Name: Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Mechanobiologie des Sehnenimpingements – Ein multiaxiales Explantatmodell für die Hintergliedmaßen der Maus
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Die Autoren sind dankbar für die Unterstützung und Hilfe von Jeff Fox und Vidya Venkatramani vom Center for Musculoskeletal Research's Histology, Biochemistry, and Molecular Imaging (HBMI) Core, der teilweise von P30AR06965 finanziert wird. Darüber hinaus danken die Autoren dem Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) am University of Rochester Medical Center für die Unterstützung bei der Multiphotonenmikroskopie. Diese Studie wurde durch R01 AR070765 und R01 AR070765-04S1 sowie 1R35GM147054 und 1R01AR082349 finanziert.

Alle Tierarbeiten wurden vom Komitee für Tierressourcen der Universität Rochester genehmigt.
1. Herstellung von Gewebekulturmedien
<ol><li>Kultivieren Sie alle Explantate in Dulbecco's Modified Eagle Medium (1x DMEM) mit 1 % v/v Penicillin-Streptomycin und 200 μM L-Ascorbinsäure in einem Inkubator bei 37 °C und 5 %CO2. Für die anfängliche 48-stündige Vorbehandlung wird jedes Explantat in 70 ml Nährmedien kultiviert, die mit 100 nM Dexamethason<sup class="...

Verständnis des Sehnenimpingements – Mausexplantatmodell zur Untersuchung der Mechanobiologie

Die experimentelle Explantatplattform der Hintergliedmaßen der Maus gepaart mit dem in dieser Studie beschriebenen Gewebekulturprotokoll stellt ein geeignetes Modell dar, um die Mechanobiologie der impingement-getriebenen Faserknorpelbildung am Achillessehnenansatz zu untersuchen. Die Nützlichkeit dieses Explantatmodells wird durch die repräsentativen Ergebnisse demonstriert, die auf eine Aufrechterhaltung der Zellviabilität bei gleichzeitiger signifikanter und räumlich heterogener Veränderung der Toluidinblau-Fär...

