Name: 저자 스포트라이트: 힘줄 충돌의 기계생물학 규명 – 다축 쥐 뒷다리 이식 모델
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

저자들은 P30AR06965가 부분적으로 자금을 지원한 로체스터 대학교 근골격계 연구 센터의 조직학, 생화학 및 분자 이미징(HBMI) 코어의 Jeff Fox와 Vidya Venkatramani가 제공한 지원과 도움에 감사드립니다. 또한 저자들은 다광자 현미경 검사에 도움을 준 로체스터 대학 의료 센터의 광학 현미경 및 나노스코피 센터(CALMN)에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 R01 AR070765 및 R01 AR070765-04S1, 1R35GM147054 및 1R01AR082349의 자금 지원을 받았습니다.

모든 동물 연구는 로체스터 대학교 동물 자원 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 조직 배양 배지의 제조
<ol><li>37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 1% v/v 페니실린-스트렙토마이신 및 200μM L-아스코르브산을 사용하여 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(1x DMEM)에서 모든 외식을 배양합니다. 초기 48시간 전처리의 경우, 100nM 덱사메타손74가 보충된 70mL의 배?...

힘줄 충돌의 이해 – 기계생물학 연구를 위한 쥐 외식물 모델

이 연구에서 설명한 조직 배양 프로토콜과 결합된 실험용 쥐 뒷다리 이식 플랫폼은 아킬레스건 삽입 시 충돌 유도 섬유연골 형성의 역학을 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다. 이 이식 모델의 유용성은 7일간의 정적 충돌 후 톨루이딘 블루 염색에서 유의미하고 공간적으로 이질적인 변화와 함께 세포 생존율의 유지를 나타내는 대표적인 결과로 입증됩니다. 이러한 발견은 기계적 충돌에 이차...

