Name: Pleins feux sur l’auteur : Démêler la mécanobiologie de l’empiètement tendineux - Un modèle d’explant de membre postérieur murin multiaxial
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Les auteurs sont reconnaissants du soutien et de l’aide fournis par Jeff Fox et Vidya Venkatramani du centre d’histologie, de biochimie et d’imagerie moléculaire (HBMI) du Centre de recherche musculo-squelettique de l’Université de Rochester, financé en partie par P30AR06965. De plus, les auteurs tiennent à remercier le Centre de microscopie optique et de nanoscopie (CALMN) du Centre médical de l’Université de Rochester pour son aide en matière de microscopie multiphotonique. Cette étude a été financée par R01 AR070765 et R01 AR070765-04S1, ainsi que par 1R35GM147054 et 1R01AR082349.

Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité des ressources animales de l’Université de Rochester.
1. Préparation des milieux de culture tissulaire
<ol><li>Cultivez tous les explants dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (1x DMEM) avec 1 % v/v de pénicilline-streptomycine et 200 μM d’acide L-ascorbique dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Pour le prétraitement initial de 48 h, cultiver chaque explant dans 70 mL de milieu...

Comprendre l’impact tendineux – Modèle d’explant murin pour l’étude de la mécanobiologie

La plate-forme expérimentale d’explants de membres postérieurs murins associée au protocole de culture tissulaire décrit dans cette étude fournit un modèle approprié pour étudier la mécanobiologie de la formation de fibrocartilage induite par le conflit à l’insertion du tendon d’Achille. L’utilité de ce modèle d’explant est démontrée par les résultats représentatifs, qui indiquent un maintien de la viabilité cellulaire concomitant à un changement significatif et spatialement hétérogène de l...

