Name: Autore in primo piano: Svelare la meccanobiologia del conflitto tendineo - Un modello di espiantazione multiassiale degli arti posteriori murini
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Gli autori sono grati per il supporto e l'assistenza forniti da Jeff Fox e Vidya Venkatramani del Centro per la ricerca muscoloscheletrica dell'Università di Rochester per l'istologia, la biochimica e l'imaging molecolare (HBMI) Core, finanziato in parte da P30AR06965. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare il Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) presso l'Università di Rochester Medical Center per l'assistenza con la microscopia multifotone. Questo studio è stato finanziato da R01 AR070765 e R01 AR070765-04S1, nonché da 1R35GM147054 e 1R01AR082349.

Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato per le risorse animali dell'Università di Rochester.
1. Preparazione dei terreni di coltura tissutale
<ol><li>Coltivare tutti gli espianti in Modified Eagle Medium di Dulbecco (1x DMEM) con penicillina-streptomicina all'1% v/v e acido L-ascorbico 200 μM in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 . Per il pretrattamento iniziale di 48 ore, coltura di ciascun espianto in 70 mL di terreno di coltura integrato...

Comprensione dell'impingement tendineo - Modello di espianto murino per lo studio della meccanobiologia

La piattaforma sperimentale di espianto dell'arto posteriore murino abbinata al protocollo di coltura tissutale descritto in questo studio fornisce un modello adatto per studiare la meccanobiologia della formazione di fibrocartilagine guidata dal conflitto all'inserzione del tendine d'Achille. L'utilità di questo modello di espianto è dimostrata dai risultati rappresentativi, che indicano il mantenimento della vitalità cellulare in concomitanza con un cambiamento significativo e spazialmente eterogeneo nella colorazio...

