bieden in vivo modellen van peesimpingement 25,28,36,37,38,64,65,66 minimale controle over de omvang en frequentie van de belasting die rechtstreeks op de pees wordt uitgeoefend, wat een algemeen erkende beperking is van in vivo modellen voor het bestuderen van peesmechanobiologie 57,58,67,68,69,70. Gezien de uitdagingen bij het meten van peesspanning in vivo, is de interne rekomgeving die in deze modellen wordt gegenereerd vaak slecht gekarakteriseerd.
In dit manuscript presenteren we een op maat gemaakt experimenteel platform dat de invoeging van de achillespees op de calcaneus in de explantaten van de hele muizen van de achterpoten nabootst dat, in combinatie met dit weefselkweekprotocol, de levensvatbaarheid gedurende 7 dagen in explantatiekweek behoudt en studie van de biologische gevolgen van peesimpingement mogelijk maakt. Het platform is gebouwd op een 3D-geprinte polymelkzuur (PLA) basis die de basis vormt voor de bevestiging van de grepen en 3D-geprinte PLA-volumereductie-inzetstukken. De grepen worden gebruikt om het bovenbeen en de knie proximaal van de achillespees-myotendineuze overgang vast te klemmen met het caudale aspect van de achterpoot naar boven gericht, waardoor de achillespees van bovenaf kan worden afgebeeld met behulp van een ultrasone sonde of omgekeerde microscoop (Figuur 1A). Het volumereductie-inzetstuk glijdt langs een spoor op de basis en vermindert het benodigde volume weefselkweekmedia. Een gevlochten lijn die om de achterpoot is gewikkeld, wordt uit het platform geleid met behulp van het basisontwerp en een 3D-geprinte PLA-clip. Door aan het touwtje te trekken, wordt de achterpoot dorsaalgebogen en wordt de aanhechting van de achillespees tegen de calcaneus gedrukt, wat resulteert in een verhoogde dwarsdrukspanning 5,6 (Figuur 1A). Het platform bevindt zich in een acrylbad dat de explantaties van de achterpoot ondergedompeld houdt in weefselkweekmedia. Door het strakke koord met plakband aan de buitenkant van het bad te bevestigen, wordt de dorsaalflexie van de enkel in stand gehouden om statische impingement van de achillespeesinsertie te produceren. CAD-bestanden voor 3D-geprinte componenten worden geleverd in meerdere formaten (aanvullend bestand 1), waardoor ze kunnen worden geïmporteerd in een reeks commerciële en gratis, open-source CAD-software voor aanpassing aan experimentele behoeften. Als er geen toegang tot 3D-printers beschikbaar is voor fabricage, kunnen CAD-bestanden worden verstrekt aan online 3D-printservices die de onderdelen tegen lage kosten printen en verzenden.
Belangrijk is dat het triceps surae-Achilles musculotendineuze complex zowel de knie- als de enkelgewrichten overspant 71,72,73. Bijgevolg wordt de trekspanning in de achillespees beïnvloed door knieflexie. Knie-extensie plaatst de achillespees onder spanning, terwijl knieflexie de spanning vermindert. Door eerst de knie te strekken en vervolgens de enkel passief te dorsaalbuigen, kunnen drukspanningen bij de geïmpacteerde insertie worden gesuperponeerd op trekspanningen. Omgekeerd, door de enkel passief dorsaalbuigend te maken met de knie gebogen, wordt de trekspanning verminderd en blijft de drukspanning bestaan. Het huidige protocol onderzoekt drie van dergelijke voorwaarden. 1) Voor statische impingement wordt de voet dorsaalgebogen tot < 110° ten opzichte van het scheenbeen om de insertie te beïnvloeden, met de knie gebogen om de spanning te verminderen. 2) Voor de basislijnspanningsgroep wordt de enkel gestrekt boven 145° dorsaalflexie met de knie gestrekt, waardoor bij het inbrengen overwegend trekspanning ontstaat. 3) Voor de onbelaste groep worden explantaten gekweekt in een petrischaal met de knie en enkel in neutrale posities in afwezigheid van extern uitgeoefende belasting. De hierboven genoemde hoeken worden fotografisch gemeten ten opzichte van een coördinatensysteem waarbij de voet en het scheenbeen evenwijdig zijn onder een hoek van 180° en loodrecht op een hoek van 90°.
De belangrijkste stappen van het protocol zijn onder meer: 1) dissectie van explantaten van de achterpoten en zorgvuldige verwijdering van de huid en plantarispees; 2) explantatiecultuur na een 48 uur durende voorbehandeling met dexamethason; 3) weefseldoorsnede en histologische kleuring; en 4) kleurenbeeldanalyse om de vorming van fibrokraakbeen te beoordelen. Na dissectie wordt elke explantatie van de achterpoot gedurende 48 uur voorbehandeld in kweekmedia aangevuld met dexamethason74. Contralaterale ledematen van elke muis worden toegewezen aan afzonderlijke experimentele groepen voor paarsgewijze vergelijking, wat helpt bij het beheersen van biologische variabiliteit. Na de voorbehandeling worden de explantaten op platforms geplaatst zoals hierboven beschreven en nog 7 dagen gekweekt (Figuur 1B). Aanvullende vergelijkingen worden gemaakt met een voorbehandelde (dag 0) groep waarin explantaten direct na de 48 uur voorbehandeling worden verwijderd.
Na explantatiecultuur worden de achterpoten bijgesneden, formaline gefixeerd, ontkalkt en ingebed in paraffine. Seriële doorsnede in sagittale oriëntatie biedt visualisatie van de achillespees vanaf de myotendineuze overgang tot de calcaneale insertie, terwijl de sectiediepte door de hele pees kan worden gevolgd. Terminale deoxynucleotidyltransferase (TdT)-gemedieerde dUTP X-nick-labeling (TUNEL) wordt gebruikt om DNA-schade secundair aan apoptose te visualiseren en de levensvatbaarheid te beoordelen. Toluïdineblauwe histologie en aangepaste kleurenbeeldanalyse worden uitgevoerd om veranderingen in GAG-kleuring te kwantificeren. Toluïdineblauw gekleurde weefselsecties worden vervolgens gebruikt voor SHG-beeldvorming om veranderingen in de organisatie van collagevezels te karakteriseren (Figuur 1B).
De verstrekte representatieve resultaten suggereren een veranderde histologische kleuring van de GAG-rijke matrix en desorganisatie van het extracellulaire collageennetwerk gegenereerd door 7 dagen statische impingement binnen het model. Dit model kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan impingement-gedreven fibrokraakbeenachtige verandering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