Une multitude de tendons, y compris le tendon d’Achille et les tendons de la coiffe des rotateurs, subissent un conflit osseux dû à un positionnement anatomique normal1,2,3,4. Le conflit tendineux génère une contrainte de compression dirigée transversalement à l’axe longitudinal de la fibre5,6,7. Les régions de conflit tendineux présentent un phénotype de fibrocartilage unique dans lequel des cellules rondes rétrécies (fibrochondrocytes) sont intégrées dans un réseau de collagène désorganisé avec une teneur en glycosaminoglycane (GAG) nettement accrue2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Des études antérieures suggèrent que l’environnement mécanique disparate produit par le conflit tendineux soutient cette matrice riche en GAG en conduisant au dépôt de protéoglycanes agrégeants de grande taille, notamment l’aggrécan, bien que les mécanismes sous-jacents ne soient pas clairs1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Alors que le fibrocartilage est une caractéristique normale dans les régions touchées des tendons sains, le métabolisme aberrant des protéoglycanes associé à une formation excessive de fibrocartilage est une caractéristique caractéristique de la tendinopathie, une maladie courante et débilitante qui émerge de manière disproportionnée dans les tendons chroniquement touchés1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. En conséquence, le conflit tendineux est cliniquement reconnu comme un facteur extrinsèque important à l’origine de plusieurs des tendinopathies les plus courantes, notamment la maladie de la coiffe des rotateurs et la tendinopathie d’Achille insertionnelle (IAT)50,51,52. À l’heure actuelle, le traitement de la tendinopathie est inefficace. Par exemple, environ 47 % des patients atteints d’IAT nécessitent une intervention chirurgicale après l’échec d’une prise en charge conservatrice, avec des résultats postopératoires variables53,54,55,56. Malgré la relation apparente entre le conflit et la tendinopathie, les mécanismes mécanobiologiques par lesquels les cellules du tendon touché perçoivent et réagissent à leur environnement mécanique sont mal décrits, ce qui obscurcit la compréhension de la pathogenèse de la tendinopathie et entraîne un traitement inadéquat.
Les modèles d’explants sont des outils utiles dans l’étude de la mécanobiologie tendineuse57,58. Comme première étape vers la compréhension de la mécanobiologie du conflit tendonin, plusieurs études antérieures ont exploré la réponse cellulaire suite à l’application d’une compression uniaxiale simple à des cellules ou d’explants tendineux excisés 27,29,30,31,32,33,34,39. Cependant, les cellules in vitro manquent de matrices extracellulaires et péricellulaires qui facilitent le transfert de souches, séquestrent d’importants facteurs de croissance et cytokines libérés par la déformation mécanique, et fournissent un substrat pour les complexes d’adhésion focaux qui jouent un rôle dans la mécanotransduction57,59. De plus, les études in vitro et excisées ne parviennent pas à récapituler l’environnement de déformation mécanique multiaxiale généré par le conflit tendineux in vivo, qui dépend des caractéristiques anatomiques de la région touchée 5,6. Dans le contexte de l’insertion du tendon d’Achille touché, cela inclut les tissus environnants tels que la bourse rétrocalcanéenne et le coussinet adipeux de Kager 60,61,62,63. À l’inverse, les modèles in vivo de conflit tendineux 25,28,36,37,38,64,65,66 permettent un contrôle minimal de l’amplitude et de la fréquence de la charge appliquée directement au tendon, ce qui est une limitation bien connue des modèles in vivo pour l’étude de la mécanobiologie tendineuse57,58,67,68,69,70. Compte tenu des difficultés rencontrées dans la mesure de la déformation des tendons in vivo, l’environnement de déformation interne généré dans ces modèles est souvent mal caractérisé.
Dans ce manuscrit, nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée qui recrée l’empiètement de l’insertion du tendon d’Achille sur le calcanéum dans des explants entiers de membres postérieurs murins qui, lorsqu’elle est associée à ce protocole de culture tissulaire, maintient la viabilité pendant 7 jours en culture d’explants et permet d’étudier les séquelles biologiques du conflit tendineux. La plate-forme est construite sur une base d’acide polylactique (PLA) imprimée en 3D qui constitue la base de la fixation des poignées et de l’insert de réduction de volume PLA imprimé en 3D. Les poignées sont utilisées pour serrer la partie supérieure de la jambe et du genou à proximité de la jonction myotendineuse d’Achille avec la face caudale du membre postérieur tournée vers le haut, ce qui permet d’imager le tendon d’Achille d’en haut à l’aide d’une sonde à ultrasons ou d’un microscope inversé (Figure 1A). L’insert de réduction de volume glisse le long d’un rail sur la base et réduit le volume requis de milieux de culture tissulaire. Une ligne tressée enroulée autour de la patte arrière est acheminée hors de la plate-forme à l’aide de la conception de base et d’un clip PLA imprimé en 3D. En tirant sur la corde, la patte arrière est fléchie dorsalement et l’insertion du tendon d’Achille est heurtée contre le calcanéum, ce qui entraîne une contrainte de compression transversale élevée 5,6 (Figure 1A). La plate-forme est contenue dans un bain acrylique qui maintient les explants des membres postérieurs immergés dans des milieux de culture tissulaire. La fixation de la corde tendue à l’extérieur de la baignoire avec du ruban adhésif maintient la dorsiflexion de la cheville pour produire un conflit statique de l’insertion du tendon d’Achille. Les fichiers CAO pour les composants imprimés en 3D sont fournis en plusieurs formats (fichier supplémentaire 1), ce qui permet de les importer dans une gamme de logiciels de CAO commerciaux et gratuits, open-source, pour les modifier en fonction des besoins expérimentaux. Si l’accès aux imprimantes 3D n’est pas disponible pour la fabrication, les fichiers CAO peuvent être fournis aux services d’impression 3D en ligne qui imprimeront et expédieront les pièces à faible coût.
Il est important de noter que le complexe musculo-tendineux triceps surae-Achille s’étend à la fois sur les articulations du genou et de la cheville 71,72,73. Par conséquent, la tension de traction dans le tendon d’Achille est influencée par la flexion du genou. L’extension du genou met le tendon d’Achille sous tension, tandis que la flexion du genou réduit la tension. En étendant d’abord le genou, puis en fléchissant passivement la cheville, les contraintes de compression au niveau de l’insertion heurtée peuvent être superposées aux contraintes de traction. Inversement, en fléchissant passivement la cheville avec le genou fléchi, la tension de traction est réduite et la contrainte de compression persiste. Le protocole actuel explore trois de ces conditions. 1) Pour les conflits statiques, le pied est fléchi dorsivement à < 110° par rapport au tibia pour empiéter sur l’insertion, le genou fléchi pour réduire la tension. 2) Pour le groupe de tension de base, la cheville est étendue au-dessus de 145° de dorsiflexion avec le genou étendu, générant principalement une contrainte de traction à l’insertion. 3) Pour le groupe non chargé, les explants sont cultivés dans une boîte de Pétri avec le genou et la cheville en position neutre en l’absence de charge appliquée à l’extérieur. Les angles mentionnés ci-dessus sont mesurés photographiquement par rapport à un système de coordonnées où le pied et le tibia sont parallèles à un angle de 180° et perpendiculaires à un angle de 90°.
Les étapes clés du protocole comprennent 1) la dissection des explants des membres postérieurs et l’ablation soigneuse de la peau et du tendon plantaire ; 2) culture d’explants après un prétraitement à la dexaméthasone de 48 h ; 3) la coupe des tissus et la coloration histologique ; et 4) l’analyse d’images en couleur pour évaluer la formation du fibrocartilage. Après dissection, chaque explant de membre postérieur est prétraité pendant 48 h dans un milieu de culture complété par de la dexaméthasone74. Les membres controlatéraux de chaque souris sont assignés à des groupes expérimentaux distincts pour une comparaison par paires, ce qui aide à contrôler la variabilité biologique. Après le prétraitement, les explants sont positionnés dans des plates-formes comme décrit ci-dessus et cultivés pendant 7 jours supplémentaires (Figure 1B). Des comparaisons supplémentaires sont faites avec un groupe prétraité (jour 0) dans lequel les explants sont retirés immédiatement après le prétraitement de 48 h.
Après la culture de l’explantation, les membres postérieurs sont coupés, le formol fixé, décalcifié et noyé dans de la paraffine. La coupe en série en orientation sagittale permet de visualiser le tendon d’Achille de la jonction myotendineuse à l’insertion calcanéenne tout en permettant de suivre la profondeur de la section à travers l’ensemble du tendon. Le marquage dUTP X-nick médié par la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) est utilisé pour visualiser les dommages à l’ADN secondaires à l’apoptose et évaluer la viabilité. L’histologie du bleu de toluidine et l’analyse personnalisée de l’image couleur sont effectuées pour quantifier les changements dans la coloration GAG. Des coupes de tissus colorés au bleu de toluidine sont ensuite utilisées pour l’imagerie SHG afin de caractériser les altérations de l’organisation des fibres de collage (Figure 1B).
Les résultats représentatifs fournis suggèrent une altération de la coloration histologique de la matrice riche en GAG et une désorganisation du réseau de collagène extracellulaire générée par 7 jours de conflit statique dans le modèle. Ce modèle peut être utilisé pour explorer les mécanismes moléculaires sous-jacents au changement fibrocartilagineux induit par l’impact.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