Eine Vielzahl von Sehnen, darunter die Achillessehne und die Sehnen der Rotatorenmanschette, erleiden aufgrund der normalen anatomischen Positionierung ein knöchernes Impingement1,2,3,4. Das Sehnenauftreffen erzeugt eine Druckdehnung, die quer zur Faserlängsachse gerichtet ist5,6,7. Die Regionen des Sehnenimpingements zeigen einen einzigartigen Faserknorpel-Phänotyp, bei dem geschrumpfte, runde Zellen (Fibrochondrozyten) in ein desorganisiertes Kollagennetzwerk mit deutlich erhöhtem Glykosaminoglykan-Gehalt (GAG) eingebettet sind2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die unterschiedliche mechanische Umgebung, die durch das Aufprallen der Sehne erzeugt wird, diese GAG-reiche Matrix aufrechterhält, indem sie die Ablagerung großer aggregierender Proteoglykane, vor allem Aggrecan, antreibt, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen unklar sind1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Während Faserknorpel ein normales Merkmal in eingeklemmten Regionen gesunder Sehnen ist, ist ein aberranter Proteoglykanstoffwechsel, der mit einer übermäßigen Bildung von Faserknorpel einhergeht, ein charakteristisches Merkmal der Tendinopathie, einer häufigen und schwächenden Erkrankung, die überproportional häufig bei chronisch eingedrückten Sehnen auftritt1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Dementsprechend ist das Sehnenimpingement klinisch als wichtiger extrinsischer Faktor anerkannt, der mehrere der häufigsten Tendinopathien antreibt, darunter die Rotatorenmanschettenerkrankung und die insertionelle Achillessehnen-Tendinopathie (IAT)50,51,52. Derzeit ist die Behandlung der Tendinopathie ineffizient. Zum Beispiel benötigen etwa 47 % der Patienten mit IAT einen chirurgischen Eingriff nach einer fehlgeschlagenen konservativen Behandlung mit unterschiedlichen postoperativen Ergebnissen53,54,55,56. Trotz des offensichtlichen Zusammenhangs zwischen Impingement und Tendinopathie sind die mechanobiologischen Mechanismen, mit denen Zellen in eingeklemmten Sehnen ihre mechanische Umgebung wahrnehmen und darauf reagieren, nur unzureichend beschrieben, was das Verständnis der Pathogenese der Tendinopathie verdunkelt und zu einer unzureichenden Behandlung führt.
Explantatmodelle sind nützliche Werkzeuge bei der Untersuchung der Sehnenmechanobiologie 57,58. Als ersten Schritt zum Verständnis der Mechanobiologie des Sehnenimpingements haben mehrere frühere Studien die zelluläre Reaktion nach der Anwendung einer einfachen einachsigen Kompression auf Zellen oder exzidierten Sehnenexplantaten untersucht 27,29,30,31,32,33,34,39. In vitro fehlen den Zellen jedoch extrazelluläre und perizelluläre Matrizen, die den Stammtransfer erleichtern, wichtige Wachstumsfaktoren und Zytokine sequestrieren, die durch mechanische Verformung freigesetzt werden, und Substrat für fokale Adhäsionskomplexe liefern, die eine Rolle bei der Mechanotransduktion spielen57,59. Darüber hinaus ist es sowohl in vitro als auch in exzidierten Explantatsstudien nicht möglich, die multiaxiale mechanische Belastungsumgebung zu rekapitulieren, die durch das Sehnenimpingement in vivo erzeugt wird und von den anatomischen Merkmalen der impingierten Region abhängt 5,6. Im Zusammenhang mit dem eingeklemmten Achillessehnenansatz umfasst dies umliegende Gewebe wie den Schleimbeutel retrocalcaneus und das Kager'sche Fettpolster 60,61,62,63. Umgekehrt erlauben In-vivo-Modelle des Sehnenimpingements 25,28,36,37,38,64,65,66 eine minimale Kontrolle über das Ausmaß und die Häufigkeit der direkt auf die Sehne aufgebrachten Belastung, was eine anerkannte Einschränkung von In-vivo-Modellen zur Untersuchung der Sehnenmechanobiologie darstellt57,58,67,68,69,70. Angesichts der Herausforderungen bei der Messung der Sehnendehnung in vivo ist die in diesen Modellen erzeugte interne Dehnungsumgebung oft schlecht charakterisiert.
In diesem Manuskript stellen wir eine maßgeschneiderte experimentelle Plattform vor, die das Impingement des Ansatzes der Achillessehne auf das Fersenbein innerhalb ganzer muriner Hintergliedmaßen-Explantate nachbildet, die, wenn sie mit diesem Gewebekulturprotokoll gepaart wird, die Lebensfähigkeit über 7 Tage in Explantatskultur aufrechterhält und die Untersuchung der biologischen Folgen des Sehnenimpingements ermöglicht. Die Plattform basiert auf einer 3D-gedruckten Basis aus Polymilchsäure (PLA), die die Grundlage für die Befestigung der Griffe und des 3D-gedruckten PLA-Volumenreduzierungseinsatzes bildet. Die Griffe werden verwendet, um den Oberschenkel und das Knie proximal des myotendinösen Übergangs der Achillessehne mit dem kaudalen Aspekt der Hinterextremität nach oben zu klemmen, so dass die Achillessehne von oben mit einer Ultraschallsonde oder einem inversen Mikroskop abgebildet werden kann (Abbildung 1A). Der Volumenreduzierungseinsatz gleitet entlang einer Schiene auf der Basis und reduziert das benötigte Volumen der Gewebekulturmedien. Eine