아킬레스건과 회전근개 힘줄을 포함한 많은 힘줄은 정상적인 해부학적 위치로 인해 뼈 충돌을 경험합니다1,2,3,4. 힘줄 충돌은 종방향 섬유 축에 횡방향으로 향하는 압축 변형을 생성합니다.5,6,7. 힘줄 충돌 부위는 수축된 둥근 세포(섬유연골세포)가 글리코사미노글리칸(GAG) 함량이 현저히 증가한 무질서한 콜라겐 네트워크 내에 내장되어 있는 독특한 섬유연골 표현형을 보여줍니다2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. 이전 연구에서는 힘줄 충돌에 의해 생성된 이질적인 기계적 환경이 기본 메커니즘은 불분명하지만 큰 응집체 프로테오글리칸, 특히 아그레칸의 침착을 유도하여 이 GAG가 풍부한 매트릭스를 유지한다고 제안합니다1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 섬유연골 형성과 관련된 비정상적인 프로테오글리칸 대사는 만성적으로 충돌된 힘줄에서 불균형적으로 나타나는 흔하고 쇠약해지는 질병인 건병증의 특징입니다1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. 따라서 힘줄 충돌은 회전근개 질환 및 삽입성 아킬레스 건병증(IAT)을 포함한 가장 흔한 건병증을 유발하는 중요한 외인적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다50,51,52. 현재 건병증의 치료는 비효율적입니다. 예를 들어, IAT 환자의 약 47%는 보존적 관리 실패 후 외과적 개입이 필요하며, 수술 후 결과는 다양합니다53,54,55,56. 충돌과 건병증 사이의 명백한 관계에도 불구하고, 충돌한 힘줄의 세포가 기계적 환경을 감지하고 반응하는 기계생물학적 메커니즘이 제대로 설명되지 않아 건병증 발병기전에 대한 이해가 모호하고 부적절한 치료가 발생합니다.
외식(Explant) 모델은 힘줄 기계생물학(tendon mechanobiology) 57,58 연구에 유용한 도구이다. 힘줄 충돌의 기계생물학을 이해하기 위한 첫 번째 단계로, 몇몇 선행 연구에서는 세포 또는 절제된 힘줄 외피 27,29,30,31,32,33,34,39에 간단한 단축 압축을 적용한 후 세포 반응을 탐구했습니다. 그러나, 시험관 내 세포에는 균주 전달을 촉진하고, 기계적 변형에 의해 방출되는 중요한 성장 인자와 사이토카인을 격리하며, 기계적 형질도입에 중요한 역할을 하는 국소 접착 복합체를 위한 기질을 제공하는 세포외 및 세포주위 기질이 부족합니다57,59. 또한, in vitro 및 excised explant 연구 모두 in vivo에서 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 기계적 변형 환경을 재현하지 못하며, 이는 충돌 영역 5,6의 해부학적 특징에 의존한다. 충돌된 아킬레스건 삽입의 맥락에서, 여기에는 후종골 윤활낭 및 Kager의 지방 패드60,61,62,63과 같은 주변 조직이 포함됩니다. 반대로, 힘줄 충돌(25,28,36,37,38,64,65,66)의 생체내 모델은 힘줄에 직접 가해지는 하중의 크기 및 빈도에 대한 최소한의 제어를 허용하며, 이는 힘줄 기계생물학을 연구하기 위한 생체내 모델의 잘 알려진 한계이다57,58,67,68,69,70입니다. 생체 내 힘줄 변형률 측정의 어려움을 감안할 때, 이러한 모델 내에서 생성된 내부 변형률 환경은 종종 제대로 특성화되지 않습니다.
이 원고에서는 전체 쥐 뒷다리 외식에서 종골에 대한 아킬레스건 삽입의 충돌을 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼을 제시하며, 이 조직 배양 프로토콜과 짝을 이룰 때 식생 배양에서 7일 동안 생존력을 유지하고 힘줄 충돌의 생물학적 후유증을 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 베이스를 기반으로 제작되어 그립 부착 및 3D 프린팅된 PLA 체적 감소 인서트를 부착할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 그립은 뒷다리의 꼬리 쪽이 위쪽을 향하도록 위쪽 다리와 무릎 근위부를 고정하는 데 사용되며, 초음파 프로브 또는 도립 현미경을 사용하여 위에서 아킬레스건을 이미지화할 수 있습니다(그림 1A). 부피 감소 인서트는 베이스의 트랙을 따라 미끄러지며 필요한 조직 배양 배지의 부피를 줄입니다. 뒷발을 감싼 땋은 선은 기본 디자인과 3D 프린팅된 PLA 클립을 사용하여 플랫폼 밖으로 라우팅됩니다. 줄을 당기면 뒷발이 배굴곡되고 아킬레스건 삽입이 종골에 부딪혀 횡방향 압박 변형률이 상승합니다 5,6 (그림 1A). 플랫폼은 조직 배양 배지에 잠긴 뒷다리 외출부를 유지하는 아크릴 욕조 내에 포함되어 있습니다. 팽팽한 끈을 접착 테이프로 욕조 외부에 고정하면 발목 배굴곡이 유지되어 아킬레스건 삽입의 정적 충돌이 발생합니다. 3D 프린팅 부품용 CAD 파일은 다양한 형식(보충 파일 1)으로 제공되므로 다양한 상용 및 무료 오픈 소스 CAD 소프트웨어로 가져와 실험 요구 사항에 맞게 수정할 수 있습니다. 제작을 위해 3D 프린터에 액세스할 수 없는 경우 저렴한 비용으로 부품을 인쇄하고 배송하는 온라인 3D 프린팅 서비스에 CAD 파일을 제공할 수 있습니다.
중요한 것은 삼두근-아킬레스 근 복합체가 무릎과 발목 관절 모두에 걸쳐 있다는 것입니다 71,72,73. 결과적으로 아킬레스건의 인장 변형은 무릎 굴곡의 영향을 받습니다. 무릎 신전은 아킬레스건에 긴장을 가하는 반면 무릎 굴곡은 긴장을 줄입니다. 먼저 무릎을 펴고 발목을 수동적으로 배측 굴곡함으로써 충돌된 삽입부의 압축 변형이 인장 변형에 중첩될 수 있습니다. 반대로 무릎을 구부린 상태에서 발목을 수동적으로 배측 굴곡하면 인장 변형이 감소하고 압축 변형이 남습니다. 현재 프로토콜은 이러한 세 가지 조건을 탐색합니다. 1) 정적 충돌의 경우 발을 경골에 대해 110° < 배굴곡하여 삽입을 방해하고 무릎을 구부려 긴장을 줄입니다. 2) 베이스라인 장력 그룹의 경우 무릎을 펴고 발목을 배굴곡 145° 이상으로 펴서 삽입 시 주로 인장 변형을 발생시킵니다. 3) 무부하 그룹의 경우, 외식은 외부에서 가해지는 하중이 없는 상태에서 무릎과 발목이 중립 위치에 있는 페트리 접시에서 배양됩니다. 위에서 언급한 각도는 발과 경골이 180° 각도로 평행하고 90° 각도로 수직인 좌표계를 기준으로 사진으로 측정한 것입니다.
프로토콜의 주요 단계에는 1) 뒷다리 외피 절개 및 피부와 족저 힘줄의 신중한 제거가 포함됩니다. 2) 48시간 덱사메타손 전처리 후 이식 배양; 3) 조직 절편 및 조직학적 염색; 4) 섬유연골 형성을 평가하기 위한 컬러 이미지 분석. 절개 후, 각 뒷다리 이식은 덱사메타손74가 보충된 배양 배지에서 48시간 동안 전처리됩니다. 각 마우스의 반대쪽 팔다리는 쌍별 비교를 위해 별도의 실험 그룹에 할당되어 생물학적 변동성을 제어하는 데 도움이 됩니다. 전처리 후, 외식을 위에서 설명한 대로 플랫폼에 배치하고 7일 더 배양합니다(그림 1B). 48시간 전처리 직후 외식재를 제거하는 전처리(0일) 그룹에 대한 추가 비교가 이루어집니다.
이식 배양 후 뒷다리를 다듬고 포르말린을 고정하고 석회질을 제거하고 파라핀에 넣습니다. 시상 방향의 연속 절편은 근건성 접합부에서 종골 삽입까지 아킬레스건을 시각화하는 동시에 전체 힘줄을 통해 절편 깊이를 추적할 수 있습니다. 말단 디옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT) 매개 dUTP X-nick 라벨링(TUNEL)은 세포사멸에 의한 이차적인 DNA 손상을 시각화하고 생존 가능성을 평가하는 데 사용됩니다. 톨루이딘 블루 조직학 및 맞춤형 컬러 이미지 분석을 수행하여 GAG 염색의 변화를 정량화합니다. 그런 다음 톨루이딘 블루 염색 조직 절편을 SHG 이미징에 사용하여 콜라주 섬유 조직의 변화를 특성화합니다(그림 1B).
제공된 대표적인 결과는 GAG가 풍부한 매트릭스의 조직학적 염색 변경과 모델 내에서 7일간의 정적 충돌에 의해 생성된 세포외 콜라겐 네트워크의 무질서를 시사합니다. 이 모델은 충돌 유도 섬유연골 변화의 기저에 있는 분자 메커니즘을 탐구하는 데 활용할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