L’impact tendineux sur l’os génère un environnement de déformation mécanique multiaxiale avec une déformation de compression transversale nettement élevée, ce qui provoque un phénotype de fibrocartilage localisé caractérisé par l’accumulation d’une matrice riche en glycosaminoglycanes (GAG) et le remodelage du réseau de collagène. Alors que le fibrocartilage est une caractéristique normale dans les régions touchées des tendons sains, le dépôt excessif de GAG et la désorganisation du réseau de collagène sont des caractéristiques caractéristiques de la tendinopathie. En conséquence, le conflit est cliniquement reconnu comme un facteur extrinsèque important dans l’initiation et la progression de la tendinopathie. Néanmoins, la mécanobiologie sous-jacente au conflit tendineux reste peu étudiée. Des efforts antérieurs pour élucider la réponse cellulaire au conflit tendineux ont appliqué une compression uniaxiale aux cellules et excisé des explants tendineux in vitro. Cependant, les cellules isolées n’ont pas d’environnement extracellulaire tridimensionnel crucial pour la mécanoréponse, et les études in vitro et les études d’explants excisés ne parviennent pas à récapituler l’environnement de déformation multiaxiale généré par le conflit tendineux in vivo, qui dépend des caractéristiques anatomiques de la région touchée. De plus, les modèles in vivo de conflit tendineux manquent de contrôle sur l’environnement de déformation mécanique. Pour pallier ces limitations, nous présentons un nouveau modèle d’explant de membre postérieur murin adapté à l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille. Ce modèle maintient le tendon d’Achille in situ pour préserver l’anatomie locale et reproduit l’environnement de déformation multiaxiale généré par l’impact de l’insertion du tendon d’Achille sur le calcanéum lors d’une dorsiflexion passive de la cheville tout en conservant les cellules dans leur environnement d’origine. Nous décrivons un protocole de culture tissulaire faisant partie intégrante de ce modèle et présentons des données établissant la viabilité durable de l’explant sur 7 jours. Les résultats représentatifs démontrent une amélioration de la coloration histologique des GAG et une diminution de l’alignement des fibres de collagène secondaire au conflit, suggérant une formation élevée de fibrocartilage. Ce modèle peut facilement être adapté pour étudier différents régimes de charge mécanique et permet la manipulation de voies moléculaires d’intérêt pour identifier les mécanismes médiant le changement phénotypique dans le tendon d’Achille en réponse au conflit.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Pleins feux sur l’auteur : Démêler la mécanobiologie de l’empiètement tendineux - Un modèle d’explant de membre postérieur murin multiaxial 