geflochtene Schnur, die um die Hinterpfote gewickelt ist, wird unter Verwendung des Basisdesigns und eines 3D-gedruckten PLA-Clips aus der Plattform geführt. Durch das Ziehen an der Sehne wird die Hinterpfote dorsalflexiert und der Achillessehnenansatz gegen das Fersenbein gedrückt, was zu einer erhöhten Querdruckbelastungführt 5,6 (Abbildung 1A). Die Plattform befindet sich in einem Acrylbad, das die Explantaten der Hintergliedmaßen in Gewebekulturmedien untergetaucht hält. Durch die Befestigung der gespannten Schnur an der Außenseite des Bades mit Klebeband wird die Dorsalflexion des Knöchels aufrechterhalten, um ein statisches Auftreffen des Achillessehnenansatzes zu erzeugen. CAD-Dateien für 3D-gedruckte Komponenten werden in mehreren Formaten zur Verfügung gestellt (Ergänzungsdatei 1), die den Import in eine Reihe von kommerzieller und kostenloser Open-Source-CAD-Software ermöglichen, um sie an experimentelle Anforderungen anzupassen. Wenn der Zugang zu 3D-Druckern für die Fertigung nicht verfügbar ist, können CAD-Dateien an Online-3D-Druckdienste weitergegeben werden, die die Teile kostengünstig drucken und versenden.
Wichtig ist, dass der Trizeps-Surae-Achilles-Muskelkomplex sowohl das Knie- als auch das Sprunggelenk umfasst 71,72,73. Folglich wird die Zugbelastung in der Achillessehne durch die Kniebeugung beeinflusst. Die Kniestreckung setzt die Achillessehne unter Spannung, während die Kniebeugung die Spannung reduziert. Durch die Streckung des Knies und die anschließende passive Dorsalflexion des Sprunggelenks können die Zugbelastungen am auftreffenden Ansatz mit den Zugbelastungen überlagert werden. Umgekehrt wird durch passives Dorsalflexieren des Knöchels mit gebeugtem Knie die Zugbelastung reduziert und die Druckbelastung bleibt bestehen. Das derzeitige Protokoll untersucht drei solcher Bedingungen. 1) Für ein statisches Impingement wird der Fuß auf < 110° in Bezug auf das Schienbein dorsalflexiert, um den Ansatz zu berühren, wobei das Knie gebeugt wird, um die Spannung zu reduzieren. 2) Bei der Baseline-Spannungsgruppe wird der Knöchel bei gestrecktem Knie über 145° Dorsalflexion gestreckt, wodurch beim Einsetzen überwiegend Zugdehnung erzeugt wird. 3) Für die unbelastete Gruppe werden die Explantate in einer Petrischale kultiviert, wobei sich Knie und Knöchel in neutraler Position befinden, ohne dass eine von außen aufgebrachte Last erfolgt. Die oben genannten Winkel werden fotografisch relativ zu einem Koordinatensystem gemessen, in dem Fuß und Schienbein in einem Winkel von 180° parallel und in einem Winkel von 90° senkrecht stehen.
Zu den wichtigsten Schritten des Protokolls gehören: 1) die Präparation der Explantaten der Hintergliedmaßen und die sorgfältige Entfernung der Haut und der Plantarissehne; 2) Explantatkultur nach einer 48-stündigen Dexamethason-Vorbehandlung; 3) Gewebeschnitt und histologische Färbung; und 4) Farbbildanalyse zur Beurteilung der Faserknorpelbildung. Nach der Sektion wird jedes Explantat der Hintergliedmaßen für 48 Stunden in Nährmedien vorbehandelt, die mit Dexamethason74 ergänzt wurden. Die kontralateralen Gliedmaßen jeder Maus werden für den paarweisen Vergleich in separate Versuchsgruppen eingeteilt, was zur Kontrolle der biologischen Variabilität beiträgt. Nach der Vorbehandlung werden die Explantaten wie oben beschrieben in Plattformen positioniert und für weitere 7 Tage kultiviert (Abbildung 1B). Zusätzliche Vergleiche werden mit einer vorbehandelten Gruppe (Tag 0) angestellt, in der die Explantaten unmittelbar nach der 48-stündigen Vorbehandlung entfernt werden.
Nach der Explantatkultur werden die Hintergliedmaßen beschnitten, Formalin fixiert, entkalkt und in Paraffin eingebettet. Der serielle Schnitt in sagittaler Ausrichtung ermöglicht die Visualisierung der Achillessehne vom myotendinösen Übergang bis zum Fersenbeinansatz und ermöglicht die Verfolgung der Schnitttiefe durch die gesamte Sehne. Die terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT)-vermittelte dUTP-X-Nick-Markierung (TUNEL) wird verwendet, um DNA-Schäden als Folge der Apoptose sichtbar zu machen und die Lebensfähigkeit zu beurteilen. Toluidinblau-Histologie und benutzerdefinierte Farbbildanalyse werden durchgeführt, um Veränderungen in der GAG-Färbung zu quantifizieren. Toluidinblau gefärbte Gewebeschnitte werden dann für die SHG-Bildgebung verwendet, um Veränderungen in der Organisation der Kollagenfasern zu charakterisieren (Abbildung 1B).
Die vorgelegten repräsentativen Ergebnisse deuten auf eine veränderte histologische Färbung der GAG-reichen Matrix und eine Desorganisation des extrazellulären Kollagennetzwerks hin, die durch 7-tägiges statisches Impingement innerhalb des Modells erzeugt wurde. Dieses Modell kann verwendet werden, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Impingement-getriebenen fibroknorpeligen Veränderung zugrunde liegen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