Peesbotsing op bot genereert een multiaxiale mechanische belastingomgeving met duidelijk verhoogde transversale compressieve rek, die een gelokaliseerd fibrokraakbeenfenotype opwekt dat wordt gekenmerkt door accumulatie van glycosaminoglycaan (GAG)-rijke matrix en remodellering van het collageennetwerk. Hoewel fibrokraakbeen een normaal kenmerk is in aangetaste gebieden van gezonde pezen, zijn overmatige GAG-afzetting en desorganisatie van het collageennetwerk kenmerkende kenmerken van tendinopathie. Dienovereenkomstig wordt impingement klinisch erkend als een belangrijke extrinsieke factor bij het ontstaan en de progressie van tendinopathie. Toch blijft de mechanobiologie die ten grondslag ligt aan peesimpingement onderbelicht. Eerdere pogingen om de cellulaire respons op peesimpingement op te helderen, hebben uniaxiale compressie toegepast op cellen en peesexplantaten in vitro weggesneden. Geïsoleerde cellen missen echter een driedimensionale extracellulaire omgeving die cruciaal is voor de mechanorespons, en zowel in vitro als excitatiestudies kunnen de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door peesimpingement in vivo niet recapituleren, wat afhankelijk is van anatomische kenmerken van het geïmpacteerde gebied. Bovendien missen in vivo modellen van peesimpingement controle over de mechanische belastingsomgeving. Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we een nieuw explantatiemodel van de achterpoten van muizen dat geschikt is voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespeesimpingement. Dit model houdt de achillespees in situ om de lokale anatomie te behouden en reproduceert de multiaxiale spanningsomgeving die wordt gegenereerd door botsing van de achillespeesinsertie op de calcaneus tijdens passief toegepaste dorsaalflexie van de enkel met behoud van cellen in hun oorspronkelijke omgeving. We beschrijven een weefselkweekprotocol dat integraal deel uitmaakt van dit model en presenteren gegevens die een duurzame levensvatbaarheid van explantatie gedurende 7 dagen aantonen. De representatieve resultaten tonen een verbeterde histologische GAG-kleuring en verminderde uitlijning van de collageenvezel secundair aan impingement, wat wijst op verhoogde vorming van fibrokraakbeen. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om verschillende mechanische belastingsregimes te onderzoeken en maakt het mogelijk om moleculaire routes te manipuleren die van belang zijn om mechanismen te identificeren die fenotypische veranderingen in de achillespees mediëren als reactie op impingement.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Auteur in de schijnwerpers: het ontrafelen van de mechanobiologie van peesimpingement - een multiaxiaal explantatiemodel voor de achterpoten van muizen 