Una moltitudine di tendini, tra cui il tendine d'Achille e i tendini della cuffia dei rotatori, subiscono un conflitto osseo a causa del normale posizionamento anatomico1,2,3,4. L'impingement tendineo genera una deformazione di compressione diretta trasversalmente all'asse longitudinale della fibra5,6,7. Le regioni di conflitto tendineo dimostrano un fenotipo unico della fibrocartilagine in cui le cellule rotonde e rimpicciolite (fibrocondrociti) sono incorporate all'interno di una rete di collagene disorganizzata con un contenuto di glicosaminoglicani (GAG) marcatamente aumentato2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Studi precedenti suggeriscono che il disparato ambiente meccanico prodotto dall'impingement tendineo sostiene questa matrice ricca di gag guidando la deposizione di grandi proteoglicani aggreganti, in particolare l'aggrecano, anche se i meccanismi sottostanti non sono chiari1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, il metabolismo aberrante dei proteoglicani associato all'eccessiva formazione di fibrocartilagine è una caratteristica distintiva della tendinopatia, una malattia comune e debilitante che emerge in modo sproporzionato nei tendini cronicamente impattati1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Di conseguenza, l'impingement tendineo è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco alla base di molte delle tendinopatie più comuni, tra cui la malattia della cuffia dei rotatori e la tendinopatia inserzionale del tendine d'Achille (IAT)50,51,52. Attualmente, il trattamento della tendinopatia è inefficiente. Ad esempio, circa il 47% dei pazienti con IAT richiede un intervento chirurgico dopo una gestione conservativa fallita, con esiti postoperatori variabili53,54,55,56. Nonostante l'apparente relazione tra impingement e tendinopatia, i meccanismi meccanobiologici attraverso i quali le cellule nel tendine impattato percepiscono e rispondono al loro ambiente meccanico sono scarsamente descritti, il che oscura la comprensione della patogenesi della tendinopatia e si traduce in un trattamento inadeguato.
I modelli di espianto sono strumenti utili nello studio della meccanobiologia tendinea57,58. Come primo passo verso la comprensione della meccanobiologia dell'impingement tendineo, diversi studi precedenti hanno esplorato la risposta cellulare in seguito all'applicazione di una semplice compressione uniassiale alle cellule o agli espianti di tendiniasportati 27,29,30,31,32,33,34,39. Tuttavia, le cellule in vitro mancano di matrici extracellulari e pericellulari che facilitano il trasferimento di ceppi, sequestrano importanti fattori di crescita e citochine rilasciate dalla deformazione meccanica e forniscono substrato per complessi di adesione focale che svolgono un ruolo nella meccanotrasduzione57,59. Inoltre, sia gli studi in vitro che quelli con espianto asportato non riescono a ricapitolare l'ambiente di deformazione meccanica multiassiale generato dall'impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata 5,6. Nel contesto dell'inserzione del tendine d'Achille impattata, ciò include i tessuti circostanti come la borsa retrocalcaneare e il cuscinetto adiposo 60,61,62,63 di Kager. Al contrario, i modelli in vivo di impingement tendineo 25,28,36,37,38,64,65,66 consentono un controllo minimo sull'entità e sulla frequenza del carico applicato direttamente al tendine, che è una limitazione ben nota dei modelli in vivo per lo studio della meccanobiologia tendinea 57,58,67,68,69,70. Date le sfide nella misurazione della deformazione tendinea in vivo, l'ambiente di deformazione interna generato all'interno di questi modelli è spesso scarsamente caratterizzato.
In questo manoscritto, presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata che ricrea l'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille sul calcagno all'interno di espianti dell'arto posteriore murino intero che, se abbinato a questo protocollo di coltura tissutale, mantiene la vitalità per 7 giorni in coltura di espianto e consente lo studio delle sequele biologiche dell'impingement tendineo. La piattaforma è costruita su una base di acido polilattico (PLA) stampata in 3D che fornisce la base per il fissaggio delle impugnature e l'inserto di riduzione del volume in PLA stampato in 3D. Le impugnature vengono utilizzate per bloccare la parte superiore della gamba e il ginocchio prossimale alla giunzione miotendinea di Achille con l'aspetto caudale dell'arto posteriore rivolto verso l'alto, consentendo di visualizzare il tendine d'Achille dall'alto utilizzando una sonda a ultrasuoni o un microscopio invertito (Figura 1A). L'inserto di riduzione del volume scorre lungo un binario sulla base e riduce il volume richiesto dei terreni di coltura tissutale. Una linea intrecciata avvolta attorno alla zampa posteriore viene instradata fuori dalla piattaforma utilizzando il design della base e una clip in PLA stampata in 3D. Tirando la corda, la zampa posteriore viene dorsiflessa e l'inserzione del tendine d'Achille viene urtata contro il calcagno, con conseguente elevata deformazione di compressione trasversale 5,6 (Figura 1A). La piattaforma è contenuta all'interno di un bagno acrilico che mantiene gli espianti dell'arto posteriore immersi nei terreni di coltura tissutale. Fissando la corda tesa all'esterno della vasca con nastro adesivo si mantiene la flessione dorsale della caviglia per produrre un impatto statico dell'inserzione del tendine d'Achille. I file CAD per i componenti stampati in 3D sono forniti in più formati (File supplementare 1), consentendo l'importazione in una gamma di software CAD commerciali e gratuiti open source per la modifica in base alle esigenze sperimentali. Se l'accesso alle stampanti 3D non è disponibile per la fabbricazione, i file CAD possono essere forniti ai servizi di stampa 3D online che stamperanno e spediranno le parti a basso costo.
È importante sottolineare che il complesso muscolotendineo tricipite surale-achille si estende su entrambe le articolazioni del ginocchio e della caviglia 71,72,73. Di conseguenza, la tensione di trazione nel tendine d'Achille è influenzata dalla flessione del ginocchio. L'estensione del ginocchio mette in tensione il tendine d'Achille, mentre la flessione del ginocchio riduce la tensione. Estendendo prima il ginocchio e poi flettendo passivamente la caviglia, le deformazioni di compressione all'inserzione impattata possono essere sovrapposte alle deformazioni di trazione. Al contrario, flettendo passivamente la caviglia con il ginocchio flesso, la tensione di trazione si riduce e la tensione di compressione rimane. L'attuale protocollo esplora tre di queste condizioni. 1) Per l'impingement statico, il piede viene piegato dorsalmente a < 110° rispetto alla tibia per ostacolare l'inserimento, con il ginocchio flesso per ridurre la tensione. 2) Per il gruppo di tensione basale, la caviglia viene estesa oltre i 145° di flessione dorsale con il ginocchio esteso, generando una tensione di trazione prevalente all'inserzione. 3) Per il gruppo scarico, gli espianti vengono coltivati in una capsula di Petri con il ginocchio e la caviglia in posizione neutra in assenza di carico applicato esternamente. Gli angoli di cui sopra sono misurati fotograficamente rispetto a un sistema di coordinate in cui il piede e la tibia sono paralleli con un angolo di 180° e perpendicolari con un angolo di 90°.
Le fasi chiave del protocollo includono: 1) la dissezione degli espianti degli arti posteriori e l'attenta rimozione della cute e del tendine plantare; 2) coltura di espianto dopo un pretrattamento di 48 ore con desametasone; 3) sezionamento tissutale e colorazione istologica; e 4) analisi dell'immagine a colori per valutare la formazione di fibrocartilagine. Dopo la dissezione, ogni espianto dell'arto posteriore viene pretrattato per 48 ore in terreni di coltura integrati con desametasone74. Gli arti controlaterali di ciascun topo vengono assegnati a gruppi sperimentali separati per il confronto a coppie, che aiuta a controllare la variabilità biologica. Dopo il pretrattamento, gli espianti vengono posizionati su piattaforme come descritto sopra e coltivati per altri 7 giorni (Figura 1B). Ulteriori confronti vengono effettuati con un gruppo pretrattato (giorno 0) in cui gli espianti vengono rimossi immediatamente dopo il pretrattamento di 48 ore.
Dopo la coltura dell'espianto, gli arti posteriori vengono tagliati, fissati in formalina, decalcificati e incorporati in paraffina. Il sezionamento seriale in orientamento sagittale fornisce la visualizzazione del tendine d'Achille dalla giunzione miotendinea all'inserzione calcaneare, consentendo al contempo di monitorare la profondità della sezione attraverso l'intero tendine. La marcatura dUTP X-nick mediata dalla deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (TUNEL) viene utilizzata per visualizzare il danno al DNA secondario all'apoptosi e valutare la vitalità. L'istologia del blu di toluidina e l'analisi dell'immagine a colori personalizzata vengono eseguite per quantificare i cambiamenti nella colorazione GAG. Le sezioni di tessuto colorate con blu di toluidina vengono quindi utilizzate per l'imaging SHG per caratterizzare le alterazioni nell'organizzazione delle fibre del collage (Figura 1B).
I risultati rappresentativi forniti suggeriscono un'alterata colorazione istologica della matrice ricca di gag e la disorganizzazione della rete di collagene extracellulare generata da 7 giorni di impingement statico all'interno del modello. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i meccanismi molecolari alla base del cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