Das Auftreffen der Sehne auf den Knochen erzeugt eine multiaxiale mechanische Dehnungsumgebung mit deutlich erhöhter transversaler Kompressionsdehnung, die einen lokalisierten Faserknorpelphänotyp hervorruft, der durch die Akkumulation von Glykosaminoglykan (GAG)-reicher Matrix und den Umbau des Kollagennetzwerks gekennzeichnet ist. Während Faserknorpel ein normales Merkmal in eingedrückten Regionen gesunder Sehnen ist, sind übermäßige GAG-Ablagerungen und Desorganisation des Kollagennetzwerks charakteristische Merkmale der Tendinopathie. Dementsprechend ist das Impingement klinisch als wichtiger extrinsischer Faktor bei der Initiierung und dem Fortschreiten der Tendinopathie anerkannt. Dennoch ist die Mechanobiologie, die dem Sehnenimpingement zugrunde liegt, noch wenig erforscht. Frühere Bemühungen, die zelluläre Reaktion auf Sehnenimpingement aufzuklären, haben die Zellen einachsig komprimiert und Sehnenexplantaten in vitro exzidiert. Isolierten Zellen fehlt jedoch eine dreidimensionale extrazelluläre Umgebung, die für die Mechanoreaktion entscheidend ist, und sowohl in vitro als auch in exzidierten Explantatsstudien ist es nicht möglich, die multiaxiale Belastungsumgebung zu rekapitulieren, die durch das Sehnenimpingement in vivo erzeugt wird, was von den anatomischen Merkmalen der impingierten Region abhängt. Darüber hinaus fehlt in vivo Modellen des Sehnenimpingements die Kontrolle über die mechanische Dehnungsumgebung. Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir ein neuartiges Maus-Explantatmodell der Hintergliedmaßen vor, das für die Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnenimpingements geeignet ist. Dieses Modell hält die Achillessehne in situ , um die lokale Anatomie zu erhalten, und reproduziert die multiaxiale Belastungsumgebung, die durch das Auftreffen des Achillessehnenansatzes auf das Fersenbein während der passiv angelegten Knöcheldorsalflexion erzeugt wird, während die Zellen in ihrer natürlichen Umgebung erhalten bleiben. Wir beschreiben ein Gewebekulturprotokoll, das integraler Bestandteil dieses Modells ist, und präsentieren Daten, die eine anhaltende Explantatlebensfähigkeit über 7 Tage belegen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen eine verstärkte histologische GAG-Färbung und eine verminderte Kollagenfaserausrichtung als Folge des Impingements, was auf eine erhöhte Faserknorpelbildung hindeutet. Dieses Modell kann leicht angepasst werden, um verschiedene mechanische Belastungsregime zu untersuchen, und ermöglicht die Manipulation molekularer Signalwege von Interesse, um Mechanismen zu identifizieren, die phänotypische Veränderungen in der Achillessehne als Reaktion auf ein Impingement vermitteln.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Mechanobiologie des Sehnenimpingements – Ein multiaxiales Explantatmodell für die Hintergliedmaßen der Maus 