Muizen achterpoot explantatiemodel voor het bestuderen van de mechanobiologie van achillespees impingement

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Representatieve beelden van TUNEL-gekleurde weefselsecties tonen minimale apoptotische kernen in het lichaam van de achillespees na 7 dagen explantatiekweek in experimentele groepen (Figuur 2A). Kwantificering van deze beelden levert bewijs dat het weefselkweekprotocol gemiddeld tot 78% levensvatbaarheid behoudt in de achillespees na 7 dagen explantatiekweek onder belastingsomstandigheden (Figuur 2B).
Kwalitatief wordt een verbeterde ...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

We presenteren een op maat gemaakt experimenteel platform en weefselkweekprotocol dat fibrokraakbeenachtige verandering nabootst die wordt aangedreven door impingement van de achillespeesinsertie in explantaten van de achterpoten van muizen met aanhoudende cellevensvatbaarheid, en biedt een model dat geschikt is voor het onderzoeken van de mechanobiologie van peesimpingement.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

We bestuderen de mechanobiologie die ten grondslag ligt aan peesimpingement en het proces waarmee deze unieke mechanische vraag de vorming van gelokaliseerd vezelkraakbeen in gezondheid en ziekte stimuleert. Hier proberen we de matrix te karakteriseren voor modellering ten opzichte van ruimtelijk heterogene patronen van multiaxiale mechanische rek, gegenereerd door impingement en moleculaire mechanismen te identificeren die deze respons mediëren. In vitro modellen voor het bestuderen van impingement mechanobiologie hebben eenvoudige compressie toegepast op geïsoleerde peescellen of kunstmatige uniaxiale compressie op gedeeltelijke en hele peesexplantaten.Gevestigde diermodellen van peesimpingement, het manipuleren van externe bronnen van peesimpingement in vivo, meestal chirurgisch en het verkennen van biologie na het hervatten van fysieke activiteit. In vitro modellen vertonen aanzienlijke beperkingen omdat geïsoleerde cellen hun driedimensionale extracellulaire omgeving missen, cruciaal voor mechano-respons. Hoewel excijnde explantatiemodellen deze beperking omzeilen, slagen beide er niet in om multiaxiale spanningspatronen te recreëren die worden gegenereerd door impingement in vivo.Omgekeerd bieden diermodellen beperkte mogelijkheden om interne weefselstammen te meten of te beheersen. Ons Muizen Hind Limb Explant-model voor het bestuderen van impingement-mechanobiologie houdt cellen in hun extracellulaire omgeving en behoudt de lokale anatomie van de geïmpacteerde achillespeesinsertie in situ, waardoor een gecontroleerd voorschrift van impingement mogelijk is door passief toegepaste gewrichtsbeweging om multiaxiale patronen van weefselspanning te recreëren die meetbaar en goed gekarakteriseerd zijn.

murine-hind-limb-explant-model-for-studying-mechanobiology-achilles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Explantatiedissectie om muizen achterpoot te genereren Explantatiemodel om peesimpingement te bestuderen

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.