Name: 著者スポットライト:腱インピンジメントのメカニズム生物学を解明する – 多軸マウス後肢外植片モデル
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

著者らは、P30AR06965ロチェスター大学筋骨格研究センターの組織学、生化学、分子イメージング(HBMI)コアのJeff Fox氏とVidya Venkatramani氏による支援と支援に感謝しています。さらに、著者らは、多光子顕微鏡法の支援について、ロチェスター大学医療センターの光学顕微鏡およびナノスコピーセンター(CALMN)に感謝します。この研究は、R01 AR070765 と R01 AR070765-04S1、および 1R35GM147054 と 1R01AR082349 から資金提供を受けました。

すべての動物実験は、ロチェスター大学動物資源委員会によって承認されました。
1. 組織培養培地の調製
<ol><li>すべての外植片を、1% v/v ペニシリン-ストレプトマイシンと 200 μM L-アスコルビン酸を含む Dulbecco Modified Eagle 培地 (1x DMEM) で、37 °C および 5% CO2 のインキュベーターで培養します。最初の48時間前処理では、100 nMのデキサメタゾン<sup class=...

腱インピンジメントの理解 – メカノバイオロジー研究のためのマウス外植片モデル

この研究で説明した組織培養プロトコルと組み合わせた実験的なマウス後肢外植片プラットフォームは、アキレス腱挿入時のインピンジメント駆動線維軟骨形成のメカノバイオロジーを研究するための適切なモデルを提供します。この外植片モデルの有用性は、7日間の静的衝突後のトルイジン青色染色の有意かつ空間的に不均一な変化に伴う細胞生存率の維持を示す代表的な結果によって実...