Maus-Hintergliedmaßen-Explantatmodell zur Untersuchung der Mechanobiologie des Achillessehnen-Impingements

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Repräsentative Bilder von TUNEL-gefärbten Gewebeschnitten zeigen minimale apoptotische Kerne im Körper der Achillessehne nach 7 Tagen Explantatskultur in verschiedenen Experimentalgruppen (Abbildung 2A). Die Quantifizierung dieser Bilder liefert Hinweise darauf, dass das Gewebekulturprotokoll nach 7 Tagen Explantatskultur unter allen Belastungsbedingungen eine durchschnittliche Lebensfähigkeit von bis zu 78 % in der Achillessehne aufrechterhält (Abbildung 2B</strong...

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Wir stellen eine maßgeschneiderte experimentelle Plattform und ein Gewebekulturprotokoll vor, das fibroknorpelige Veränderungen nachbildet, die durch das Impingement der Achillessehneninsertion in murinen Hintergliedmaßenexplantaten mit anhaltender Zelllebensfähigkeit verursacht werden, und so ein Modell für die Erforschung der Mechanobiologie des Sehnenimpingements bietet.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Wir untersuchen die Mechanobiologie, die dem Sehnenimpingement zugrunde liegt, und den Prozess, durch den diese einzigartige mechanische Anforderung die lokalisierte Bildung von Faserknorpel bei Gesundheit und Krankheit antreibt. In dieser Arbeit versuchen wir, die Matrix für die Modellierung relativ zu räumlich heterogenen Mustern multiaxialer mechanischer Dehnungen, die durch Impingement erzeugt werden, zu charakterisieren und molekulare Mechanismen zu identifizieren, die diese Reaktion vermitteln. In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Impingement-Mechanobiologie haben eine einfache Kompression auf isolierte Sehnenzellen oder künstliche einachsige Kompression auf partielle und ganze Sehnenexplantaten angewendet.Etablierung von Tiermodellen des Sehnenimpingements, Manipulation der externen Quelle des Sehnenimpingements in vivo meist chirurgisch und Erforschung der Biologie nach Wiederaufnahme der körperlichen Aktivität. In-vitro-Modelle weisen erhebliche Einschränkungen auf, da isolierten Zellen ihre dreidimensionale extrazelluläre Umgebung fehlt, die für die Mechanoantwort entscheidend ist. Während exzidierte Explantatsmodelle diese Einschränkung umgehen, gelingt es beiden nicht, multiaxiale Dehnungsmuster, die durch Impingement in vivo erzeugt werden, zu rekonstruieren.Umgekehrt bieten Tiermodelle nur begrenzte Möglichkeiten, innere Gewebebelastungen zu messen oder zu kontrollieren. Unser Maus-Hintergliedmaßen-Explantatmodell zur Untersuchung der Impingement-Mechanobiologie hält die Zellen in ihrer extrazellulären Umgebung und bewahrt die lokale Anatomie des eingedrückten Achillessehnenansatzes in situ, was eine kontrollierte Verschreibung des Impingements durch passiv angewandte Gelenkbewegung ermöglicht, um multiaxiale Muster der Gewebebelastung zu reproduzieren, die messbar und gut charakterisiert sind.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Forschung

Biotechnik

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Explantatdissektion zur Generierung eines Explantatmodells der hinteren Gliedmaßen der Maus zur Untersuchung des Sehnenimpingements

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.