Modèle d’explant murin d’un membre postérieur pour l’étude de la mécanobiologie du conflit du tendon d’Achille

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Des images représentatives de coupes de tissus colorés par TUNEL montrent des noyaux apoptotiques minimes dans le corps du tendon d’Achille après 7 jours de culture d’explants dans des groupes expérimentaux (Figure 2A). La quantification de ces images fournit des preuves que le protocole de culture tissulaire maintient jusqu’à 78 % de viabilité en moyenne dans le tendon d’Achille après 7 jours de culture d’explant dans des conditions de charge (Figure 2B...

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Nous présentons une plate-forme expérimentale personnalisée et un protocole de culture tissulaire qui recrée le changement fibrocartilagineux induit par le conflit de l’insertion du tendon d’Achille dans les explants murins des membres postérieurs avec une viabilité cellulaire soutenue, fournissant un modèle adapté à l’exploration de la mécanobiologie du conflit tendonineux.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Nous étudions la mécanobiologie sous-jacente au conflit tendineux et le processus par lequel cette demande mécanique unique entraîne la formation localisée de cartilage fibreux dans la santé et la maladie. Ici, nous cherchons à caractériser la matrice pour la modélisation par rapport à des motifs spatialement hétérogènes de déformation mécanique multiaxiale, générés par le conflit et à identifier les mécanismes moléculaires médiant cette réponse. Des modèles in vitro pour l’étude de la mécanobiologie des conflits ont appliqué une compression simple à des cellules tendineuses isolées ou une compression uniaxiale artificielle à des explants de tendons partiels et entiers.Établir des modèles animaux de conflit tendineux, manipulant la source externe de conflit tendineux in vivo le plus souvent chirurgicalement et explorer la biologie après la reprise de l’activité physique. Les modèles in vitro présentent des limites importantes car les cellules isolées n’ont pas leur environnement extracellulaire tridimensionnel, crucial pour la mécano-réponse. Bien que les modèles d’explants excisés contournent cette limitation, les deux ne parviennent pas à recréer des modèles de déformation multiaxiale générés par l’impact in vivo.À l’inverse, les modèles animaux offrent une capacité limitée à mesurer ou à contrôler les souches des tissus internes. Notre modèle d’explant de membre postérieur murin pour l’étude de la mécanobiologie du conflit maintient les cellules dans leur environnement extracellulaire et préserve l’anatomie locale de l’insertion du tendon d’Achille touché in situ, permettant une prescription contrôlée de l’impact par un mouvement articulaire appliqué passivement pour recréer des modèles multiaxiaux de tension tissulaire mesurables et bien caractérisés.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Recherche

Bio-ingénierie

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Dissection d’explants pour générer un modèle d’explant de membre postérieur murin pour étudier le conflit tendineux

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.