L'impingement del tendine sull'osso genera un ambiente di deformazione meccanica multiassiale con deformazione compressiva trasversale marcatamente elevata, che suscita un fenotipo localizzato della fibrocartilagine caratterizzato dall'accumulo di matrice ricca di glicosaminoglicani (GAG) e dal rimodellamento della rete di collagene. Mentre la fibrocartilagine è una caratteristica normale nelle regioni colpite dei tendini sani, l'eccesso di deposizione di GAG e la disorganizzazione della rete di collagene sono caratteristiche distintive della tendinopatia. Di conseguenza, l'impingement è clinicamente riconosciuto come un importante fattore estrinseco nell'inizio e nella progressione della tendinopatia. Ciononostante, la meccanobiologia alla base dell'impingement tendineo rimane poco studiata. Gli sforzi precedenti per chiarire la risposta cellulare all'impingement tendineo hanno applicato la compressione uniassiale alle cellule e asportato espianti tendinei in vitro. Tuttavia, le cellule isolate mancano di un ambiente extracellulare tridimensionale cruciale per la meccanorisposta, e sia gli studi in vitro che quelli sull'espianto asportato non riescono a ricapitolare l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impingement tendineo in vivo, che dipende dalle caratteristiche anatomiche della regione impattata. Inoltre, i modelli in vivo di impingement tendineo mancano di controllo sull'ambiente di deformazione meccanica. Per superare queste limitazioni, presentiamo un nuovo modello murino di espianto dell'arto posteriore adatto allo studio della meccanobiologia dell'impingement del tendine d'Achille. Questo modello mantiene il tendine d'Achille in situ per preservare l'anatomia locale e riproduce l'ambiente di deformazione multiassiale generato dall'impatto dell'inserzione del tendine d'Achille sul calcagno durante la flessione dorsale della caviglia applicata passivamente, mantenendo le cellule all'interno del loro ambiente nativo. Descriviamo un protocollo di coltura tissutale parte integrante di questo modello e presentiamo i dati che stabiliscono la vitalità dell'espianto sostenuta per 7 giorni. I risultati rappresentativi dimostrano una migliore colorazione istologica del GAG e una diminuzione dell'allineamento delle fibre di collagene secondarie al impingement, suggerendo un'elevata formazione di fibrocartilagine. Questo modello può essere facilmente adattato per studiare diversi regimi di carico meccanico e consente la manipolazione di percorsi molecolari di interesse per identificare i meccanismi che mediano il cambiamento fenotipico nel tendine d'Achille in risposta all'impingement.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Autore in primo piano: Svelare la meccanobiologia del conflitto tendineo - Un modello di espiantazione multiassiale degli arti posteriori murini 

Modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia del conflitto del tendine d'Achille

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Le immagini rappresentative delle sezioni di tessuto colorate con TUNEL dimostrano nuclei apoptotici minimi all'interno del corpo del tendine d'Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutti i gruppi sperimentali (Figura 2A). La quantificazione di queste immagini fornisce la prova che il protocollo di coltura tissutale mantiene in media fino al 78% di vitalità all'interno del tendine d'Achille dopo 7 giorni di coltura di espianto in tutte le condizioni di carico (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Presentiamo una piattaforma sperimentale personalizzata e un protocollo di coltura tissutale che ricrea il cambiamento fibrocartilagineo guidato dall'impingement dell'inserzione del tendine d'Achille in espianti murini dell'arto posteriore con vitalità cellulare sostenuta, fornendo un modello adatto per esplorare la meccanobiologia dell'impingement tendineo.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Studiamo la meccanobiologia alla base dell'impingement tendineo e il processo attraverso il quale questa richiesta meccanica unica guida la formazione localizzata di cartilagine in fibra in salute e malattia. Qui cerchiamo di caratterizzare la matrice per la modellazione relativa a modelli spazialmente eterogenei di deformazione meccanica multiassiale, generati da impingement e di identificare i meccanismi molecolari che mediano questa risposta. I modelli in vitro per lo studio della meccanobiologia dell'impingement hanno applicato la compressione semplice a cellule tendinee isolate o la compressione uniassiale artificiale a espianti tendinei parziali e interi.Modelli animali consolidati di conflitto tendineo, manipolando la fonte esterna di conflitto tendineo in vivo il più delle volte chirurgicamente ed esplorando la biologia dopo la ripresa dell'attività fisica. I modelli in vitro presentano limitazioni significative in quanto le cellule isolate mancano del loro ambiente extracellulare tridimensionale, cruciale per la meccano-risposta. Mentre i modelli di espianto asportato aggirano questa limitazione, entrambi non riescono a ricreare modelli di deformazione multiassiale generati dall'impingement in vivo.Al contrario, i modelli animali offrono una capacità limitata di misurare o controllare i ceppi tissutali interni. Il nostro modello murino di espianto dell'arto posteriore per lo studio della meccanobiologia dell'impingement mantiene le cellule all'interno del loro ambiente extracellulare e preserva l'anatomia locale dell'inserzione del tendine d'Achille impattato in situ, consentendo la prescrizione controllata dell'impingement attraverso il movimento articolare applicato passivamente per ricreare modelli multiassiali di deformazione tissutale misurabili e ben caratterizzati.

murine-hind-limb-explant-model-for-studying-mechanobiology-achilles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Ricerca

Bioingegneria

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Dissezione dell'espianto per generare un modello di espianto dell'arto posteriore murino per studiare l'impingement del tendine

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.