뼈에 대한 힘줄 충돌은 횡방향 압축 변형률이 현저하게 상승한 다축 기계적 변형 환경을 생성하며, 이는 글리코사미노글리칸(GAG)이 풍부한 매트릭스의 축적과 콜라겐 네트워크의 리모델링을 특징으로 하는 국부적인 섬유연골 표현형을 유도합니다. 섬유연골은 건강한 힘줄의 충돌 부위에서 정상적인 특징이지만, 과도한 GAG 침착과 콜라겐 네트워크의 무질서는 건병증의 특징입니다. 따라서 충돌은 건병증의 시작과 진행에 중요한 외적 요인으로 임상적으로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고 힘줄 충돌의 기저에 있는 기계생물학은 여전히 연구가 부족합니다. 힘줄 충돌에 대한 세포 반응을 밝히기 위한 이전의 노력은 세포에 단축 압축을 적용하고 체외에서 힘줄 외식을 절제했습니다. 그러나 분리된 세포는 기계적 반응에 중요한 3차원 세포외 환경이 부족하며, 시험관 내 및 절제된 외식물 연구 모두 충돌 부위의 해부학적 특징에 따라 생체 내 힘줄 충돌에 의해 생성된 다축 변형 환경을 재현하지 못합니다. 더욱이, 힘줄 충돌의 생체 내 모델은 기계적 변형 환경에 대한 제어가 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구에 적합한 새로운 쥐 뒷다리 이식 모델을 제시합니다. 이 모델은 아킬레스건을 제자리에서 유지하여 국소 해부학적 구조를 보존하고, 수동적으로 적용된 발목 배굴곡 중에 종골에 아킬레스건 삽입이 충돌하여 생성된 다축 변형 환경을 재현하면서 세포를 원래 환경 내에 유지합니다. 이 모델에 필수적인 조직 배양 프로토콜을 설명하고 7일 동안 지속적인 이식 생존 가능성을 설정하는 데이터를 제시합니다. 대표적인 결과는 조직학적 GAG 염색이 향상되고 충돌에 이차적으로 콜라겐 섬유 정렬이 감소했음을 보여주며, 이는 섬유연골 형성 증가를 시사합니다. 이 모델은 다양한 기계적 부하 요법을 조사하는 데 쉽게 적용할 수 있으며 충돌에 대한 반응으로 아킬레스건의 표현형 변화를 중재하는 메커니즘을 식별하기 위해 관심 분자 경로를 조작할 수 있습니다.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