アキレス腱や回旋筋腱板腱を含む多くの腱は、正常な解剖学的位置により骨のインピンジメントを経験します1,2,3,4.腱の衝突は、縦方向の繊維軸に横方向に向けられた圧縮ひずみを生成します5,6,7.腱インピンジメントの領域は、グリコサミノグリカン(GAG)含量が著しく増加した無秩序なコラーゲンネットワーク内に、縮小した丸い細胞(線維軟骨細胞)が埋め込まれている独特の線維軟骨表現型を示します2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.これまでの研究では、腱のインピンジメントによって生じる異種の機械的環境が、凝集したプロテオグリカン(特にアグリカン)の沈着を促進し、このGAGに富むマトリックスを維持していることが示唆されているが、その根底にあるメカニズムは不明である1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰な線維軟骨形成に関連する異常なプロテオグリカン代謝は、慢性的に侵迫した腱に不釣り合いに出現する一般的で衰弱性疾患である腱鞘炎の特徴です1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.したがって、腱インピンジメントは、回旋筋腱板疾患や挿入性アキレス腱炎(IAT)など、最も一般的な腱鞘炎のいくつかを引き起こす重要な外因性要因として臨床的に認識されています50,51,52.現在、腱鞘炎の治療は非効率的です。例えば、IAT患者の約47%は、保存的管理に失敗した後に外科的介入を必要とし、術後の転帰はさまざまである53,54,55,56.インピンジメントと腱鞘炎の間には明らかな関係があるにもかかわらず、インピンジメントされた腱の細胞が機械的環境を感知して応答するメカノバイオロジカルメカニズムは十分に説明されておらず、腱鞘炎の病因の理解が曖昧になり、不十分な治療につながります。
外植モデルは、腱メカノバイオロジーの研究において有用なツールである57,58.腱インピンジメントのメカノバイオロジーを理解するための最初のステップとして、いくつかの先行研究は、細胞または腱外植片を切除した単純な一軸圧迫を適用した後の細胞応答を調査しています27,29,30,31,32,33,34,39。しかし、in vitroの細胞は、菌株伝達を促進し、機械的変形によって放出される重要な成長因子とサイトカインを隔離し、メカノトランスダクションに関与する焦点接着複合体の基質を提供する細胞外および細胞周囲マトリックスを欠いています57,59。さらに、in vitroおよび切除された外植片研究は、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸機械的ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します5,6。インピンドされたアキレス腱挿入の文脈では、これには、踵骨後滑液包およびケーガー脂肪パッド60,61,62,63などの周囲組織が含まれる。逆に、腱インピンジメントのin vivoモデル25,28,36,37,38,64,65,66は、腱に直接加えられる荷重の大きさと周波数を最小限に制御することを可能にし、これは腱メカノバイオロジーを研究するためのin vivoモデルのよく知られた限界である57,58、67,68,69,70。in vivoでの腱のひずみ測定が困難なため、これらのモデル内で発生する内部ひずみ環境は、多くの場合、十分に特徴付けられていません。
この原稿では、マウス後肢外植片全体の踵骨へのアキレス腱挿入のインピンジメントを再現するカスタム実験プラットフォームを提示し、この組織培養プロトコルと組み合わせると、外植片培養で7日間にわたって生存率を維持し、腱インピンジメントの生物学的後遺症の研究を可能にします。このプラットフォームは、3Dプリントされたポリ乳酸(PLA)ベースに基づいて構築されており、グリップと3DプリントされたPLAボリュームリダクションインサートの取り付けの基礎を提供します。グリップは、後肢の尾側を上に向けて、上肢と膝をアキレス筋腱接合部に近位に固定するために使用され、超音波プローブまたは倒立顕微鏡を使用してアキレス腱を上から画像化できます(図1A)。減容インサートは、ベースのトラックに沿ってスライドし、組織培養培地の必要量を減らします。後ろ足に巻き付けられた編み込みラインは、ベースデザインと3DプリントされたPLAクリップを利用してプラットフォームからルーティングされます。紐を引っ張ることで、後足が背屈し、アキレス腱の挿入が踵骨に押し付けられ、横方向の圧縮歪みが上昇します5,6(図1A)。プラットフォームは、組織培養培地に浸された後肢の外植片を維持するアクリル浴内に含まれています。ピンと張った紐を粘着テープで浴槽の外側に固定すると、足首の背屈が維持され、アキレス腱挿入の静的インピンジメントが発生します。3DプリントされたコンポーネントのCADファイルは、複数のフォーマット(補足ファイル1)で提供されており、実験のニーズに合わせて変更するために、さまざまな商用および無料のオープンソースCADソフトウェアにインポートできます。製造に3Dプリンターを利用できない場合は、CADファイルをオンライン3Dプリントサービスに提供して、低コストで部品をプリントして出荷することができます。
重要なことに、上腕三頭筋-アキレス腱複合体は、膝関節と足首関節の両方にまたがっています71,72,73。その結果、アキレス腱の引張ひずみは膝の屈曲の影響を受けます。膝の伸展はアキレス腱に緊張をかけますが、膝の屈曲は緊張を軽減します。最初に膝を伸ばし、次に足首を受動的に背屈させることで、衝突した挿入時の圧縮ひずみを引張ひずみに重ね合わせることができます。逆に、膝を屈曲させた状態で足首を受動的に背屈させることで、引張ひずみが軽減され、圧縮ひずみが残ります。現在のプロトコルでは、そのような 3 つの条件が検討されています。1)静的インピンジメントの場合、足を脛骨に対して110°<に背屈させて挿入をインピンディングし、膝を曲げて緊張を軽減します。2)ベースラインテンショングループでは、膝を伸ばした状態で足首を背屈145°以上に伸ばし、挿入時に主に引張緊張を発生させます。3)無負荷群の場合、外植片は、外部から負荷がかからない状態で、膝と足首を中立位置にしてペトリ皿で培養します。上記の角度は、足と脛骨が180°の角度で平行で、90°の角度で垂直である座標系に対して写真で測定されます。
プロトコルの主なステップには、1)後肢の外植片の解剖と皮膚と足底腱の慎重な除去が含まれます。2)48時間のデキサメタゾン前処理後の外植片培養。3)組織切片および組織学的染色;4)線維軟骨形成を評価するためのカラー画像解析。解剖後、各後肢外植片をデキサメタゾン74を添加した培地中で48時間前処理する。各マウスの対側肢は、ペアワイズ比較のために別々の実験グループに割り当てられ、生物学的変動を制御するのに役立ちます。前処理後、外植片を上記のようにプラットフォームに配置し、さらに7日間培養します(図1B)。48時間の前処理の直後に外植片を除去する前処理(0日目)グループへの追加の比較が行われます。
外植片培養後、後肢を切り落とし、ホルマリンを固定し、脱灰し、パラフィンに包埋します。矢状方向の連続切片は、筋腱接合部から踵骨挿入までのアキレス腱を視覚化し、腱全体を切片の深さを追跡することができます。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を介したdUTP X-nickラベリング(TUNEL)は、アポトーシスに続発するDNA損傷を可視化し、生存率を評価するために使用されます。トルイジンブルーの組織学とカスタムカラー画像解析を行い、GAG染色の変化を定量化します。次に、トルイジンブルーで染色した組織切片をSHGイメージングに使用し、コラージュ線維組織の変化を特徴付けます(図1B)。
提供された代表的な結果は、GAGリッチマトリックスの組織学的染色の変化と、モデル内の7日間の静的衝突によって生成された細胞外コラーゲンネットワークの混乱を示唆しています。このモデルは、インピンジメントによる線維軟骨性変化の根底にある分子メカニズムを探るために利用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