저자 스포트라이트: 힘줄 충돌의 기계생물학 규명 – 다축 쥐 뒷다리 이식 모델 

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

TUNEL 염색 조직 절편의 대표 이미지는 실험군에서 7일간의 식생 배양 후 아킬레스건 체내 최소 세포사멸 핵을 보여줍니다(그림 2A). 이러한 이미지의 정량화는 조직 배양 프로토콜이 로딩 조건에서 7일간의 이식 배양 후 아킬레스건 내에서 평균 최대 78%의 생존율을 유지한다는 증거를 제공합니다(그림 2B).
정성적으로 향상된 톨루이?...

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쥐 뒷다리 이식에서 아킬레스건 삽입의 충돌로 인한 섬유연골 변화를 지속적인 세포 생존력으로 재현하는 맞춤형 실험 플랫폼 및 조직 배양 프로토콜을 제시하여 힘줄 충돌의 역학을 탐구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

우리는 힘줄 충돌의 기저에 있는 기계생물학과 이 독특한 기계적 요구가 건강과 질병에서 국부적인 섬유 연골 형성을 유도하는 과정을 연구합니다. 여기서 우리는 충돌에 의해 생성된 다축 기계적 변형의 공간적으로 이질적인 패턴을 기준으로 모델링하기 위한 매트릭스를 특성화하고 이 반응을 매개하는 분자 메커니즘을 식별하고자 합니다. 충돌 기계생물학을 연구하기 위한 시험관 내 모델은 분리된 힘줄 세포에 단순 압축을 적용하거나 부분 및 전체 힘줄 외피에 인공 단축 압축을 적용했습니다.힘줄 충돌의 동물 모델을 확립하고, 생체 내에서 힘줄 충돌의 외부 원인을 조작하고, 가장 자주 외과적으로 신체 활동을 재개한 후 생물학을 탐구합니다. In vitro 모델은 분리된 세포가 기계적 반응에 중요한 3차원 세포외 환경이 부족하기 때문에 상당한 한계가 있습니다. 절제된 이식 모델은 이러한 한계를 우회하지만, 둘 다 생체 내 충돌에 의해 생성된 다축 변형 패턴을 재현하지 못합니다.반대로, 동물 모델은 내부 조직 균주를 측정하거나 제어하는 능력이 제한적입니다. 충돌 기계생물학을 연구하기 위한 Murine Hind Limb Explant Model은 세포외 환경 내에서 세포를 유지하고 충돌한 아킬레스건 삽입의 국소 해부학을 제자리에서 보존하여 수동적으로 적용된 관절 운동을 통해 충돌의 제어된 처방을 허용하여 측정 가능하고 잘 특성화된 조직 변형의 다축 패턴을 재현할 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

연구

생체공학

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

쥐 뒷다리를 생성하기 위한 외식성 해부 힘줄 충돌을 연구하기 위한 외식 모델

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.