骨への腱の衝突は、横方向の圧縮ひずみが著しく上昇した多軸の機械的ひずみ環境を生成し、グリコサミノグリカン(GAG)に富むマトリックスの蓄積とコラーゲンネットワークのリモデリングを特徴とする局所的な線維軟骨表現型を誘発します。線維軟骨は健康な腱の侵食領域では正常な特徴ですが、過剰なGAG沈着とコラーゲンネットワークの混乱は腱鞘炎の特徴です。したがって、インピンジメントは、腱鞘炎の開始と進行における重要な外因性因子として臨床的に認識されています。それにもかかわらず、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーは研究が不十分なままです。腱インピンジメントに対する細胞応答を解明するための以前の取り組みは、細胞に一軸圧迫を適用し、in vitroで腱外植片を切除しました。しかし、単離された細胞は、機械応答に重要な3次元の細胞外環境を欠いており、 in vitro および切除外植片研究の両方で、in vivoでの腱の衝突によって生成される多軸ひずみ環境を再現することができず、これは衝突領域の解剖学的特徴に依存します。さらに、腱インピンジメントの in vivo モデルでは、機械的ひずみ環境を制御できません。これらの限界を克服するために、アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジーを研究するのに適した新しいマウス後肢外植片モデルを提示します。このモデルは、アキレス腱を その場で 維持して局所的な解剖学的構造を維持し、受動的に加えられた足首背屈時にアキレス腱が踵骨に挿入されることによって発生する多軸ひずみ環境を再現し、細胞を本来の環境に保持します。このモデルに不可欠な組織培養プロトコルについて説明し、7日間にわたる持続的な外植片の生存率を確立するデータを提示します。代表的な結果は、組織学的GAG染色の亢進とインピンジメントに続発するコラーゲン線維のアライメントの低下を示しており、線維軟骨形成の上昇を示唆しています。このモデルは、さまざまな機械的負荷レジメンの調査に容易に適応でき、インピンジメントに応答してアキレス腱の表現型変化を媒介するメカニズムを特定するために、目的の分子経路を操作することができます。

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

著者スポットライト:腱インピンジメントのメカニズム生物学を解明する – 多軸マウス後肢外植片モデル 

アキレス腱インピンジメントのメカノバイオロジー研究のためのマウス後肢外植モデル

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

TUNELで染色した組織切片の代表的な画像は、実験グループ全体で7日間の外植片培養後のアキレス腱の体内のアポトーシス核が最小であることを示しています(図2A)。これらの画像の定量化により、組織培養プロトコルは、ロード条件全体で 7 日間の外植片培養後、アキレス腱内で平均最大 78% の生存率を維持するという証拠が得られます(図 2B)。
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マウス後肢外植片におけるアキレス腱挿入のインピンジメントによって引き起こされる線維軟骨性変化を再現するカスタム実験プラットフォームと組織培養プロトコルを提示し、腱インピンジメントのメカノバイオロジーを探索するのに適したモデルを提供します。

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

私たちは、腱インピンジメントの根底にあるメカノバイオロジーと、このユニークな機械的要求が健康と疾患における局所的な繊維軟骨形成を促進するプロセスを研究しています。本研究では、衝突によって生じる多軸力学的ひずみの空間的に不均質なパターンに対するモデリングのためのマトリックスの特性評価と、この応答を媒介する分子機構の同定を目指します。インピンジメントメカノバイオロジーを研究するための In vitro モデルでは、単離された腱細胞に単純な圧縮を適用したり、部分的および全体の腱外植片に人工的な一軸圧縮を適用したりしています。腱インピンジメントの動物モデルを確立し、in vivoでの腱インピンジメントの外部発生源を外科的に操作し、身体活動を再開した後の生物学を探求しました。単離された細胞は、メカノ応答に不可欠な3次元の細胞外環境を欠いているため、in vitroモデルには大きな制限があります。切除された外植片モデルはこの制限を回避しますが、どちらもin vivoでの衝突によって生成された多軸ひずみパターンを再現できません。逆に、動物モデルでは、内部組織の緊張を測定または制御する能力が限られています。インピンジメントメカノバイオロジーを研究するためのマウス後肢外植片モデルは、細胞を細胞外環境内に維持し、インピンジメントされたアキレス腱挿入の局所解剖学的構造をその場で保存し、受動的に加えられた関節運動によるインピンジメントの制御された処方を可能にし、測定可能で十分に特徴付けられた組織ひずみの多軸パターンを再現します。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

生物工学

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

腱インピンジメントを研究するためのマウス後肢外植片モデルを生成するための外植片解剖

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.